логия хроматина и эпигенетика. В эту группу входили Vince Allfrey, Wolfram Hörz, Robert Simpson, Hal Weintraub, Jonathan Widom, Alan Wolff e и Abe Worcel. Эта книга посвящена памяти всей этой группы. Их пыл и приверженность идее изучения биологии хроматина вдохновили всех, кто следил за их работой, и сейчас их многочисленные
проницательные догадки помогают нам.
Предисловие
С МОМЕНТА ПУБЛИКАЦИИ ПЕРВОГО издания
сборника «Эпигенетика» издательством «Cold Spring
Harbor Laboratory Press» в 2007 году, исследователи
во всем мире, работающие в различных областях,
имеющих отношение к эпигенетике, добились зна-
чительных успехов. Новичкам в этой области мы бы
порекомендовали начать с обзорной главы (глава 3),
чтобы ознакомиться с основными концепциями
и получить общую информацию о направлениях,
которые данная область охватывает. Редакционная
группа обращает внимание на то, что, несмотря
на большое количество перспективной информа-
ции, приведенной в данном сборнике, некоторые
факты заслуживают особого внимания и достойны
комментария в большем объеме, чем это планирова-
лось в 2014 г. для этого издания.
Во-первых, благодаря существенным иннова-
циям в технологиях секвенирования, которые часто
называют «массивно-параллельным» или глубоким
секвенированием (например, RNA-Seq или ChIPSeq
в масштабе генома), представленное в руко-
водствах понятие о том, что поток генетической
информации передается от ДНК к белку посред-
ством информационной РНК, заметно изменилось.
В настоящее время широко распространено мнение
о том, что РНК играет множество самостоятельных
ролей, что большая часть генома транскрибируется,
и по некоторым оценкам достигает >90 %. Интерес-
но, что только ~2 % транскриптов попадают в кате-
горию информационных РНК, при этом высокая
доля (~70 %) отвечает за дивергентно транскриби-
рованные некодирующие (длинные или короткие)
РНК (см. обзор Rinn J. L. в главе 2, а также Darnell,
2011; Guttman and Rinn, 2012). Определение функ-
ции этих некодирующих РНК остается одним из ин-
тенсивных направлений исследований, особенно
в связи с появлением новых моделей, позволяю-
щих предполагать, что эти РНК могут работать для
интегрирования или обеспечения промежуточной
структуры для хроматин-ремоделирующих и хрома-
тин-модифицирующих комплексов ферментов, или
осуществления критических изменений в ядерной
архитектуре посредством cis- или trans-механизмов,
а также для обеспечения возможности рекрутиро-
вать факторы, которые сайленсируют домены хро-
матина (например, Polycomb) или способствуют
транскрипции (например, посредник рекрутиро-
вания энхансерной РНК (eRNA), подробно рас-
смотренный Kim T.-K. с коллегами). Мы также
обращаем внимание на интересные связи между вы-
явленными модификациями гистонов и сплайсин-
гом пре-иРНК (т. е. выявление интрона и экзона),
чтобы подчеркнуть концепцию о том, что мир РНК
расширяется и тесно связан с состояниями хрома-
тина (Huff et al., 2010).
Во-вторых, достигнут заметный прогресс в доку-
ментировании структур хроматин-связывающих
модулей, которые считывают одну или несколько
модификаций гистонов (см. новые главы в этой
книге, написанные Cheng, Patel; Marmorstein and
Zhou; а также Seto and Yoshida). Как можно понять
смысл всей этой запутанной посттрансляционной
модификации? Zhong с коллегами перенесли эпи-
геномику в масштабы всего генома (Xiao et al., 2012)
и представили на рассмотрение то, что они называют
«сравнительной эпигеномикой», в которой рассма-
тривается локализация в клетках человека, мыши
и свиньи впечатляющего набора эпигенетических
меток (модификаций гистонов, геномные распре-
деления метилирования цитозина, варианты гисто-
нов, факторы транскрипции и т. д.), подразумевая
эволюцию как полезный путеводитель для освеще-
ния функциональной значимости различных меток.
Важно отметить, что сравнительная эпигеномика
выявила регуляторные особенности генома, которые
нельзя установить только путем сравнения последо-
вательностей. Помимо более известных совместно
ассоциирующих меток, таких как те, которые ассо-
циированы с бивалентными доменами (например,
H3K4me3 и H3K27me3) на промоторах генов, регу-
лируемых развитием, были идентифицированы
другие высококонсервативные совместные метки.
Например, H3K27ac + H3K4me1/2 и H3K27ac +
+ H3K4me2/3 метят активные элементы энхан-
серов и промоторов соответственно. Авторы этих
результатов приходят к выводу, что общая пробле-
ма «наличия слишком большого количества ком-
бинаций эпигенетических меток и незнания того,
как отличить случайную колокализацию от функ-
циональной, может быть преодолена с помощью
эволюционного консерватизма». Мы аплодируем
результатам этого исследования, поскольку они
предоставляют свежий подход к пониманию слож-
ностей эпигеномов. Мы также ждем с нетерпением
других исследований, которые проводятся на базе
заключений, сделанных с использованием эволю-
ции в качестве гида.
В-третьих, остается фундаментальный вопрос
о том, как наследуются какие-либо эпигенетиче-
ские метки при нашем более полном понимании
того, как метки метилирования цитозина в ДНК
образуются во время репликации. Что касается
гистоновых меток, то появляющиеся публика-
ции предполагают наличие новых механизмов,
которые включают аллостерическую регуляцию
ключевых гистон-модифицирующих комплексов
ферментов, при которой модификации на одном
гистоновом хвосте, например, убиквитинирова-
ние гистона H2B (McGinty et al., 2008) или гисто-
новая метка H3K27me3 (Margueron et al., 2009),
могут стимулировать нижележащую активность
(например, DOT1L [KMT]) или инактивацию
(например, PRC2) гистонметилтрансфераз (KMT)
соответственно. Эти революционные исследо-
вания вместе взятые позволяют предположить,
что новые ковалентные модификации могут быть
введены в наивные матрицы хроматина, т. е. что
существует потенциальный механизм наследо-
вания немодифицированных (в некоторых слу-
чаях — вновь синтезированных гистонов) и новых
модифицированных состояний во время репли-
кации и сборки хроматина, которые могут пере-
даваться будущим поколениям. Мы с нетерпением
ждем будущих исследований в этом направлении,
особенно если они выполняются in vivo (мутанты
гистонов и хроматиновой машинерии; см. Rando,
2012a) и in vitro (использование матриц «дизай-
нерского хроматина»; см. Fierz and Muir, 2012).
Сложности этого «языка» связаны с точным опре-
делением перекрестного взаимодействия между
метками гистонов, осложнененным количеством
и типом ковалентных модификаций в обоих гисто-
новых белках (например, моно- vs ди- vs трилизи-
новое метилирование; ацетилирование лизина
vs кротонилирование; симметричное vs асимме-
тричное диметилированием аргинина) и ДНК
(например, метилирование в сравнении с гидр-
оксиметилированием по остаткам цитозина). Нет
сомнений в том, что расшифровка связей между
модификациями гистонов, метилированием ДНК
и некодирующими РНК дает надежду, что сле-
дующее поколение ученых, которое начнет свою
деятельность в области общей эпигенетики, полу-
чит стимул и приложит необходимые усилия для
исследований.
В-четвертых, варианты гистонов дают клеткам
возможность для специальной разработки путей
сборки хроматина, чтобы создавать различные
его состояния в разных местоположениях генома.
Мы предполагаем, что эволюция вариантов гисто-
нов дала клетке регуляторные возможности, позво-
ляющие ремоделировать матрицу хроматина спосо-
бом, не соответствующим классическому принципу
сопряжения синтеза гистонов с репликацией ДНК
во время S-фазы (т. е. независимым от реплика-
ции депонированием гистонов; см. главу Henikoff
and Smith). Поэтому неудивительно, что вариантам
гистонов, особенно тем типам, которые не зависят
от репликации, будут необходимы специальные
механизмы и энергия для выполнения их задачи
по «привлечению» и «сопровождению» гистонов
на место в геноме. Совсем недавно в замечательной
серии статей, инициатором которой были, в основ-
ном, ученые-медики, использующие секвениро-
вание экзома, были идентифицированы мутации
в «эпигенетических регуляторах» при онкологиче-
ских заболеваниях человека широкого спектра. На-
пример, DAXX, ATRX и вариант H3.3 были связаны
с онкогенезом (панкреатические нейроэндокрин-
ные опухоли, или сокращенно panNET; Jiao et al.,
2011), что дает веские основания предполагать, что
DAXX-опосредованная H3.3-специфическая сборка
хроматина вводит в действие опухоль-супрессорную
функцию ATRX-DAXX, что, вероятно, приводит
к хромосомным аномалиям, включающим дисфунк-
цию теломер. Возможно, самым большим сюрпри-
зом стало открытие того, что мутации, вызываю-
щие рак, существуют в самих гистон-кодирующих
генах (см. обзор: Dawson and Kouzarides, 2012; You
and Jones, 2012; Shen and Laird, 2013). Один из нас
(C.D.A.), как известно, сказал: «Каждая аминокис-
лота в гистонах имеет значение», но это утверждение
трудно проверить на организме, в котором генетика
гистонов нелегко отслеживается. Поскольку онко-
генные мутации в настоящее время картированы
на аминоконцах H3 в двух «горячих точках» — K27
и G34 — в различных группах детей с глиобластомой
(с опухолью ствола и коры головного мозга соответ-
ственно) (см. Liu et al. [глава 2]), мы с нетерпением
ждем информации, которая поможет диагностиро-
вать смертельные детские онкологические заболева-
ния (литературу см. в обзоре Rheinbay et al., 2012).
Мутация H3 в K36, возникающая с высокой часто-
той, тоже сцеплена с другими педиатрическими
видами рака (например, с хондробластомой; Behjati
et al., 2013), что подчеркивает функциональную важ-
ность ковалентных модификаций по лизину в гисто-
нах. Есть примеры и в отношении компонентов эпи-
генетического механизма болезней, не связанных
раком (например, в путиях связанных с неврологи-
ческими функциями и умственной отсталостью; см.
Schaefer et al., 2011; Lotsch et al., 2013). Есть надежда,
что рак и другие болезни (см. главы авторов Baylin
and Jones; Audia and Campbell; Zoghbi and Beaudet;
Qi, Schaefer; Liu et al.) будут поддерживать неосла-
бевающий интерес к эпигенетике и к следующим
соответствующим изданиям.
В-пятых, идея о том, что хроматин-ремодели-
рующие пути могут стать терапевтически полез-
ными мишенями, обеспечивающими реверсию
неправильного сайленсинга или активирования
генов, поскольку сами гены не мутируют, привела
к всеобщему признанию того, что разработка меди-
каментов, направленных на хроматин-зависимые
мишени — это новый перспективный путь лечения
в клинической онкологии. В частности, выявление
измененного метилирования ДНК и активности
ацетилазы гистонов (HAT) в ряде видов рака челове-
ка, а также использование ингибиторов деацетилазы
гистонов (HDAC) и метилирования ДНК в лечении
рака человека убедительно это доказывают, ровно
как и хорошо документированные генетические
повреждения лизин-метилтрансфераз гистонов,
таких как EZH2 (KMT6A), MMSET и др. Учитывая
генетические связи с этими ключевыми фермента-
ми, зависимыми от эпигенетики, были разработаны
и протестированы низкомолекулярные ингибиторы
с положительными терапевтическими результатами.
Некоторые из этих ингибиторов разрешены к при-
менению в США и широко используются в клини-
ческих испытаниях. Очевидно, что регуляторные
сигналы, обеспечиваемые модификациями хро-
матина, произведут революцию в наших взглядах
на рак по мере совершенствования новых моделей
«эпигенетического канцерогенеза» (см. главу Audia
and Campbell).
Каталитические ферменты — это не единствен-
ный класс эпигенетических регуляторов, кото-
рые, как было доказано, являются достойными
лекарственными препаратами. В конце 2010 г. одна
за другой появились две работы (Filippakopoulos
et al., 2010; Nicodeme et al., 2010), в которых была
представлена информация о том, что на гистоновые
ацетиллизин-связывающие карманы или бромо-
домены можно воздействовать малыми молекулами
с полезным клиническим результатом (см. Schaefer
and Qi [в главе 2] и главы, написанные Busslinger and
Tarakhovsky, а также Marmorstein and Zhou). Более
того, была заложена основа для столь же замеча-
тельного исследования, в котором был проведен
крупномасштабный структурный анализ семей-
ства бромодоменов человека, который дал суще-
ственную информацию о молекулярной дискри-
минации, с помощью которой различные модули
считывания гистонового ацетиллизина распознают
разное окружение хроматина (Filippakopoulos et al.,
2012). Мы рассчитываем, что такие исследования
будут расширены на другие хроматин-считывающие
«карманы» со свойственной им специфичностью,
суля хорошие перспективы появления новых рубе-
жей для изыскания новых лекарственных средств
(Arrowsmith et al., 2012). И последнее в отношении
потенциальных терапевтических мишеней: мы под-
черкиваем, что гистоны — это не единственные фи-
зиологически соответствующие реципиенты этого
ковалентного «языка». В настоящее время хорошо
известно, что большие группы негистоновых белков
модифицируются посредством элементов, которые
первоначально были охарактеризованы как гистон-
модифицирующие ферменты (например, ацети-
лирование и метилирование p53 посредством p300
(KAT3B) и Set7/9 (KMT7) соответственно, о чем
первоначально сообщали Gu and Roeder (1997),
а также Chuikov с коллегами (2004). «Мимикрия»
под гистоны хорошо показана Tarakhovsky с колле-
гами (Sampath et al., 2007; Marazzi et al., 2012) с пред-
положением, что эти механизмы распространяют
свое влияние далеко за пределы гистоновых белков
(Sims and Reinberg, 2008).
В конечном счете, корни эпигенетики уходят
в проблемы биологии развития, сформулированные
Waddington с коллегами (см. главу Felsenfeld). Упа-
ковка хроматина эволюционировала так, что опре-
деленные гены в ней могут быть менее или более
доступными для транскрипционных и других фак-
торов, которые должны вовлекать истинную генети-
ческую матрицу (см. заключительную главу Pirrotta).
Хотя может быть и нет сомнений в том, что мы всту-
паем в «постгеномную» или «эпигеномную» эру, мы
признаем что в основе репрограммирования диффе-
ренцированных клеток из более плюрипотентных
эмбриональных, вероятно, лежат транскрипцион-
ные сети. Лучше всего это иллюстрируется полу-
чением индуцированных плюрипотентных стволо-
вых клеток (iPSC) в работе Yamanaka с коллегами
(2006), в которой факторы транскрипции основ-
ных генов плюрипотентности (например, Oct-3/4,
Sox2, c-Myc и Klf4) вводили в неплюрипотентные
клетки — фибробласты взрослых мышей; было
показано, что таким образом можно репрограмми-
ровать (или дедифференцировать) клетки обратно
в более плюрипотентное или тотипотентное состоя-
ния (Takahashi and Yamanaka, 2006). Эти новатор-
ские исследования основываются на первых работах
Gurdon с коллегами, которые давно продемонстри-
ровали, что соматические зрелые ядра могут быть
репрограммированы, если они пересажены в яйце-
клетку (ооцит) (Gurdon et al., 1958). Хотя значимость
«основных регуляторов» транскрипции не может
ставиться под сомнение, низкая эффективность
репрограммирования, стабильность индуцирован-
ных состояний и тенденция репрограммированных
клеток к изменению в сторону неопластического
состояния позволяют предполагать, что поддержку
хроматина или «барьеры» для процесса репрограм-
мирования еще предстоит полностью понять (Soufi
et al., 2012; Chen et al., 2013). Редакторам приятно,
что открытие индуцированной плюрипотентности
в этом руководстве описано Takahashi (глава 2),
а теме «репрограммирования» в целом посвящена
глава, написанная Hochedlinger and Jaenisch. Кроме
того, к направлениям, в которых эпигенетика тесно
переплетается с вопросами биологии развития, име-
ют отношение главы, написанные Grossniklaus and
Paro; Kingston and Tamkun; а также Reik and Surani.
В заключение нужно отметить, что в этом пре-
дисловии освещены лишь несколько перспектив-
ных областей, появившихся после публикации
первого издания. В нашем обзоре и в следующих
главах мы не только продолжим раскрывать эти
области, но и затронем многие другие. Кроме того,
в это издание включены короткие обзоры моло-
дых ученых, сделавших важные открытия, кото-
рые задали новые и перспективные направления
в области эпигенетики. Их очерки касаются исто-
рия того, как были сделаны эти открытия. Даже
беглое сравнение первого и второго изданий этой
книги показывает существенный прогресс, до-
стигнутый в области эпигенетики в период между
двумя изданиями. Добавлены двенадцать новых
глав и значительно обновлены все главы, ранее
опубликованные. Например, рис. 3.3 в главе 3 (как
и в первом издании) показывает, что эпигенетиче-
ские изменения в сравнении с истинной генетикой
могут быть нестабильными или частью истинного
наследования генеративной линии. Однако дав-
няя дискуссия по сравнению различий между
врожденными и приобретенными характеристи-
ками (теория Ламарка) пересматривается заново
в свете новых исследований, показывающих, что
факторы окружающей среды могут обеспечивать
адаптивные ответы посредством некодирующих
РНК в соматических и генеративных клеточных
линиях (Ashe et al., 2012; Lee et al., 2012; Rando,
2012b). Совершенно ясно, что новые открытия,
движимые, возможно, читателями этого издания,
образуют базу материалов для других изданий,
которые выведут нас за рамки нашего нынешнего
понимания. Биологи развития из прошлого взира-
ют на нас, должно быть, с большим удовольствием.
Цель этого сборника, как и первого, — по-
высить осведомленность новичков и опытных
исследователей по ключевым концепциям, кото-
рые формируют широкую область эпигенетики
и направляют ее развитие. Некоторые изречения
подчеркивают общую проблему, к которой адресо-
вано наше научное пособие: «Мы — нечто большее,
чем сумма наших генов» (Klar, 1998); «Вы можете
унаследовать что-то помимо последовательности
ДНК. Вот что сейчас по-настоящему волнует»
(Watson, 2003); или заголовок на обложке журнала
«Time» (2010): «Почему ваша ДНК — это не ваша
судьба» (Cloud, 2010). Не похоже, что развитие эпи-
генетики замедляется; более того, показатель ее
цитируемости в литературе продолжает расти.
Мы надеемся, что читатели этого научного посо-
бия разделят наш энтузиазм и в то же время вдох-
новятся на попытку решения многих проблем,
которые остаются неразгаданными или не до
конца изученными. Мы благодарны всем, кто внес
вклад в то, что это давно ожидаемое издание стало
реальностью.
ЛИТЕРАТУРА
Arrowsmith C. H., Bountra C., Fish P. V., Lee K., SchapiraM.
2012. Epigenetic protein families: A new frontier for drug discovery.
Nat. Rev. Drug. Discov. 11: 384–400.
Ashe A., Sapetschnig A., Weick E. M., Mitchell J., Bagij n M. P.,
Cording A. C., Doebley A. L., Goldstein L. D., Lehrbach
N. J., Le Pen J. et al. 2012. piRNAs can trigger a multigenerational
epigenetic memory in the germline of C. elegans.
Cell 150: 88–99.
Behjati S., Tarpey P. S., Presneau N., Scheipl S., Pillay N., Van
Loo P., Wedge D. C., Cooke S. L., Gundem G., Davies H.
et al. 2013. Distinct H3F3A and H3F3B driver mutations
defi ne chondroblastoma and giant cell tumor of bone. Nat.
Genet. 45: 1479–1482.
Chen J., Liu H., Liu J., Qi J., Wei B., Yang J., Liang H.,
Chen Y., Chen J., Wu Y. et al. 2013. H3K9 methylation is
a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat.
Genet. 45: 34–42.
Chuikov S., Kurash J. K., Wilson J. R., Xiao B., Justin N.,
Ivanov G. S., McKinney K., Tempst P., Prives C., Gamblin
S. J. et al. 2004. Regulation of p53 activity through lysine
methylation. Nature 432: 353–360.
Cloud J. 2010. Why genes aren’t destiny. Time 175: 48–53.
Darnell J. E. 2011. RNA: Life’s indispensable molecule. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Dawson M. A., Kouzarides T. 2012. Cancer epigenetics: From
mechanism to therapy. Cell 150: 12–27.
Fierz B., Muir T. W. 2012. Chromatin as an expansive canvas for
chemical biology. Nat. Chem. Biol. 8: 417–427.
Filippakopoulos P., Qi J., Picaud S., Shen Y., Smith W. B., Fedorov
O., Morse E. M., Keates T., Hickman T. T., Felletar I.
et al. 2010. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature
468: 1067–1073.
Filippakopoulos P., Picaud S., Mangos M., Keates T., Lambert
J. P., Barsyte-Lovejoy D., Felletar I., Volkmer R., Muller
S., Pawson T. et al. 2012. Histone recognition and largescale
structural analysis of the human bromodomain family.
Cell 149: 214–231.
Gu W., Roeder R. G. 1997. Activation of p53 sequence-specifi c
DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain.
Cell 90: 595–606.
Gurdon J. B., Elsdale T. R., Fischberg M. 1958. Sexually mature
individuals of Xenopus laevis from the transplantation
of single somatic nuclei. Nature 182: 64–65.
Guttman M., Rinn J. L. 2012. Modular regulatory principles
of large noncoding RNAs. Nature 482: 339–346.
Huff J. T., Plocik A. M., Guthrie C., Yamamoto K. R. 2010.
Reciprocal intronic and exonic histone modifi cation regions
in humans. Nat. Struct. Mol. Biol. 17: 1495–1499.
Jiao Y., Shi C., Edil B. H., deWilde R. F., Klimstra D. S.,
Maitra A., Schulick R. D., Tang L. H., Wolfgang C. L.,
Choti M. A. et al. 2011. DAXX/ATRX, MEN1, and mTOR
pathway genes are frequently altered in pancreatic neuroendocrine
tumors. Science 331: 1199–1203.
Klar A. J. 1998. Propagating epigenetic states through meiosis:
Where Mendel’s gene is more than a DNA moiety. Trends
Genet. 14: 299–301.
Lee H. C., Gu W., Shirayama M., Youngman E., Conte D. Jr,
Mello C. C. 2012. C. elegans piRNAs mediate the genome-
wide surveillance of germline transcripts. Cell 150:
78–87.
Lotsch J., Schneider G., Reker D., Parnham M. J., Schneider
P., Geisslinger G., Doehring A. 2013. Common nonepigenetic
drugs as epigenetic modulators. Trends Mol.
Med. 19: 742–753.
Marazzi I., Ho J. S., Kim J., Manicassamy B., Dewell S., Albrecht
R. A., Seibert C. W., Schaefer U., Jeff rey K. L., Prinjha
R. K. et al. 2012. Suppression of the antiviral response
by an infl uenza histone mimic. Nature 483: 428–433.
Margueron R., Justin N., Ohno K., Sharpe M. L., Son J.,
Drury W. J. 3rd, Voigt P., Martin S. R., Taylor W. R.,
De Marco V. et al. 2009. Role of the Polycomb protein EED
in the propagation of repressive histone marks. Nature 461:
762–767.
McGinty R. K., Kim J., Chatterjee C., Roeder R. G.,
Muir T. W. 2008. Chemically ubiquitylated histone H2B
stimulates hDot1 L-mediated intranucleosomal methylation.
Nature 453: 812–816.
Nicodeme E., Jeff rey K. L., Schaefer U., Beinke S., Dewell S.,
Chung C. W., Chandwani R., Marazzi I., Wilson P.,
Coste H. et al. 2010. Suppression of infl ammation bya synthetic
histone mimic. Nature 468: 1119–1123.
Rando O. J. 2012a. Combinatorial complexity in chromatin
structure and function: Revisiting the histone code. Curr.
Opin. Genet. Dev. 22: 148–155.
Rando O. J. 2012b. Daddy issues: Paternal eff ects on phenotype.
Cell 151: 702–708.
Rheinbay E., Louis D. N., Bernstein B. E., Suva M. L. 2012.
A tell-tail sign of chromatin: Histone mutations drive pediatric
glioblastoma. Cancer Cell 21: 329–331.
Sampath S. C., Marazzi I., Yap K. L., Sampath S. C., Krutchinsky
A. N., Mecklenbrauker I., Viale A., Rudensky E.,
Zhou M. M., Chait B. T. et al. 2007.Methylation of a histone
mimic within the histone methyltransferase G9a regulates
protein complex assembly. Mol. Cell 27: 596–608.
Schaefer A., Tarakhovsky A., Greengard P. 2011. Epigenetic
mechanisms of mental retardation. Prog. Drug. Res. 67:
125–146.
Shen H., Laird P. W. 2013. Interplay between the cancer genome
and epigenome. Cell 153: 38–55.
Sims R. J. III, Reinberg D. 2008. Is there a code embedded in
proteins that is based on post-translational modifi cations?
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 815–820.
Soufi A., Donahue G., Zaret K. S. 2012. Facilitators and impediments
of the pluripotency reprogramming factors’ initial
engagement with the genome. Cell 151: 994–1004.
Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem
cells from mouse embryonic and adult fi broblast cultures by
defi ned factors. Cell 126: 663–676.
Watson J. D. 2003. Celebrating the genetic jubilee: A conversation
with James D. Watson. Interviewed by John Rennie. Sci.
Am. 288: 66–69.
Xiao S., Xie D., Cao X., Yu P., Xing X., Chen C. C., Musselman
M., Xie M., West F. D., Lewin H. A. et al. 2012.
Comparative epigenomic annotation of regulatory DNA. Cell
149: 1381–1392.
You J. S., Jones P. A. 2012. Cancer genetics and epigenetics: Two
sides of the same coin? Cancer Cell 22: 9–20.
Благодарности
КАК ЭТО, ВЕРОЯТНО, ПРОИСХОДИТ С КАЖ-
ДЫМ КРУПНЫМ предприятием по выпуску науч-
ного пособия, кажется, что проект вырастает из сво-
их исходных рамок по многим причинам, по которым
книга когда-либо выходит в свет. Это в самой полной
мере относится к выпуску второго издания научного
пособия «Эпигенетика». Границы были расширены:
увеличилось количество глав, а также объем нашей
главы, содержащей обзор и описание концепций.
Почему? Здесь мы можем только предположить, что
это частично связано с захватывающей наукой, ко-
торая представляет собой совместное поле деятель-
ности, связанной с эпигенетикой.
Мы очень благодарны всем авторам, чьи работы
вошли в это второе издание, — некоторым из пер-
вого издания этой книги, а также многим новень-
ким. Особую благодарность нужно выразить моло-
дым ученым, которые приостановили свои работы,
чтобы в статьях, представленных во второй главе,
поделиться с нами некоторой информацией из пер-
вых рук о том, что лежало в основе захватывающих
открытий, сделанных ими и их коллегами, которые
помогают делать эту область науки такой, какая она
есть сейчас. Именно старание и внимательность
всех этих авторов составляют сущность этой книги;
их знания и опыт делают это научное пособие тем,
чем мы и задумывали — самым свежим подробным
научным пособием по перспективному направ-
лению эпигенетики. По каждой главе и статье мы
консультировались с приглашенными экспертами,
которые высказали свое мнение в своих конструк-
тивных комментариях, позволив сделать статьи
максимально точными и современными. Мы благо-
дарим их всех.
Как и в случае с первым изданием, мы благодар-
ны John Inglis за его инициативу и поддержку при
подготовке второго издания, а также всем сотруд-
никам издательства «Cold Spring Harbor Laboratory
Press» (Inez Sialiano, Kathy Bubbeo, Richard Sever, Jan
Argentine и Denise Weiss), которые были главными
действующими лицами в этом начинании. Что каса-
ется второго издания, редакторы должны выразить
им особую благодарность, поскольку мы испыты-
вали их предел прочности бесконечными задерж-
ками и настойчивыми просьбами, вызывающими
отставание от графика. Мы также ценим, что изда-
тельство «Cold Spring Harbor Laboratory Press» обес-
печит доступ ко всем главам научного пособия в ре-
жиме онлайн на сайте «CSH Perspectives in Biology»,
чтобы на каждую работу можно было сослаться как
на оригинальную статью. Все помощники редактора
(Marisa Cerio (C.D.A.), Marcela Mare (T.J.) и Michele
Giunta (D.R.)) также проявили исключительное
терпение, изо всех сил стараясь организовать бес-
численные звонки, встречи и составлять расписа-
ния, чтобы все это произошло.
Особую благодарность необходимо направить
двум людям, которые, как и все, кто был вовлечен
в работу над вторым изданием, досконально знают
содержание каждой страницы, каждое предложение
и слово в этом научном пособии. Короче говоря,
Marie-Laure Caparros и Monika Lachner превратили
это научное пособие в реальность. От оценки текста
до напряженной обстановки, от составления ссылок
до метания молний, от проверки цифр до разочаро-
вания, от подготовки приложений до беспокойства
— они прошли через это все. Откуда берется их тер-
пение? Никто не знает, но мы трое предполагаем,
что они обе обладают какая-то формой в значитель-
ной степени своеобразной генетики и эпигенетики.
Не передать словами, насколько мы благодарны
за вашу потрясающую работу, старание и внима-
тельность к мелким деталям, которые превращают
хорошее научное пособие в превосходное, как мы
надеемся.
Наконец, мы трое признаем свою ответствен-
ность за любые ошибки или оплошности в этом на-
учном пособии. Многие задаются вопросом, — в чем
причина того, это второе издание так долго не пуб-
ликовалось? В какой черной дыре исчезли эти сро-
ки? Причинами этих задержек была, вероятно, мед-
лительность с нашей стороны. Пожалуйста, примите
наши извинения. Все же мы получили удовольствие
при решении задачи попытаться представить мно-
жество достижений в области эпигенетики в такой
форме, которая привлечет читателей этого научного
пособия и они присоединятся к нам с подлинным
воодушевлением, которое должно у них появиться.
Финансовая поддержка при издании этой книги
была оказана издательством «Cold Spring Harbor
Laboratory Press» (г. Нью-Йорк). Рокфеллеровский
университет (г. Нью-Йорк), медицинская школа
Нью-Йоркского университета (г. Нью-Йорк) и ин-
ститут иммунобиологии и эпигенетики Макса План-
ка (г. Фрайбург, Германия) предоставили дополни-
тельные средства на обработку текста этой книги.
C. David Allis, Рокфеллеровский
университет, г. Нью-Йорк
Thomas Jenuwein, институт иммунобиологии
и эпигенетики Макса Планка, г. Фрайбург
Danny Reinberg, медицинская школа
Нью-Йоркского университета,
исследовательский центр «Смайлоу»
15 сентября 2014 г.
Г Л А В А 1
Краткая история эпигенетики
Gary Felsenfeld
National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney,
National Institute of Heath, Bethesda, Maryland 20892-0540
e-mail: garyf@intra.niddk.nih.gov
РЕЗЮМЕ
Термин «эпигенетика» первоначально использовался для обозначения слабоизученных процессов, в ходе которых
оплодотворенная зигота развивается в зрелый сложный организм. По мере понимания того, что все клетки орга-
низма несут одну и ту же ДНК, и с расширением знаний о механизмах экспрессии генов определение было изме-
нено, чтобы указать на способы, посредством которых наследуемые признаки могут быть связаны не с изменениями
нуклеотидной последовательности, а с химическими модификациями ДНК или связанных с ней структурных и регу-
ляторных белков. Недавнее открытие роли этих механизмов в раннем развитии может сделать желательным возврат
к исходному определению эпигенетики.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение, 13
2. Ключи от генетики и биологии развития, 13
3. Во всех соматических клетках организма ДНК
одинакова, 15
4. Роль метилирования ДНК, 15
5. Роль хроматина, 16
6. Все механизмы взаимосвязаны, 19
Литература, 20
1. ВВЕДЕНИЕ
История эпигенетики связана с исследованиями
эволюции и развития. Но за последние 50 лет зна-
чение самого термина «эпигенетика» претерпело
эволюцию, сопоставимую с резко возросшим объе-
мом знаний о молекулярных механизмах, лежащих
в основе регуляции экспрессии генов у эукариот.
Современные определения эпигенетики отра-
жают наше понимание того, что, хотя набор ДНК,
по существу, одинаков во всех соматических клет-
ках организма, паттерны экспрессии генов сильно
различаются у клеток разных типов и эти паттерны
могут быть клонально унаследованы. Это привело
к формированию рабочего определения, которое
выглядит следующим образом: «Эпигенетика — это
сфера исследований митотически и (или) мейоти-
чески наследуемых изменений в генной функции,
которые нельзя объяснить изменениями в нуклео-
тидной последовательности ДНК» (Riggs et al., 1996;
Riggs and Porter, 1996). Совсем недавно к этому
определению было добавлено ограничение, соглас-
но которому инициация нового эпигенетического
состояния должна включать в себя временной меха-
низм, отличный от того, который требуется для его
поддержания (Berger et al., 2009). Однако до 1950-х
годов слово «эпигенетика» использовали в более
широком смысле (и менее точно) — для обозначе-
ния всех событий развития, ведущих от оплодотво-
рения зиготы к формированию зрелого организма,
то есть всех регуляторных процессов, которые, на-
чиная с генетического материала, формируют ко-
нечный продукт (Waddington, 1953). Эта концепция
берет свое начало в гораздо более ранних исследова-
ниях в области клеточной биологии и эмбриологии
начиная с конца XIX столетия, которые заложили
фундамент нашего сегодняшнего понимания взаи-
моотношений между генами и развитием. Долгое
время среди эмбриологов шли горячие споры о при-
роде и локализации компонентов, ответственных
за реализацию плана развития организма. В своих
попытках осмыслить большое число остроумных,
но в конечном счете противоречивых эксперимен-
тов по манипулированию клетками и зародышами
эмбриологи разделились на две школы: на тех, кто
думал, что каждая клетка содержит преформиро-
ванные элементы, которые в ходе развития лишь
увеличиваются в размерах (преформизм), и тех, кто
полагал, что этот процесс включает в себя химиче-
ские реакции между растворенными компонентами,
которые и реализуют сложный план развития (эпи-
генез). Эти школы сфокусировались на рассмотре-
нии относительного значения ядра и цитоплазмы
для процессов развития организма. Хотя определе-
ние, которое мы выбрали для эпигенетики, измени-
лось, чтобы отразить наши увеличившиеся знания,
важно помнить, что первоначальная проблема за-
ключалась в следующем: как одна оплодотворенная
яйцеклетка может дать начало сложному организму
с клетками различных фенотипов?
Вслед за открытием существования хромосом,
сделанным Флемингом в 1879 году, опыты, про-
веденные многими исследователями, в том числе
Вильсоном и Бовери, дали надежное доказательство
того, что программа развития находится в хромосо-
мах. В конечном счете Томас Гент Морган (Morgan,
1911) привел наиболее убедительные доказатель-
ства этой идеи, продемонстрировав генетическое
сцепление нескольких генов Drosophila с Х-хромо-
сомой. Начиная с этого момента был достигнут
быстрый прогресс в создании линейных карт хромо-
сом, в которых отдельные гены были локализованы
в специфических участках на хромосомах Drosophila
(Sturtevant, 1913). Конечно, оставались без ответа
классические вопросы «эпигенеза»: какие молекулы
внутри хромосом несут генетическую информацию,
каким образом они направляют программу развития
и как эта информация передается при клеточном
делении. Было известно, что в хромосомах присут-
ствуют и нуклеиновая кислота, и белки, но их отно-
сительный вклад не был очевиден; конечно, никто
не верил, что нуклеиновая кислота одна может нес-
ти всю информацию о развитии. Более того, оста-
вались более старые вопросы о возможном вкладе
цитоплазмы в процессы развития. Данные по гене-
тике Drosophila (см. раздел 2) заставляли считать, что
наследуемые изменения в фенотипе могут проис-
ходить без соответствующих изменений в «генах».
Характер этих дискуссий резко изменился, когда
ДНК была идентифицирована как основной носи-
тель генетической информации. В конечном счете
оказалось полезным переосмыслить определение
эпигенетики таким образом, чтобы различать те
наследуемые изменения, которые возникают в ре-
зультате изменений в нуклеотидной последователь-
ности ДНК, и те, которые с ними не связаны. Более
детальное понимание основных механизмов сопро-
вождалось дальнейшим уточнением определения
эпигенетики, но на данном этапе может оказаться
бесполезной попытка достичь предельной точности
в описании очень сложных регуляторных процес-
сов, в которых переплетаются «эпигенетические»
и «неэпигенетические» компоненты.
2. КЛЮЧИ ОТ ГЕНЕТИКИ И БИОЛОГИИ
РАЗВИТИЯ
Что бы ни происходило с этим определением, с на-
чала ХХ столетия неуклонно накапливались идеи
и научные данные, лежащие в основе современ-
ного понятия «эпигенетика». В 1930 году Герман
Мёллер (Muller, 1930) описал у Drosophila класс
мутаций, которые он назвал eversporting displacements
(eversporting в данном случае обозначает высокую
частоту фенотипического изменения). Эти мутанты
были связаны с хромосомными транслокациями
(displacements), но «даже тогда, когда все части хро-
матина, по всей видимости, были представлены
в нормальной дозе (хотя и были ненормально распо-
ложены относительно друг друга), фенотипический
результат не всегда был нормальным». В некоторых
из этих случаев Мёллер наблюдал мух, у которых
были пятнистые глаза. Он думал, что это, вероятно,
связано с «генетическим разнообразием различных
клеток, формирующих глаз», но дальнейший гене-
тический анализ привел его к тому, чтобы связать
необычные свойства с хромосомной перестройкой;
он сделал вывод, что «с этим как-то связаны, скорее,
хромосомные участки, влияющие одновременно
на различные признаки, чем отдельные гены или
гипотетические “генные элементы”». На протяже-
нии последующих 10–20 лет убедительные данные,
полученные во многих лабораториях (Hannah, 1951),
подтвердили, что эта пятнистость, мозаичность воз-
никает тогда, когда перестройки ставят рядом ген
белых глаз и гетерохроматиновые районы.
В течение этого периода хромосомные перестрой-
ки всех типов были объектом огромного внимания.
Было очевидно, что гены не являются полностью
независимыми объектами: на их функциониро-
вание может влиять их локализация в геноме, как
было многократно показано на многих мутантах
Drosophila, которые приводили к мозаичности, а так-
же на других мутантах, связанных с транслокациями
в эухроматиновые районы, у которых можно было
наблюдать эффекты положения более общего типа
(не мозаичного). Стала также ясной — главным об-
разом благодаря работам МакКлинток (McClintock,
1965) — роль перемещаемых элементов в генетике
растений, хотя они, вероятно, не участвуют в нор-
мальном развитии.
Вторая линия доказательств берет свое начало
в исследованиях процессов развития. Было оче-
видно, что во время развития имеет место диверген-
ция фенотипов среди дифференцирующихся клеток
и тканей, и оказалось, что такие различные особен-
ности фенотипа, однажды установившись, могут
клонально наследоваться делящимися клетками.
Хотя на этом этапе стало понятно, что существует
программирование, специфичное для определен-
ного типа клеток, и что оно может быть передано
дочерним клеткам, однако, каким образом это про-
исходит, было не совсем понятно.
Был предложен и рассмотрен целый ряд меха-
низмов. В частности, исследователями-биохими-
ками клетка характеризовалась многочисленными
взаимозависимыми биохимическими реакциями,
которые поддерживают ее идентичность. Например,
в 1949 году Макс Дельбрюк (Delbruck, цит. в Jablonka
and Lamb, 1995) предположил, что простая пара био-
химических цепей реакций, каждая из которых про-
дуцирует в качестве промежуточного вещества ин-
гибитор другого пути, могла бы в результате давать
систему, способную переключаться между двумя
устойчивыми состояниями. Несколько позже были
обнаружены реальные примеры таких систем —
в Lac-опероне Escherichia coli (Novick and Weiner,
1957) и в переключении фага между лизогенным
и литическим состояниями (Ptashne, 1992). Функ-
ционально эквивалентные модели можно предполо-
жить и для эукариот. Виды самостабилизирующихся
ингибиторных и стимулирующих механизмов, на-
блюдаемых у лямбда-фага, на самом деле в гораздо
более сложной форме встречаются и у высших орга-
низмов. У эмбриона морского ежа, например, раз-
витие происходит через создание и развитие ряда са-
мостабилизирующихся регуляторных сетей. Однако
важно осознавать существенное различие между
прокариотической и эукариотической системами:
в случае морского ежа каждый из регуляторных
«модулей» не находится в статическом состоянии,
а скорее принимает от других модулей и отправляет
им сигналы, которые дают начало изменяющему-
ся, зависящему от времени фенотипу, связанному
с развивающимся эмбрионом. Следует также отме-
тить, что, хотя структура и биохимия хроматина,
безусловно, должны быть вовлечены в реализацию
этой программы (см. раздел 5), система может быть
полностью смоделирована с точки зрения контроля
экспрессии генов путем специфического связыва-
ния факторов транскрипции с регуляторными обла-
стями соответствующих генов.
Предметом живого интереса и дискуссий был,
конечно, сравнительный вклад ядра и цитоплаз-
мы в передачу дифференцированного состояния
в развивающемся эмбрионе; самостабилизирую-
щаяся цепь биохимических реакций предпо-
ложительно должна была поддерживаться сквозь
череду клеточных делений. Второй тип эпигене-
тической передачи был четко продемонстриро-
ван на примере Paramecium и других инфузорий,
у которых картина расположения ресничек могла
варьироваться у отдельных особей и наследоваться
клонально (Beisson and Sonneborn, 1965). Резуль-
татом изменения этого кортикального паттерна
с помощью микрохирургии была передача нового
паттерна последующим поколениям. Было выска-
зано предположение, что сходные механизмы ра-
ботают и у многоклеточных организмов, у которых
локальные цитоплазматические детерминанты
влияют на организацию клеточных компонен-
тов таким образом, что эта организация может
передаваться при клеточном делении (Grimes and
Aufderheide, 1991).
3. ВО ВСЕХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ
ОРГАНИЗМА ДНК ОДИНАКОВА
Хотя морфология хромосом показывала, что все
соматические клетки обладают полным набором
хромосом, было далеко не очевидно, что все сома-
тические клетки сохраняют полный набор ДНК,
присутствующий в оплодотворенном яйце. До появ-
ления работ Эйвери, Маклауда и Маккарти (Avery
et al., 1944), а также Херши и Чейза (Hershey and
Chase, 1952) не было даже известно, что молекула
ДНК, не содержащая белков, может нести гене-
тическую информацию — вывод, подкрепленный
исследованиями Уотсона и Крика, которые опре-
делили структуру ДНК в 1953 г. Работы Бриггса
и Кинга (Briggs and King, 1952), изучавших Rana
pipiens, и Ласки и Гердона (Laskey and Gurdon,
1970), занимавшихся исследованием на Xenopus, по-
казали, что результатом введения в денуклеирован-
ные ооциты ядер, взятых из ранних эмбриональных
клеток, может быть развитие эмбриона. Но даже
в 1970 году Ласки и Гердон отмечали: «Предстоит
еще доказать, что соматические клетки взрослого
животного имеют гены помимо тех, которые необ-
ходимы для их собственного роста и дифференци-
ровки». В статье, содержавшей это утверждение,
они продемонстрировали, что в первом прибли-
жении ДНК ядра соматической клетки, введенная
в денуклеированную, была способна направлять
последнюю по пути эмбриогенеза. Было ясно, что
программа развития и специализация всего спектра
экспрессии, наблюдаемая в соматических клетках,
должны задействовать сигналы, которые не явля-
ются результатом какой-то делеции или мутации
в нуклеотидной последовательности ДНК зароды-
шевого пути, когда эта ДНК передается соматиче-
ским клеткам. В то же время другие эксперименты
выявили, что эти сигналы могут обеспечивать фено-
типическую стабильность на протяжении многих
поколений клеточных делений. Даже после того
как недифференцированные клетки имагинального
диска Drosophila были трансплантированы и культи-
вированы последовательным поколениям взрослых
мух, они сохраняли свой специфичный для диска
паттерн дифференцировки при переносе личинкам
(Hadorn, 1965; McClure and Schubiger, 2007).
Конечно, существуют способы, посредством
которых ДНК соматических клеток может стать
отличающейся от ДНК клеток зародышевого пути
с соответствующими последствиями для фенотипа
клетки: например, как показали работы Барбары
МакКлинток и других специалистов по генетике
растений, мобильные элементы могут изменять
картину экспрессии в соматических клетках. Ана-
логичным образом генерация разнообразия антител
связана с перестройками ДНК в череде поколений
линии соматических клеток. Эта перестройка (или,
точнее, ее последствия) может рассматриваться как
своего рода эпигенетическое событие, сопостави-
мое с ранними наблюдениями эффекта положения
мозаичного типа, описанного Меллером (1930).
Однако значительная часть работ по эпигенетике
в последние годы была сосредоточена на системах,
в которых не происходило никаких перестроек
ДНК, и, следовательно, акцент делался на модифи-
кациях оснований и на белках, образующих ком-
плексы с ДНК в ядре.
4. РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК
Инактивация Х-хромосомы у мышей явилась одной
из первых моделей эпигенетического механизма это-
го рода, не связанного с перестройками в ДНК (Ohno
et al., 1959; Lyon, 1961). Молчащая Х-хромосома явно
выбиралась случайным образом, а затем клонально
наследовалась в соматических клетках, и не было
никаких данных об изменениях в самой нуклеотид-
ной последовательности ДНК. Отчасти для объ-
яснения этого типа инактивации Риггс (Riggs, 1975)
и Холлидей и Пью (Holliday and Pugh, 1975) предпо-
ложили, что в качестве эпигенетической метки мог-
ло бы выступать метилирование ДНК. Ключевыми
моментами этой модели были представления о том,
что сайты метилирования являются палиндромными
и что за метилирование немодифицированной ДНК
и ДНК, уже метилированной по одной нити, отвеча-
ют разные ферменты. Они постулировали, что пер-
вое событие метилирования происходит значительно
труднее, чем второе; однако, коль скоро первая нить
модифицирована, комплементарная нить будет бы-
стро модифицирована в том же палиндромном сайте.
Метильная метка, присутствующая на родительской
нити ДНК, после репликации могла бы копировать-
ся на дочернюю нить, и в результате происходила бы
надежная передача метилированного состояния сле-
дующему поколению. Вскоре после этого Берд вос-
пользовался тем, что главной мишенью метилирова-
ния у животных является последовательность CpG
(Doskocil and Sorm, 1962), для того чтобы предложить
использовать чувствительные к метилированию фер-
менты рестрикции как способ выявления метили-
рованного состояния. Последующие исследования
(Bird and Southern, 1978; Bird, 1978) показали затем,
что эндогенные сайты CpG были либо полностью
неметилированы, либо полностью метилированы.
Предсказания, сделанные на основе этой модели,
были, таким образом, подтверждены; тем самым
был установлен механизм эпигенетической передачи
метильной метки посредством полуконсервативного
воспроизведения паттерна метилирования.
В годы, последовавшие за этими открытиями,
огромное внимание было уделено эндогенным
паттернам метилирования ДНК, возможной пере-
даче этих паттернов через зародышевый путь, роли
метилирования ДНК в сайленсинге генной экс-
прессии, возможным механизмам инициации или
ингибирования метилирования в полностью неме-
тилированном сайте и идентификации фермен-
тов, ответственных за метилирование de novo и за
поддержание метилирования на уже метилирован-
ных сайтах. Также возник большой интерес к воз-
можным механизмам удаления метильной группы
из метилированных остатков цитозина (или самого
5mC), что происходит на ранних стадиях развития
и в зародышевой линии. Очевидно, степень, до ко-
торой метилирование ДНК может становиться эпи-
генетической меткой, сохраняющейся через заро-
дышевую линию, определяется тем, какие сайты
смогут «пережить» события деметилирования. Хотя
значительный объем метилирования ДНК, наблю-
даемый у позвоночных, связан с повторяющимися
и ретровирусными последовательностями и может
служить для поддержания этих последовательностей
в перманентно «молчащем» состоянии, не может
быть никаких сомнений в том, что во многих слу-
чаях эта модификация обеспечивает основу для
эпигенетической передачи статуса генной актив-
ности. Наиболее четко это продемонстрировано
на таких импринтированных локусах (Cattanach and
Kirk, 1985), как локус Igf2/H19 мыши или человека,
в котором один аллель маркирован метилированием
ДНК, что, в свою очередь, контролирует экспрес-
сию с обоих генов (Bell and Felsenfeld, 2000; Hark
et al., 2000; Kanduri et al., 2000). В то же самое время
было ясно, что это не может быть единственным
механизмом для эпигенетической передачи инфор-
мации. Например, как отмечено в разделе 2, эффект
положения мозаичного типа наблюдали за много
лет до этого у Drosophila — организма, который обла-
дает крайне низким уровнем метилирования ДНК.
Более того, в последующие годы генетики, работав-
шие с Drosophila, идентифицировали группы генов
Polycomb и Trithorax, которые, по-видимому, вовле-
чены в постоянно «заблокированное» состояние ак-
тивности (либо «выключенное», либо «включенное»
соответственно) кластеров генов в течение развития.
Тот факт, что эти состояния стабильно передавались
в череде клеточных делений, позволял предполагать,
что в основе этого процесса лежит эпигенетический
механизм.
5. РОЛЬ ХРОМАТИНА
Многие годы признавалось, что белки, связанные
с ДНК в эукариотном ядре, особенно гистоны,
могут участвовать в модификации свойств ДНК.
Задолго до начала работ по метилированию ДНК
Стедман и Стедман (Stedman and Stedman, 1950)
предположили, что гистоны могут действовать как
общие репрессоры экспрессии генов. Они писали,
что, поскольку все соматические клетки организма
имеют одно и то же число хромосом, они имеют
одинаковый генетический набор (хотя, как отмеча-
ется в разделе 3, это оставалось недоказанным еще
несколько лет). Понимание тонкой природы моди-
фикаций гистонов было в далекой перспективе, так
что Стедманы оперировали предположением, что
разные типы клеток в организме, чтобы генериро-
вать наблюдаемые различия в фенотипе, должны
обладать различными типами гистонов. Гистоны
действительно могут снижать содержание тран-
скриптов неактивных генов у прокариот. Последую-
щая работа касалась изучения способности хрома-
тина служить матрицей для транскрипции и была
направлена на решение вопроса о том, ограничена
ли эта способность специфичным типом клеток.
Другие результаты показали, что только небольшая
часть ДНК, упакованная в виде хроматина, была до-
ступна для зондов, сцепленных с ферментами (Cedar
and Felsenfeld, 1973). Тем не менее был период, когда
все полагали, что гистоны являются супрессорными
белками, которые пассивно подавляют экспрессию
генов. С этой точки зрения, активация гена означает
просто «сдирание» с него гистонов; считалось, что
коль скоро это сделано, транскрипция будет осуще-
ствляться, почти как у прокариот. Имелись, однако,
некоторые данные о том, что в эукариотических
клетках нет более или менее протяженных районов
открытой ДНК (Clark and Fesenfeld, 1971), что со-
средоточило внимание на промоторах и других спе-
цифических регуляторных сайтах. Более того, даже
если модель «голой» ДНК является правильной,
было неясно, каким образом принимается решение
о том, какие из покрытых гистонами участков долж-
ны быть освобождены.
Работы по решению этой проблемы начались
еще в 1964 году, когда Олфри и Мирски (Allfrey and
Mirsky, 1964) высказали спекулятивное соображе-
ние, что с активацией генов могло бы коррелировать
ацетилирование гистонов и что «активный» хрома-
тин не обязательно должен быть лишен гистонов.
В последующее за этим десятилетие наблюдался
огромный интерес к изучению взаимоотношений
между модификациями гистонов и экспрессией
генов. Были идентифицированы иные, чем ацети-
лирование, модификации (метилирование и фос-
форилирование), но их функциональное значение
оставалось неясным. Исследовать эту проблему
стало гораздо легче после открытия Корнбергом
и Томасом упаковки ДНК в нуклеосому (Kornberg
and Thomas, 1974), основополагающую субъединицу
хроматина, содержащую гистоны. Определение кри-
сталлической структуры нуклеосомы, сначала с раз-
решением 7 Å, а потом с разрешением 2,8 Å, также
дало важную структурную информацию, в частно-
сти данные о распространении аминотерминальных
«хвостов» гистонов за пределы кора «ДНК — белко-
вый октамер», что делало очевидной их доступность
для модификаций (Richmond et al., 1984; Luger et al.,
1997). Начав в 1980 году и продолжив свои иссле-
дования на протяжении еще нескольких лет, Грун-
штейн (Grunstein) и его сотрудники (Wallis et al.,
1980; Durrin et al., 1991), применив генетический
анализ на дрожжах, смогли показать, что аминотер-
минальные «хвосты» гистонов имеют большое зна-
чение для регуляции экспрессии генов и для образо-
вания «молчащих» доменов хроматина.
Окончательная привязка к детальным механиз-
мам началась с того, что Эллис (Allis) с коллегами
(Brownell et al., 1996) показали, что гистоновая аце-
тилтрансфераза из Tetrahymena гомологична белку
Gcn5, регулятору транскрипции у дрожжей; это
явилось прямым доказательством того, что ацетили-
рование гистонов связано с контролем экспрессии
генов. Дополнительные доказательства были полу-
чены из исследования, показывающего, что гисто-
новая деацетилаза млекопитающих связана с ре-
прессивным регулятором транскрипции дрожжей
Rpd3p (Taunton et al., 1996). С этого момента начался
буквально взрывной поток открытий модификаций
гистонов, а также переоценка роли тех из них, кото-
рые уже были известны прежде.
Все это еще не было ответом на вопрос о том,
каким образом сайты для модификации выбира-
ются in vivo. Было показано, например (Pazin et al.,
1994), что Gal4-VP16 может активировать тран-
скрипцию с реконструированной хроматиновой
матрицы АТФ-зависимым образом. Активация
сопровождалась репозиционированием нуклеосом,
и было высказано предположение, что это является
критическим событием в обеспечении доступности
промотора. Для более полного понимания значения
этих открытий потребовалась идентификация АТФ-
зависимых комплексов ремоделинга нуклеосом, та-
ких как SWI/SNF и NURF (Peterson and Herskowitz,
1992; Tsuiyama and Wu, 1995), и понимание того, что
в подготовке хроматиновой матрицы к транскрип-
ции участвуют и модификации гистонов, и ремоде-
линг нуклеосом. Более поздние результаты работы
многих лабораторий показали, что отдельные сайты
различаются в порядке связывания и идентичности
ферментов, задействованных на этих этапах. Одна-
ко должно быть ясно, что начальные детерминанты
специфической активности гена во время нормаль-
ного развития должны включать в себя регулятор-
ные факторы, которые распознают и связываются
с конкретными последовательностями ДНК в эн-
хансерах, промоторах и других контрольных сайтах.
Эти факторы обычно представляют собой белки
со специфичными для последовательности ДНК
связывающими доменами, которые, в свою очередь,
способны связываться с доменами, которые рекру-
тируют кофакторы, прямо или косвенно влияющие
на экспрессию генов, включая во многих случаях
модификацию гистонов или комплексы ремодели-
рования нуклеосом. Первое прямое доказательство
главенства первенства ДНК-связывающих фак-
торов было получено в работах Вайнтрауба (Davis
et al., 1987; Tapscott et al., 1988; Weintraub et al., 1989)
и его сотрудников, которые показали, что сверх-
экспрессия белка MyoD в фибробластах и других
тканях индуцировала их превращение в миобласты.
Сейчас понятно, что такие специфичные для после-
довательности события связывания устанавливают
начальные состояния регуляции; последующие эпи-
генетические механизмы обеспечивают способы
поддержания этих начальных состояний после их
установления. Конечно, нарушение таких установ-
ленных эпигенетических паттернов способно изме-
нить фенотипы.
Комплексы, которые модифицируют или ремо-
делируют гистоны, могут доставляться сайт-спе-
цифичным путем не только с помощью белков,
но и с помощью РНК. Недавно стало известно, что
некоторые виды некодирующих РНК также спо-
собны к локализованному связыванию в сочетании
с рекрутированием регуляторных комплексов (Chu
et al., 2011). Например, в случае HOTAIR (Rinn et al.,
2007) и Kcnq1ot1 (Pandey et al., 2008; Mohammad
et al., 2010) РНК имеют тенденцию связываться
с ДНК довольно близко к своим собственным участ-
кам синтеза и приносить с собой гистон-модифи-
цирующий комплекс Polycomb PRC2 (см. ниже),
связанный с определенной последовательностью
на каждой РНК. Kcnq1ot1 также может рекрути-
ровать ДНК-метилтрансферазу (Mohammad et al.,
2010). Было показано, что HOTAIR, как и РНК-
компонент некодирующей РНК теломеразы, свя-
зываются непосредственно с отдельными мотивами
на ДНК, обеспечивая направленную специфич-
ность (Chu et al., 2012).
Оставалось неясным, каким образом с исполь-
зованием этих механизмов информация о данном
состоянии активности могла бы передаваться при
клеточном делении; т. е. была непонятна их роль
в эпигенетической передаче информации. Сле-
дующим важным шагом стало понимание того, что
модифицированные гистоны рекрутируют специ-
фичным для данной модификации образом белки,
которые, в свою очередь, могут влиять на локальные
структурные и функциональные состояния хрома-
тина. Было, например, обнаружено, что метили-
рование лизина-9 в гистоне Н3 приводит к рекру-
тированию белка НР1 гетерохроматина (Bannister
et al., 2001; Lachner et al., 2001; Nakayama et al.,
2001). Более того, НР1 мог рекрутировать фермент
(Suv39H1), отвечающий за метилирование. Это при-
вело к созданию модели распространения воспроиз-
ведения сайленсированного состояния замолкшего
хроматина по всему данному участку посредством
процессивного [processive] механизма (рис. 1.1А).
Не менее важно, что данная модель дала разумное
объяснение того, как это состояние может пере-
даваться и сохраняться в цикле репликации ДНК
(рис. 1.1Б). В последнее время внимание сосре-
доточено на белках группы Polycomb (Margueron
and Reinberg, 2011) и, в частности, на комплексе
PRC2, который содержит компонентный белок
Ezh2/E(Z), метилирующий гистон H3 по остатку
К27 — метке, связанной с гетерохроматином. Ана-
логично механизму, обуславливающему связывание
лизина-9 гистоном H3, комплекс PRC2 связывает-
ся с H3K27me3 (Hansen et al., 2008). Это вовлекает
в процесс другой член комплекса PRC2, Eed/ESC,
который содержит домен, взаимодействующий с ме-
тилированным H3K27, и это взаимодействие, в свою
очередь, стимулирует активность метилтрансферазы
Ezh2 (Margueron et al., 2008; Margueron et al., 2009).
Такое построение компонентов предполагает тот
же тип механизма распространения, предложенный
для метилирования H3K9, как показано на рис. 1.1A.
Еще предстоит определить, действуют ли меха-
низмы, которые могут объяснить распространение
модификации гистона, вниз по цепи полинуклео-
сом и во время митоза.
Несмотря на эти результаты, вопрос о роли мо-
дификаций гистонов в эпигенетических процессах
продолжает оставаться источником путаницы. По-
нятно, что, несмотря на частое использование тер-
мина «эпигенетическая модификация», данная мо-
дификация гистонов, происходящая в этом участке
генома, необязательно является элементом эпигене-
тического механизма, а может быть просто частью
биохимического процесса, такого как экспрессия
гена или восстановление разрыва нити ДНК.
Были предложены различные типы механизмов
воспроизведения, которые зависели не от модифи-
цированных гистонов, а скорее от варианта гистонов
(Ahmad and Henikoff , 2002; McKittrick et al., 2004).
Гистон Н3 включается в хроматин только во время
репликации ДНК. Напротив, вариант этого гистона,
Н3.3, отличающийся от Н3 четырьмя аминокисло-
тами, включается в нуклеосомы независящим от ре-
пликации образом и имеет тенденцию накапливать-
ся в активном хроматине, в котором он обогащается
«активными» модификациями гистонов (McKittrick
et al., 2004). Было выдвинуто предположение о том,
что для поддержания активного состояния достаточ-
но присутствия Н3.3 и что после репликации оста-
ется достаточно Н3.3 для поддержания активного
состояния, хотя он и разбавляется вдвое. После-
дующая транскрипция приводила бы к замещению
нуклеосом, содержащих Н3, вариантом Н3.3, вос-
производя таким образом это активное состояние
в следующем поколении. Результаты, полученные
Ng и Gurdon (Ng and Gurdon, 2005; Ng and Gurdon,
2008a; Ng and Gurdon, 2008b), убедительно под-
тверждают такую модель. В экспериментах по ядер-
ной трансплантации они показали, что, когда ядра
из клеток, экспрессирующих энтодермальные гены,
трансплантируются в лишенные ядра яйцеклетки
Xenopus, происходит значительная экспрессия этих
генов в клетках анимального полюса (которые
не должны их экспрессировать) развивающихся
в результате эмбрионов. Степень этого эпигенети-
ческого дефекта контролируется обилием гистона
H3.3: снижение уровня H3.3 приводит к уменьше-
нию доли клеток, экспрессирующих энтодермаль-
ные гены, тогда как повышенная экспрессия H3.3
приводит к росту доли клеток анимального полюса
с аберрантной экспрессией энтодермального гена.
Другие варианты гистонов способны помочь при-
дать стабильность подавленному эпигенетическому
состоянию. У мышей вариант macroH2A (mH2A)
связан с необратимой инактивацией X-хромосомы.
Внедрение этого варианта помогает придать неак-
тивной X-хромосоме сопротивляемость к перепро-
граммированию в экспериментах по переносу ядра
(Pasque et al., 2011).
В определение понятия «эпигенетический меха-
низм» было предложено включить, помимо способ-
ности к сохранению стабильности в ходе деления
клетки, требование начального сигнала, такого как
экспрессия фактора транскрипции, потребность
в котором отпадает после того, как новое состояние
будет стабилизировано (Berger et al., 2009). Поведе-
ние такого рода было описано для глюкокортико-
ид-респонсивного элемента, в котором временное
связывание глюкокортикоидного рецептора (GR)
с некоторыми сайтами приводит к ремоделирова-
нию нуклеосом, что делает возможным связывание
модифицированной молекулы рецептора эстрогена
после отсоединения GR (Voss et al., 2011). Следует
иметь в виду, что большинство факторов транскрип-
ции эукариот не держатся продолжительное время
на своих сайтах связывания, а быстро отсоединя-
ются. Определенные виды модификаций хромати-
на могут, в принципе, обеспечивать механизм для
интеграции сигналов от множественных факторов
транскрипции (Struhl, 1999).
6. ВСЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОСВЯЗАНЫ
В этих моделях в конечном счете начала замыкаться
связь между модифицированными или вариант-
ными гистонами, активацией специфических генов
и эпигенетикой, хотя многое еще предстоит сде-
лать. Хотя существуют определенные представления
о том, как может поддерживаться данное состояние
гетерохроматина, они не объясняют, каким образом
устанавливаются структуры «молчащего» хрома-
тина. Большая часть доказательств существования
таких механизмов получена из работ по сайлен-
сингу локуса переключения типа спаривания (MAT-
локуса) и центромерных последовательностей
у Schizosaccharomyces pombe. Формирование гетеро-
хроматина включает в себя продукцию РНК-тран-
скриптов, особенно из повторяющихся последова-
тельностей, которые преобразуются в малые РНК
под действием белков, таких как Dicer, Argonaute
и РНК-зависимая РНК-полимераза (Zofall and
Grewal, 2006). Эти РНК впоследствии рекрутиру-
ются в сайты гомологичной ДНК как часть ком-
плексов, которые в конечном итоге будут включать
в себя ферменты, обеспечивающие «сайленсинг»
модификациям гистонов, тем самым инициируя
образование гетерохроматина. В настоящее время
также есть свидетельства того, что те же механизмы
требуются для поддержания по крайней мере неко-
торых гетерохроматиновых областей в клетках ра-
стений и позвоночных.
Теперь нам известно бесчисленное количе-
ство примеров эпигенетических механизмов, дей-
ствующих в живых организмах. В дополнение
к аллель-специфической и случайной инактива-
ции Х-хромосомы, описанной в разделе 5, и ана-
логичной ей аллель-специфической экспрессии
во многих других импринтированных локусах,
существуют эпигенетические явления, участвую-
щие в экспрессии антител, в которых перестройка
генов иммуноглобулинов на одной хромосоме из-
бирательно подавляется. У Drosophila гены группы
Polycomb ответственны за установление домена
«молчащего» хроматина, который поддерживается
на протяжении всех последующих клеточных деле-
ний (глава 17 [Grossniklaus and Paro, 2014]). Эпи-
генетические изменения отвечают также за пара-
мутации у растений, при которых один аллель
может вызывать наследуемое изменение экспрес-
сии гомологичного аллеля (Brink, 1956; Stam et al.,
2002). Это пример эпигенетического состояния,
которое наследуется как митотически, так и мейо-
тически — феномен, хорошо документированный
у растений, но лишь недавно отмеченный у живот-
ных (Rassoulzadegan et al., 2006). Кроме того, было
показано, что структура конденсированного хро-
матина, характерная для центромер у таких разных
организмов, как мухи и люди, может быть передана
через ассоциированные с центромерой белки, а не
через нуклеотидную последовательность ДНК.
Во всех этих случаях нуклеотидная последователь-
ность ДНК остается интактной, но ее способность
к экспрессии подавляется. Весьма вероятно, что
во всех случаях это опосредуется метилированием
ДНК, модификациями гистонов, присутствием ва-
риантных гистонов или всеми тремя механизмами;
в некоторых случаях мы уже знаем, что это дей-
ствительно так. Возможно, Х-хромосома, которая
стала источником вдохновения для первых гипо-
тез о роли метилирования ДНК в эпигенетической
активации сигнального пути (сигналинга), явля-
ется лучшим примером взаимосвязи и совмест-
ного функционирования всех этих механизмов для
достижения эпигенетической регуляции. Недав-
ние исследования показывают, что сайленсинг
неактивной Х-хромосомы включает в себя, помимо
метилирования ДНК, специфические молчащие
модификации гистонов, белки группы Polycomb,
некодирующие РНК и варианты гистонов (Lee,
2011). Все они, вероятно, участвуют в передаче
«молчащего состояния» во время деления клеток.
В последние годы изучение эпигенетики было со-
средоточено на определении механизмов передачи
информации, не закодированной в ДНК. Возмож-
но, уместно пересмотреть первоначальное исполь-
зование термина «эпигенетика» 70-летней давности
для описания тогда еще плохо изученных процессов,
ведущих развитие от оплодотворенной зиготы к зре-
лому организму. Теперь мы много знаем об этих
процессах благодаря недавним результатам изуче-
ния эмбриональных стволовых клеток, которые по-
казывают, как экспрессия нескольких критических
факторов может установить самостабилизирующее-
ся плюрипотентное состояние. Это состояние может
передаваться в ряду клеточных делений в ходе деле-
ния клеток с помощью механизма, который может
считаться эпигенетическим (согласно нынешним
определениям). Такое состояние также может быть
нарушено, что приводит к различным эпигенети-
чески поддерживаемым паттернам экспрессии,
соответствующим разным путям дифференцировки
в разные типы клеток. Благодаря тщательному пере-
осмыслению этих результатов, а также результатов
более ранних исследований по ядерной трансплан-
тации можно сделать вывод, что соматические клет-
ки могут быть перепрограммированы до плюрипо-
тентности (Yamanaka and Blau, 2010). В ближайшие
годы эти процессы будут изучены более подробно,
хотя уже сейчас механизмы их работы более или
менее понятны.
Хотя краткая история эпигенетики была пред-
ставлена в виде последовательного рассказа, более
правильным был бы взгляд на эти события как
на ряд параллельных и перекрывающихся попыток
определить и объяснить эпигенетические явления.
Определение термина «эпигенетика» изменилось,
но вопросы относительно механизмов развития,
поставленные более ранними поколениями ученых,
снова оказываются в центре внимания. Современ-
ная эпигенетика все еще обращается к этим цен-
тральным вопросам. Более 80 лет прошло с тех пор,
как Меллер описал явление, называемое сейчас
эффектом положения мозаичного типа. Отрадно
наблюдать за медленным прогрессом от исследо-
вания фенотипов через элегантные генетические
исследования к современному анализу и вскрытию
сути эпигенетических механизмов на молекулярном
уровне, и особенно к синтезу всей этой информации
при анализе перехода от плюрипотентных стволо-
вых клеток к индивидуальным дифференцирован-
ным состояниям. Вместе с этими знаниями пришло
понимание того, что фактически эпигенетические
механизмы отвечают за значительную часть фено-
типа сложных организмов.
БЛАГОДАРНОСТИ
Я благодарен доктору Джону Гердону (John Gurdon)
за обмен мнениями, комментарии и советы. Эта ра-
бота была поддержана внутрикорпоративной про-
граммой исследований Национального института
здоровья, Национального института диабета, болез-
ней органов пищеварения и почек.
ЛИТЕРАТУРА
* Ссылка на источник уже есть в этой книге.
Ahmad K., Henikoff S. 2002. The histone variant H3.3 marks
active chromatin by replication-independent nucleosome assembly.
Mol. Cell 9: 1191–1200.
Allfrey V. G., Mirsky A. E. 1964. Acetylation and methylation
of histones and their possible role in the regulation of RNA
synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 51: 786–794.
Avery O. T., MacLeod C. M., McCarty M. 1944. Studies on the
chemical nature of the substance inducing transformation
of pneumococcal types. J. Exp. Med. 79: 137–158.
Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J. F., Miska E. A.,
Thomas J. O., Allshire R. C., Kouzarides T. 2001. Selective
recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1
chromo domain. Nature 410: 120–124.
Beisson J., Sonneborn T. M. 1965. Cytoplasmic inheritance
of the organization of the cell cortex in Paramecium aurelia.
Proc. Natl. Acad. Sci. 53: 282.
Bell A. C., Felsenfeld G. 2000.Methylation of a CTCF-dependent
boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene.
Nature 405: 482–485.
Berger S. L., Kouzarides T., Shiekhattar R., Shilatifard A. 2009.
An operational defi nition of epigenetics. Genes Dev. 23:
781–783.
Bird A. P. 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic
DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports
semi-conservative copying of the methylation pattern.
J. Mol. Biol. 118: 49–60.
Bird A. P., Southern E. M. 1978. Use of restriction enzymes
to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation
pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J. Mol. Biol.
118: 27–47.
Briggs R., King T. J. 1952. Transplantation of living nuclei from
blastula cells into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad.
Sci. 38: 455–463.
Brink R. A. 1956. A genetic change associated with the R locus
in maize which is directed and potentially reversible. Genetics
41: 872–889.
Brownell J. E., Zhou J., Ranalli T., Kobayashi R., Edmondson
D. G., Roth S. Y., Allis C. D. 1996. Tetrahymena histone
acetyltransferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone
acetylation to gene activation. Cell 84: 843–851.
Cattanach B. M., Kirk M. 1985. Diff erential activity of maternally
and paternally derived chromosome regions in mice.
Nature 315: 496–498.
Cedar H., Felsenfeld G. 1973. Transcription of chromatin in vitro.
J. Mol. Biol. 77: 237–254.
Chu C., Qu K., Zhong F. L., Artandi S. E., Chang H. Y. 2011.
Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles
of RNA-chromatin interactions. Mol. Cell 44: 667–678.
Chu C., Quinn J., Chang H. Y. 2012. Chromatin isolation by
RNA purifi cation (ChIRP). J. Vis. Exp. 61 pii: 3912. doi:
10.3791/3912.
Clark R. J., Felsenfeld G. 1971. Structure of chromatin. Nat.
New Biol. 229: 101–106.
Davis R. L., Weintraub H., Lassar A. B. 1987. Expression of a
single transfected cDNA converts fi broblasts to myoblasts.
Cell 51: 987–1000.
Doskocil J., Sorm F. 1962. Distribution of 5-methylcytosine
in pyrimidine sequences of deoxyribonucleic acids. Biochim.
Biophys. Acta 55: 953–959.
Durrin L. K., Mann R. K., Kayne P. S., Grunstein M. 1991.
Yeast histone H4 N-terminal sequence is required for promoter
activation in vivo. Cell 65: 1023–1031.
Grimes G. W., Aufderheide K. J. 1991. Cellular aspects of pattern
formation: The problem of assembly. Monogr. Dev. Biol.
22: 1–94.
* Grossniklaus U., Paro R. 2014. Transcriptional silencing by
Polycomb group proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.
6: a019331.
Hadorn E. 1965. Problems of determination and transdetermination.
Brookhaven Symp. Biol. 18: 148–161.
Hannah A. 1951. Localization and function of heterochromatin
in Drosophila melanogaster. Adv. Genet. 4: 87–125.
Hansen K. H., Bracken A. P., Pasini D., Dietrich N., Gehani
S. S., Monrad A., Rappsilber J., Lerdrup M., Helin K.
2008. A model for transmission of the H3K27me3 epigenetic
mark. Nat. Cell Biol. 10: 1291–1300.
Hark A. T., Schoenherr C. J., Katz D. J., Ingram R. S., Levorse
J. M., Tilghman S. M. 2000. CTCF mediates methylation-
sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2
locus. Nature 405: 486–489.
Hershey A. D., Chase M. 1952. Independent functions of viral
protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J. Gen.
Physiol. 36: 39–56.
Holliday R., Pugh J. E. 1975. DNA modifi cation mechanisms
and gene activity during development. Science 187: 226–232.
Jablonka E., Lamb M. J. 1995. Epigenetic inheritance and evolution.
Oxford University Press, New York.
Kanduri C., Pant V., Loukinov D., Pugacheva E., Qi C. F.,
Wolff e A., Ohlsson R., Lobanenkov V. V. 2000. Functional
association of CTCF with the insulator upstream of the H19
gene is parent of origin-specifi c and methylation-sensitive.
Curr. Biol. 10: 853–856.
Kornberg R. D., Thomas J. O. 1974. Chromatin structure; oligomers
of the histones. Science 184: 865–868.
Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., Jenuwein T.
2001. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding
site for HP1 proteins. Nature 410: 116–120.
Laskey R. A., Gurdon J. B. 1970. Genetic content of adult somatic
cells tested by nuclear transplantation from cultured
cells. Nature 228: 1332–1334.
Lee J. T. 2011. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation
becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12: 815–826.
Luger K., Mader A. W., Richmond R. K., Sargent D. F., Richmond
T. J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core
particle at 2.8 A resolution. Nature 389: 251–260.
Lyon M. F. 1961. Gene action in the X-chromosome of the
mouse. Nature 190: 372–373.
Margueron R., Reinberg D. 2011. The Polycomb complex PRC2
and its mark in life. Nature 469: 343–349.
Margueron R., Li G., Sarma K., Blais A., Zavadil J., Woodcock
C. L., Dynlacht B. D., Reinberg D. 2008. Ezh1 and
Ezh2 maintain repressive chromatin through diff erent mechanisms.
Mol. Cell 32: 503–518.
Margueron R., Justin N., Ohno K., Sharpe M. L., Son J.,
Drury W. J. 3rd, Voigt P., Martin S. R., Taylor W. R.,
De Marco V. et al. 2009. Role of the polycomb protein EED
in the propagation of repressive histone marks. Nature 461:
762–767.
McClintock B. 1965. The control of gene action in maize.
Brookhaven Symp. Biol. 18: 162–184.
McClure K. D., Schubiger G. 2007. Transdetermination: Drosophila
imaginal disc cells exhibit stem cell-like potency. Int.
J. Biochem. Cell Biol. 39: 1105–1118.
McKittrick E., Gafken P. R., Ahmad K., Henikoff S. 2004.
Histone H3.3 is enriched in covalent modifi cations associated
with active chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 101:
1525–1530.
Mohammad F., Mondal T., Guseva N., Pandey G. K., Kanduri
C. 2010. Kcnq1ot1 noncoding RNA mediates transcriptional
gene silencing by interacting with Dnmt1. Development
137: 2493–2499.
Morgan T. H. 1911. An attempt to analyze the constitution of the
chromosomes on the basis of sex-linked inheritance in Drosophila.
J. Exp. Zool. 11: 365–414.
Muller H. J. 1930. Types of visible variations induced by X-rays
in Drosophila. J. Genet. 22: 299–334.
Nakayama J., Rice J. C., Strahl B. D., Allis C. D., Grewal S. I.
2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic
control of heterochromatin assembly. Science 292: 110–113.
Ng R. K., Gurdon J. B. 2005. Epigenetic memory of active gene
transcription is inherited through somatic cell nuclear transfer.
Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 1957–1962.
Ng R. K., Gurdon J. B. 2008a. Epigenetic inheritance of cell differentiation
status. Cell Cycle 7: 1173–1177.
Ng R. K., Gurdon J. B. 2008b. Epigenetic memory of an active
gene state depends on histone H3.3 incorporation into
chromatin in the absence of transcription. Nat. Cell Biol. 10:
102–109.
Novick A., Weiner M. 1957. Enzyme induction as an all-ornone
phenomenon. Proc. Natl. Acad. Sci. 43: 553–566.
Ohno S., Kaplan W. D., Kinosita R. 1959. Formation of the sex
chromatin by a single X-chromosome in liver cells of Rattus
norvegicus. Exp. Cell Res. 18: 415–418.
Pandey R. R., Mondal T., Mohammad F., Enroth S., Redrup
L., Komorowski J., Nagano T., Mancini-Dinardo D.,
Kanduri C. 2008. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA
mediates lineage-specifi c transcriptional silencing through
chromatin-level regulation. Mol. Cell 32: 232–246.
Pasque V., Halley-Stott R. P., Gillich A., Garrett N., Gurdon
J. B. 2011. Epigenetic stability of repressed states involving
the histone variant macro- H2A revealed by nuclear
transfer to Xenopus oocytes. Nucleus 2: 533–539.
Pazin M. J., Kamakaka R. T., Kadonaga J. T. 1994. ATP-dependent
nucleosome reconfi guration and transcriptional
activation from preassembled chromatin templates. Science
266: 2007–2011.
Peterson C. L., Herskowitz I. 1992. Characterization of the yeast
SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator
of transcription. Cell 68: 573–583.
Ptashne M. 1992. A genetic switch: Phage l and higher organisms,
2nd ed. Cell Press and Blackwell Scientifi c, Cambridge, MA.
Rassoulzadegan M., Grandjean V., Gounon P., Vincent S., Gillot
I., Cuzin F. 2006. RNA-mediated non-Mendelian inheritance
of an epigenetic change in the mouse. Nature 441:
469–474.
Richmond T. J., Finch J. T., Rushton B., Rhodes D., Klug A.
1984. Structure of the nucleosome core particle at 7 A resolution.
Nature 311: 532–537.
Riggs A. D. 1975. X inactivation, diff erentiation, and DNA
methylation. Cytogenet. Cell Genet. 14: 9–25.
Riggs A. D., Porter T. N. 1996. Overview of epigenetic mechanisms.
In Epigenetic mechanisms of gene regulation (ed.
Russo V. E. A., Martienssen R., Riggs A. D.), pp. 29–45.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY.
Riggs A. D., Martienssen R. A., Russo V. E.A. 1996. Introduction.
In Epigenetic mechanisms of gene regulation (ed. Russo
V. E. A. et al.), pp. 1–4. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY.
Rinn J. L., Kertesz M., Wang J. K., Squazzo S. L., Xu X., Brugmann
S. A., Goodnough L. H., Helms J. A., Farnham P. J.,
Segal E. et al. 2007. Functional demarcation of active and
silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding
RNAs. Cell 129: 1311–1323.
Stam M., Belele C., Dorweiler J. E., Chandler V. L. 2002. Differential
chromatin structure within a tandem array 100 kb
upstream of the maize b1 locus is associated with paramutation.
Genes Dev. 16: 1906–1918.
Stedman E., Stedman E. 1950. Cell specifi city of histones. Nature
166: 780–781
Struhl K. 1999. Fundamentally diff erent logic of gene regulation
in eukaryotes and prokaryotes. Cell 98: 1–4.
Sturtevant A. H. 1913. The linear arrangement of six sex-linked
factors in Drosophila, as shown by their mode of association.
J. Exp. Zool. 14: 43–59.
Tapscott S. J., Davis R. L., Thayer M. J., Cheng P. F., Weintraub
H., Lassar A. B. 1988. MyoD1: A nuclear phosphoprotein
requiring a Myc homology region to convert fi broblasts
to myoblasts. Science 242: 405–411.
Taunton J., Hassig C. A., Schreiber S. L. 1996. A mammalian
histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator
Rpd3p. Science 272: 408–411.
Tsukiyama T., Wu C. 1995. Purifi cation and properties of an
ATP-dependent nucleosome remodeling factor. Cell 83:
1011–1020.
Voss T. C., Schiltz R. L., Sung M. H., Yen P. M., Stamatoyannopoulos
J. A., Biddie S. C., Johnson T. A., Miranda T. B.,
John S., Hager G. L. 2011. Dynamic exchange at regulatory
elements during chromatin remodeling underlies assisted
loading mechanism. Cell 146: 544–554.
Waddington C. H. 1953. Epigenetics and evolution. Symp. Soc.
Exp. Biol. 7: 186–199.
Wallis J. W., Hereford L., Grunstein M. 1980. Histone H2B
genes of yeast encode two diff erent proteins. Cell 22: 799–805.
Weintraub H., Tapscott S. J., Davis R. L., Thayer M. J.,
Adam M. A., Lassar A. B., Miller A. D. 1989. Activation
of muscle-specifi c genes in pigment, nerve, fat, liver, and fi -
broblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc. Natl.
Acad. Sci. 86: 5434–5438.
Yamanaka S., Blau H. M. 2010. Nuclear reprogramming
to a pluripotent state by three approaches. Nature 465:
704–7-2.
Zofall M., Grewal S. I. 2006. RNAi-mediated heterochromatin
assembly in fi ssion yeast. Cold Spring Harb. Symp. Quant.
Biol. 71: 487–496.
Г Л А В А 2
Следующее поколение:
новые захватывающие открытия
молодых ученых в области
эпигенетических исследований
Редакция признает, что большей частью успехов, достигнутых в современной эпигенетике, мы обязаны упорному труду, самоотверженности и творческому подходу, которые молодые ученые проявляют в работе и решении научных проблем. Именно они проводят большую часть экспериментов, на которых основываются открытия, описанные
в главах нашей книги. В попытке добавить новые аспекты к этому изданию редакторы сделали подборку основных статей, которые, по нашему мнению, были новаторскими по своему характеру и вполне способными «изменить правила игры» в этой сфере в ближайшие годы или определили новые направления развития эпигенетики (подробные
ссылки в списке литературы см. ниже). Нашим первым авторам (или соавторам) этого важного сборника эссе было предложено написать короткие обзоры в исторической ретроспективе, рассказывающие о том, как происходило становление их исследований, иногда включая подробности их мировоззрения и описание препятствий, с которыми
они столкнулись, а также о том, как они преодолевали эти препятствия. Мы собрали эссе этих молодых ученых, признавая, что многие из них уже полностью посвятили себя эпигенетическим исследованиям, проводя работу в своих собственных независимых лабораториях по всему миру. Мы приветствуем их коллективные, уже осуществленные
открытия и надеемся на их дальнейшие успехи. В основном мы ожидаем, что другие молодые ученые, студенты и новички в этой области будут вдохновлены подобными свершениями и последуют по их стопам, что приведет к будущим открытиям, которые помогут решить многие фундаментальные вопросы, остающиеся в эпигенетике на сего-
дня. Хотя у нас не было возможности охватить все интересные работы, продолжающие публиковаться и в настоящее время, наша цель состояла в том, чтобы дать нашим читателям представление о том, сколько из этих открытий было сделано непосредственно теми, кто возглавлял эксперименты.
Эссе
Гистоновые деметилазы
Открытие гистоновых деметилаз, Yujiang Geno
Shi, Yu-ichi Tsukada, с. 25–27.
Исходные статьи:
Shi et al., Cell 119: 941–953 (2004).
Tsukada et al., Nature 439: 811–816 (2006).
Репрограммирование
Репрограммирование клеток, Kazutoshi Takahashi,
с. 28–30.
Исходная статья:
Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663–676 (2006).
Функциональные некодирующие РНК
днкРНК: связывание РНК с хроматином,
John L. Rinn, с. 31–33.
Исходная статья:
Rinn et al., Cell 129: 1311–1323 (2007).
Энхансерные РНК: класс длинных некодирующих
РНК, синтезированных в энхансерах, Tae-Kyung
Kim, Martin Hemberg, and Jesse M. Gray, с. 34–37.
Исходная статья:
Kim et al., Nature 465: 182–187 (2010).
Деметилирование ДНК
Расширение эпигенетического ландшафта: новые
модификации цитозина в геномной ДНК, Skirmantas
Kriaucionis and Mamta Tahiliani, с. 38–41.
Исходные статьи:
Tahiliani et al., Science 324: 930–935 (2009).
Kriaucionis and Heintz, Science 324: 929–930
(2009).
Малые мобильные РНК
Мобильные малые РНК растений, Patrice
Dunoyer, Charles Melnyk, Attila Molnar,
and R. Keith Slotkin, с. 42–45.
Исходные статьи:
Molnar et al., Science 328: 872–875 (2010).
Dunoyer et al., Science 328: 912–916 (2010).
Slotkin et al., Cell 136: 461–472 (2009).
Хроматин CpG-островков
Хроматин CpG-островков формируется за счет
рекрутирования белков ZF-CxxC, Neil P. Blackledge,
John P. Thomson, and Peter J. Skene,
с. 46–48.
Исходные статьи:
Thomson et al., Nature 464: 1082–1086 (2010).
Blackledge et al., Mol Cell 38: 179–190 (2010).
BET-считыватели гистоновых меток как мишени
для эпигенеzтической терапии
Ингибиторы бромодомена и экстратерминального
домена (BETi) для терапии рака: химическая
модуляция структуры хроматина, Jun Qi, с. 49–51.
Исходная статья:
Filippakopoulos et al., Nature 468: 1067–1073
(2010).
Фармакологическое ингибирование бромо-
домен-содержащих белков при воспалении,
Uwe Schaefer, с. 52–55.
Исходная статья:
Nicodeme et al., Nature 468: 1119–1123 (2010).
Вызванные раком мутации гистоновых генов
Мутации гистона H3 при опухолях
головного мозга у детей, Xiaoyang Liu, Troy A.
McEachron, Jeremy Schwartzentruber, and Gang Wu,
с. 56–59.
Исходные статьи:
Wu et al., Nat. Genet. 44: 251–253 (2012).
Schwartzentruber et al., Nature 482: 226–231
(2012).
Взаимодействия хромосом на дальнем расстоянии
Фолдинг хромосом: водитель или
пассажир эпигенетического состояния?
Tom Sexton and Eitan Yaff e, с. 60–63.
Исходные статьи:
Sexton et al., Cell 148: 458–472 (2012).
Lieberman-Aiden et al., Science 326: 289–293
(2009).
Открытие гистоновых деметилаз
Yujiang Geno Shi1 и Yu-ichi Tsukada2
1 Harvard Medical School, and Endocrinology Division, Brigham and Women’s Hospital, Boston, Massachusetts 02115;
2 Research Center for Infectious Diseases, Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, 3-1-1 Maidashi,
Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka 812-8582, Japan
e-mail: yujiang_shi@hms.harvard.edu and ytsukada@bioreg.kyushu-u.ac.jp
Метилирование гистонов — ключевой элемент эпиге-
нома эукариот. С момента открытия первой гистоновой
деметилазы (HDM — histone demethylase) в 2004 году
было идентифицировано и охарактеризовано более 20
деметилаз. Они принадлежат либо к семейству LSD,
либо к семейству JmjC, демонстрируя обратимость
всех состояний метилирования почти на всех основных
сайтах метилирования лизина в гистонах. Эти находки
положили конец многолетним спорам об обратимости
метилирования гистонов, став крупным прорывом,
изменившим наше понимание эпигенетического насле-
дования и регуляции функции генома. Здесь мы сумми-
руем открытие HDM, а также последние достижения,
проблемы и будущие перспективы исследований HDM.
Метилирование гистонов по остаткам лизина и ар-
гинина представляет собой ключевые ковалентные
модификации гистонов в эпигенетической регуля-
ции. Вместе с метилированием ДНК они являются
характерными признаками эпигенетического насле-
дования. Хотя другие модификации гистонов, та-
кие как ацетилирование и фосфорилирование, как
известно, обратимы в течение некоторого времени,
обратимость метилирования гистонов остается под
вопросом. Только в 2004 году с открытием первой
гистоновой деметилазы (HDM — histone demethylase)
эта проблема была решена.
Как это часто бывает, первая HDM — LSD1
(идентификатор гена — KDM1A) — была обнаруже-
на неожиданным образом. Изучая, как метаболиче-
ские ферменты, их гомологи и кофакторы участвуют
в регуляции эпигенетических генов, исследователи
Ян Ши и Юйцзян Гено Ши (Yang Shi и Yujiang Geno
Shi) заинтересовались тем, как гомолог метаболиче-
ского фермента, названный nPAO (nuclear polyamine
oxidase, ядерная полиаминоксидаза; также иденти-
фицируемый как KIAA0601/BHC110), который они
ранее выделили из транскрипционного комплекса
CtBP, может функционировать в процессе эпигене-
тической регуляции генов (Shi et al., 2003). Осно-
вываясь на гомологии nPAO с известными поли-
аминоксидазами и учитывая, что полиамины также
являются минорными компонентами хроматина,
они выдвинули предположение, что nPAO может ре-
гулировать структуру хроматина посредством меха-
низма окисления полиаминов. Несмотря на месяцы
попыток, эксперименты, направленные на опреде-
ление предполагаемой полиаминоксидазной актив-
ности nPAO, не увенчались успехом. Хотя с хими-
ческой точки зрения окисление метилированного
лизина может привести к деметилированию лизина
посредством реакции окисления амина, на тот мо-
мент времени отсутствовали сообщения об откры-
тии такого механизма реакции. Когда в качестве
субстрата полиамин был заменен на гистон H3, ди-
метилированный по лизину 4 (H3K4me2), Y. G. Shi
наконец смог успешно обнаружить деметилирова-
ние гистонов, опосредованное nPAO. Таким обра-
зом, лаборатория доктора Yang Shi открыла первую
деметилазу лизина (KDM1) (Shi et al., 2004). Белок
nPAO был затем переименован в LSD1 (лизин-спе-
цифичную гистоновую деметилазу 1), и с тех пор
было выделено семейство гистоновых деметилаз
LSD. Это открытие положило конец десятилетиям
споров об обратимости метилирования гистонов.
Оно стало крупным прорывом и сдвигом парадиг-
мы в нашем понимании динамики метилирования
гистонов. Химическая реакция, которую катали-
зирует LSD1/KDM1A, — это окисление амина пу-
тем окислительного расщепления α-углеродного
мостика в метилированном лизине с образованием
промежуточного имина, который гидролизуется
с образованием формальдегида, в результате чего
высвобождается одна молекула H2O2 и деметилиру-
ется лизин (рис. 1). Примечательно, что, поскольку
для образования промежуточного имина требуется
протонированный азот, LSD-семейство деметилаз
может деметилировать только моно- и диметилиро-
ванные (me1, me2), но не триметилированные (me3)
остатки лизина. Это повысило вероятность сущест-
вования других классов HDM, которые еще пред-
стояло обнаружить.
Для поиска гистоновых деметилаз в лабора-
тории доктора Yi Zhang был применен подход
с биохимической очисткой на основе оценки их
активности. Сходство химических реакций при
удалении метильной группы у 1-meA или 3-meC
из ДНК с помощью семейства AlkB ДНК-репара-
ционных деметилаз (Falnes et al., 2002; Trewick et al.,
2002), с одной стороны, и при деметилировании
лизина — с другой, позволило ученым выдвинуть
гипотезу о том, что аналогичный механизм может
быть использован для деметилирования гисто-
нов. В результате был разработан, оптимизирован
и использован при очистке гистоновой деметилазы
метод измерения высвобождения формальдегида
с использованием α-кетоглутарата (α-KG) и Fe(II)
в качестве кофакторов путем мониторинга фер-
ментативной активности фракций, сходящих с ко-
лонки. К 2005 году Yu-ichi Tsukada в лаборатории
Yi Zhang удалось идентифицировать первую HDM,
содержащую домен JmjC (JHDM1/KDM2), кото-
рый деметилирует гистон H3K36 (Tsukada et al.,
2006). Оказывается, в геноме млекопитающих есть
30 различных белков, содержащих домен JmjC.
Химическая реакция, катализируемая HDM, содер-
жащими домен JmjC, представляет собой окисле-
ние метильной группы за счет радикальной атаки
высокореакционноспособных оксоферрильных
частиц с образованием нестабильного промежуточ-
ного карбиноламина; последующее высвобождение
формальдегида из карбиноламина дает деметили-
рованный лизин (см. рис. 1). В отличие от химиче-
ской реакции, опосредованной LSD1, эта реакция
совместима с остатками триметилированного (me3)
лизина. Таким образом, в дополнение к семей-
ству деметилаз LSD (включающему LSD1 и LSD2)
открытие семейства деметилаз, содержащих домен
JmjC (включающий более 20 HDM), дополнительно
показало обратимость всех состояний метилиро-
вания гистонов (моно-, ди- и триметилирования)
почти на всех основных модифицируемых сайтах
метилирования гистонов. Несколько других лабо-
раторий также изучали белки, содержащие домен
JmjC, в качестве потенциальных кандидатов на ги-
стоновую деметилазу и внесли свой вклад в опре-
деление представителей семейства деметилаз JmjC.
Хотя для идентификации LSD1, первой HDM,
потребовалось более 40 лет, менее чем за четыре
года с момента открытия деметилирования гистонов
мы стали свидетелями быстрого прогресса в наших
знаниях в этой области, так что теперь именно она
является основным направлением эпигенетических
исследований. Более 20 HDM активно катализи-
руют деметилирование почти всех основных сайтов
метилирования гистонового лизина и ряда сайтов
метилирования аргинина. Тем не менее следующие
фундаментальные вопросы, относящиеся к фермен-
тативному действию, регуляции и биологической
функции, остаются нерешенными: во-первых, есть
вероятность существования третьего класса HDM,
который еще предстоит открыть. Это утверждение
в значительной степени основано на предположе-
нии, что не существует известной деметилазы для
метилирования H3K79. Подобная модификация
уникальна тем, что это единственный остаток, кото-
рый метилируется Dot1/Dot1L гистоновой метил-
трансферазой, не содержащей SET-домен, поэтому
есть соблазн предположить, что деметилирование
H3K79 может использовать другой новый класс
HDM. Кроме того, новые деметилазы аргинина
могут составлять новый класс HDM. Во-вторых,
функциональная характеристика деметилаз в основ-
ном ограничивается аспектами транскрипции генов
и, в частности, инициацией транскрипции с про-
мотора. Это слишком узкая специализация, которая
не может полностью объяснить широкий диапазон
участия HDM в биологических и патологических
процессах. Стоит изучить, как HDM участвуют
в элонгации транскрипции, процессинге котран-
скрипционной информационной РНК, процессах
репликации и/или репарации ДНК. В-третьих, еще
предстоит изучить, как регулируются сами HDM.
Например, будет полезно знать, как они специфиче-
ски направляются к сайтам проявления своей актив-
ности; как деметилазы осуществляют свои функции
в контексте более крупных комплексов, содержащих
ассоциированные кофакторы; как регулируются их
экспрессия и активность. И, поскольку действие
этих ферментов требует метаболических кофак-
торов, важно понять, как клеточный метаболизм
связан с внутриклеточной функцией и регуляцией
HDM.
Влияние открытия гистоновых деметилаз вы-
шло за рамки регуляции метилирования гистонов,
включая стимулирование поиска ДНК-деметилаз,
описанных у Kriaucionis и Tahiliani (2014). Мы ожи-
даем больше открытий в этом направлении, кото-
рые сильно повлияют на развитие эпигенетики.
Наиболее важно то, что HDM участвуют во мно-
гих нормальных и патологических процессах,
включая транскрипцию генов, самообновление
стволовых клеток, развитие организма и онко-
генез. Теперь, когда мы знаем, что метилирование
гистонов обратимо, появляется надежда, что деме-
тилазы станут многообещающими терапевтиче-
скими мишенями для будущих «эпигенетических
лекарств». Ответы на фундаментальные вопросы,
поднятые выше, абсолютно необходимы не только
для понимания биологических функций демети-
лирования гистонов, но и для продвижения даль-
нейших клинических прикладных исследований
сложных заболеваний человека.
ЛИТЕРАТУРА
Falnes P. O., Johansen R. F., Seeberg E. 2002. AlkB-mediated
oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia
coli. Nature 419: 178–182.
Kriaucionis S., Tahiliani M. 2014. Expanding the epigenetic
landscape: Novel modifi cations of cytosine in genomic
DNA. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. doi: 10.1101/cshperspect.
a018630.
Shi Y. J., Sawada J.-I., Sui G. C., Aff ar E. B., Whetstine J.,
Lan F., Ogawa H., Luke M. P.-S., Nakatani Y., Shi Y. 2003.
Coordinated histone modifi cations mediated by a CtBP corepressor
complex. Nature 422: 735 — 738.
Shi Y., Lan F., Matson C., Mulligan P., Whetstine J. R.,
Cole P. A., Casero R. A., Shi Y. 2004. Histone demethylation
mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell
119: 941 — 953.
Trewick S. C., Henshaw T. F., Hausinger R. P., Lindahl T.,
Sedgwick B. 2002. Oxidative demethylation by Escherichia
coli AlkB directly reverts DNA base damage. Nature 419:
174 — 178.
Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M. E.,
Borchers C. H., Tempst P., Zhang Y. 2006. Histone demethylation
by a family of JmjC domain-containing proteins.
Репрограммирование клеток
Kazutoshi Takahashi
Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, 606-8507, Japan
e-mail: takahash@cira.kyoto-u.ac.jp
Технология ядерного репрограммирования была впер-
вые создана более 50 лет назад. С ее помощью можно
омолаживать соматические клетки, стирая эпигене-
тическую память и конструируя новый порядок плю-
рипотентности. Недавно было открыто, что индуци-
рованная плюрипотентность может быть достигнута
с помощью небольшого набора факторов транскрип-
ции, что дает беспрецедентные возможности для фар-
мацевтической промышленности, клинических и лабо-
раторных исследований. Эта технология позволяет
получить доступ к исследованиям патологий с исполь-
зованием индуцированных плюрипотентных стволо-
вых клеток пациентов (iPS — induced pluripotent stem).
Кроме того, ожидается, что iPS-клетки станут «восхо-
дящей звездой» регенеративной медицины в качестве
источника для трансплантационной терапии.
Дифференцировка клеток долгое время считалась
односторонним движением, при котором клет-
ку можно представить в виде шара, катящегося
вниз под уклон и развертывающего «развитие»
от недифференцированного состояния стволовых
клеток или клеток-предшественниц к физиологи-
чески зрелому состоянию, как описано Конра-
дом Уоддингтоном (Conrad Waddington) (рис. 1А)
(Waddington, 1957). Фактически все клетки ска-
тываются по этому эпигенетическому уклону
в более глубокие долины, из которых нет выхода
и которые определяют судьбу клеток во время раз-
вития. Они продолжают катиться до тех пор, пока
не достигнут своего окончательного стабильного
состояния в самой нижней точке, функциональ-
но отождествившись с конечным дифференци-
рованным состоянием. Согласно этой метафоре
изменений в судьбе клеток следует строго избегать
с помощью горных хребтов, которые не позволяют
перемещаться из одной долины в другую. Откры-
тый нами метод создания in vitro плюрипотентных
клеток млекопитающих из дифференцированных
соматических клеток добавил свою лепту к сово-
купности прочих доказательств того, что эту догму
можно обратить вспять. Что еще более важно, это
доступный метод для изучения репрограммирова-
ния и эпигенетики (Takahashi and Yamanaka, 2006).
В прошлом неспособность передавать генети-
ческую информацию от соматических клеток сле-
дующему поколению обычно считалась барьером
Вейсмана. Однако недавние открытия показыва-
ют, что судьба клеток теперь представляется гораз-
до более гибкой, чем полагали ранее. Если оттал-
киваться от метафоры о ландшафте Уоддингтона,
омоложение можно отнести к процессу, при кото-
ром клетки возвращаются по своему пути созре-
вания, несмотря на неровности эпигенетического
ландшафта, чтобы приобрести большую степень
незрелости и в конечном итоге перейти в плюри-
потентное состояние (рис. 1Б).
Концепция омоложения и клеточного репрограм-
мирования была впервые предложена Джоном Гар-
доном в его знаменательных экспериментах по по-
лучению клонов из соматических клеток у Xenopus
laevis. Это произошло примерно в то же время, когда
пропагандировалась доктрина Уоддингтона (Gurdon
et al., 1958). Позже Ян Вилмут (Ian Wilmut) и его кол-
леги сообщили об успешном клонировании овцы
Долли, показав, что стирание эпигенетической
памяти, определяющей судьбу соматических кле-
ток, возможно даже у млекопитающих (Wilmut et al.,
1997). Омоложение клетки до плюрипотентного
состояния также было продемонстрировано путем
слияния соматических клеток с плюрипотентными
стволовыми клетками, такими как эмбриональные
стволовые (ES — embryonic stem) клетки (Tada et al.,
2001). Эти два подхода свидетельствовали о том,
что оплодотворенные яйцеклетки и плюрипотент-
ные стволовые клетки содержат скрытые «факторы
репрограммирования», которые способны стирать
соматическую память.
Другим исследованием, противоречащим мо-
дели однонаправленного эпигенетического ланд-
шафта Уоддингтона, была работа по изменению
судьбы клеток при помощи определенных факто-
ров, написанная 25 лет назад (Davis et al., 1987).
В своих новаторских исследованиях Davis et al. про-
вели эксперименты по вычитающей гибридизации
с использованием комплементарной ДНК (кДНК)
и выявили ген миогенной дифференцировки (myogenic
diff erentiation) 1 (MYOD1). Было достаточно
эктопической экспрессии всего лишь одного этого
белка MYOD1, чтобы вызвать превращение фибро-
бластов в миобласты, экспрессирующие миозин.
Эта новаторская работа ясно показала, что фактор
(факторы) транскрипции имеет решающее значение
не только для поддержания клеточной идентично-
сти, но и для определения судьбы клетки.
Опираясь на результаты этих исследований,
мы показали, что латентная плюрипотентность
может быть индуцирована в дифференцирован-
ных соматических клетках с помощью определен-
ного коктейля факторов транскрипции без необ-
ходимости переноса в яйцеклетку (Takahashi and
Yamanaka, 2006). Коктейль состоял из OCT3/4,
SOX2, KLF4 и c-MYC, и его было достаточно, что-
бы вернуть дифференцированные соматические
клетки, включая терминально дифференцирован-
ные, такие как Т-лимфоциты, к плюрипотентному
состоянию. Полученные дедифференцированные
клетки были обозначены как iPS-клетки, и их тео-
ретически можно использовать для генерации всех
типов клеток в организме, в том числе и ES-клеток.
Это открытие подтвердило важность сетей факто-
ров транскрипции в определении судьбы клеток
и окончательно повлияло на наше понимание кле-
точного репрограммирования.
Эффективность репрограммирования соматиче-
ских клеток в iPS-клетки обычно составляет менее
1 %. Это говорит о том, что для запуска изменений
важны не только факторы репрограммирования,
но и последующие стохастические события, необ-
ходимые для продолжения процесса репрограмми-
рования. Поскольку никаких серьезных различий
в геномных последовательностях между исходными
клетками и перепрограммированными iPS-клетками
не наблюдалось, изменения эпигенетического ста-
туса, такие как метилирование ДНК и модификация
гистонов, по-видимому, являются критическими
событиями для репрограммирования. Фактически
использование низкомолекулярных соединений,
которые ингибируют гистоновую деацетилазу, тем
самым увеличивая общий уровень ацетилирова-
ния хроматина, может улучшить эффективность
репрограммирования. Во время репрограммиро-
вания наблюдаются замолкание генов соматиче-
ских клеток и реактивация генов, экспрессируемых
плюрипотентными стволовыми клетками. Хотя эти
изменения явно связаны с эпигенетическими со-
стояниями, их механизмы и движущая сила все еще
неясны. Генерация iPS-клеток является хорошей
моделью и инструментом для понимания эпигене-
тических изменений, инициируемых факторами
транскрипции. Кроме того, технология iPS-клеток
в настоящее время применяется для исследований
в качестве как источника стволовых клеток для тера-
певтического использования, так и инструмента для
изучения патологических процессов.
После знаковых экспериментов, которые пока-
зали, что MYOD1 является главным детерминирую-
щим фактором, направляющим близкородственные
фибробласты в сторону развития по пути миобла-
стов, продолжается поиск других факторов, управ-
ляющих линиями развития конкретных клеток.
Наблюдались и другие относительно близкород-
ственные превращения, например из лимфоидных
клеток в миелоидные и из глиальных клеток в ней-
роны, при применении определенных факторов
транскрипции. Недавние сообщения также пока-
зали, что можно напрямую преобразовать сомати-
ческие клетки в более дистально отстоящие в линии
развития дифференцированные типы клеток и даже
выйти за пределы происхождения зародышевого
листка (например, энтодермы, мезодермы или экто-
дермы), что проиллюстрировано преобразованием
фибробластов в нейроны, клетки пути гематопоэза,
хрящевые клетки, кардиомиоциты и гепатоциты.
Все эти открытия устранили часть препятствий
на путях реализации судьбы клетки. Клеточная
идентичность явно оказалась более гибкой, чем счи-
талось ранее, и в значительной степени определя-
лась эпигенетическим статусом клетки.
ЛИТЕРАТУРА
Davis R., Weintraub H., Lassar A. B. 1987. Expression of a single
transfected cDNA converts fi broblasts to myoblasts. Cell
51: 987–1000.
Gurdon J. B., Elsdale T. R., Fischber M. 1958. Sexually mature
individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single
somatic nuclei. Nature 182: 64–65.
Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. 2001.
Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization
with ES cells. Curr. Biol. 11: 1553–1558.
Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem
cells from mouse embryonic and adult fi broblast cultures by
defi ned factors. Cell 126: 663–676.
Waddington C. H. 1957. The strategy of the genes. Allen & Unwin,
London.
Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J., Kind A. J., Campbell
K. H. 1997. Viable off spring derived from fetal and adult
mammalian cells. Nature 385: 810–813.
днкРНК: связывание РНК с хроматином
John L. Rinn
Harvard University, Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Cambridge, Massachusetts 02138
e-mail: john_rinn@harvard.edu
Многочисленные исследования, проведенные за по-
следнее десятилетие, выявили растущее количество
длинных некодирующих РНК (днкРНК, lncRNA —
long non-coding RNA) у многих организмов. Резуль-
таты проведенных с тех пор исследований показали,
что днкРНК составляют важный уровень регуляции
генома при различных биологических процессах и за-
болеваниях. Здесь мы обсуждаем общую, недавно
определившуюся тему взаимодействия днкРНК с эпи-
генетическим механизмом, что, в свою очередь, моду-
лирует активность и локализацию эпигенетического
аппарата во время спецификации судьбы клетки.
Идентичность клетки достигается за счет сложной
хореографии регуляторных элементов ДНК, взаи-
модействующих с белковыми регуляторными ком-
плексами, что порождает множество уникальных
эпигенетических ландшафтов. Обширные мас-
сивы эпигенетических ландшафтов образуются
с использованием повсеместно экспрессируемых
комплексов, модифицирующих и моделирующих
хроматин, чтобы дать начало бесчисленным уни-
кальным комбинациям посттрансляционных мо-
дификаций гистонов и паттернов метилирования
ДНК. Исследование этих процессов поднимает
извечный вопрос: каким образом ферментные
комплексы доставляют эти метки на определен-
ную комбинацию сайтов в различных условиях
существования клеток? Долгое время предпо-
лагалось, что некодирующие молекулы РНК мо-
гут обеспечивать некоторую специфичность для
нацеливания этих комплексов на сайты их дей-
ствия. В самом деле, становится все более очевид-
ным, что масса из тысяч длинных некодирующих
РНК (днкРНК, lncRNA — long non-coding RNA)
представляет собой ключевой уровень эпигенети-
ческого контроля (см. рис. 24 главы 3 [Allis et al.]).
Более 20 лет известен яркий пример основан-
ной на РНК эпигенетической регуляции, которая
действует при компенсации дозы генов у млеко-
питающих (глава 25 [Brockdorff and Turner, 2014]).
В частности, длинная межгенная некодирующая
РНК (lincRNA — long intergenic noncoding RNA),
называемая XIST (Х-неактивный специфический
транскрипт, X inactive-specifi c transcript), экспресси-
руется с одной женской X-хромосомы, что приводит
к рекрутированию комплексов группы Polycomb
(PcG), таких как PRC2, к этой хромосоме В резуль-
тате происходит сопутствующее замолкание тран-
скрипции на большей части Х-хромосомы. Другими
словами, один ген днкРНК способен нацелиться
на большую часть хромосомы и заставить ее гены
замолчать in cis. Это яркий прецедент для РНК-опо-
средованной эпигенетической регуляции. Однако
связь между РНК и рекрутированием PRC2 долгое
время была неуловимой. Ключ к разгадке был най-
ден при изучении эпигенетической динамики дру-
гой lincРНК, названной HOTAIR (антисмысловая
межгенная РНК Hox-транскрипта, Hox transcript
antisense intergenic RNA; Rinn et al., 2007). HOTAIR
экспрессируется с одного из четырех кластеров
факторов транскрипции HOX (HOXC — clusters
of HOX). Семейство белков HOX является ключевым
регулятором формирования плана тела организма
во время его развития. HOTAIR была идентифи-
цирована благодаря своему отличительному пат-
терну экспрессии в тканях передних и дистальных
органов мышей во время развития и в фибробластах
взрослых людей (Rinn et al., 2007). Интересно, что
экспрессия HOTAIR проводит четкую эпигенети-
ческую границу между эухроматиновыми и гетеро-
хроматиновыми районами в кластере HOXC. Более
того, эухроматин-гетерохроматиновые области
были инвертированы в клетках передних и дисталь-
ных органов; мы назвали эти области «диаметраль-
ными» хроматиновыми доменами. В совокупности
данные привели к первоначальной гипотезе, что
HOTAIR служит эпигенетической границей in cis
в кластере HOXC. К нашему удивлению, граница
HOXC-кластера в хроматине осталась неизменной,
когда функция РНК HOTAIR была утрачена; од-
нако кластер HOXD, расположенный на отдельной
хромосоме, стал активным. Таким образом, подоб-
но XIST, экспрессия HOTAIR из кластера HOXC
приводит к эпигенетическому замолканию, однако
кластер HOX, который она регулирует (HOXD), рас-
положен на другой хромосоме, то есть регулируется
in trans. Возникает вопрос: как?
Ответ был получен с помощью нескольких кри-
тических экспериментов, которые показали, что
lincРНК HOTAIR взаимодействует с PRC2 и что
это было необходимо для правильной локализа-
ции PRC2. Первый эксперимент с использованием
иммунопреципитации комплекса PRC2 идентифи-
цировал HOTAIR как физически связанную или со-
осажденную с PRC2 (Rinn et al., 2007). Реципрокный
эксперимент, в ходе которого были выделены белки,
связанные с транскриптом HOTAIR, также выявил
связь между HOTAIR и компонентами комплекса
PRC2, но не с другими регуляторными факторами
хроматина. Последним недостающим звеном была
демонстрация того, что взаимодействие РНК—белок
между HOTAIR и PRC2 необходимо для правиль-
ной локализации PRC2 в кластере HOXD. В самом
деле, недостаток HOTAIR приводит к неправильной
локализации PRC2 по отношению к кластеру HOXD
in trans и сопутствующей активации генов внутри
кластера HOXD. Взятые вместе, эти находки пока-
зали, что физическая ассоциация между HOTAIR
и PRC2 необходима для правильного направления
регуляторного аппарата хроматина к их целевым
сайтам. Таким образом, был однозначно выявлен
новый уровень модуляции эпигенетических ланд-
шафтов на основе РНК.
После обнаружения того факта, что PRC2 физи-
чески связывается с HOTAIR или XIST, направ-
ляя, таким образом, данный комплекс к специ-
фическим районам генома, было установлено,
что этот механизм, как было показано, применим
к многочисленным днкРНК, которые физически
ассоциируются с PRC2. Многие из этих ассоциа-
ций на самом деле необходимы для соответствую-
щей локализации эпигенетического регуляторно-
го аппарата in cis и in trans (рис. 1). Два независимых
исследования, в частности, выявили, что как
в клетках человека, так и в клетках мыши сотни
днкРНК, составляющие до 30 % транскриптома,
преципитируют вместе с PRC2. Более того, многие
из протестированных днкРНК, связанных с PRC2,
необходимы для правильной эпигенетической
и транскрипционной регуляции мишеней PRC2
(Khalil et al., 2009; Zhao et al., 2010). Далее этими ис-
следователями было отмечено, что одна РНК может
быть связана со многими разными регуляторными
белками хроматина, указывая тем самым, что она
может функционировать как мост из РНК между
множеством комплексов (Khalil et al., 2009). Дей-
ствительно, тщательный биохимический анализ
HOTAIR показал, что, помимо связывания с PRC2,
она также связывается с гистоновой деметилазой
LSD1 и NCOR (nuclear receptor corepressor, коре-
прессор ядерного рецептора). Это указало на су-
ществование новой модели эпигенетической регу-
ляции, в которой одиночная днкРНК рекрутирует
несколько синергетически функционирующих ре-
гуляторных комплексов хроматина. Это помогает
направлению данных комплексов к NCOR, сты-
ковке с этим ядерным рецептором и способствует
образованию гетерохроматина (LSD1 и PRC2).
В совокупности эти исследования привели к идее,
что РНК-скаффолд (РНК-каркас, на котором ас-
социированы различные белки) может связывать
многочисленные молекулы хроматина и допол-
нительные регуляторные комплексы для прида-
ния специфичности районам-мишеням в геноме
(рис. 1Г). Недавно было открыто, что сверхэкс-
прессия HOTAIR является маркером метастати-
ческого рака молочной железы (Gupta et al., 2010),
что подчеркнуло важность роли HOTAIR в эпи-
генетической регуляции. Фактически HOTAIR
служит «онко-днкРНК», индуцируя метастазы
при раке молочной железы вследствие сверхэкс-
прессии за счет ремоделирования эпителиального
эпигенома по аналогии с эпигеномом стромаль-
ных клеток. В совокупности уроки, извлеченные
из исследований HOTAIR за последние пять лет,
показали, что днкРНК играют критическую роль
во взаимодействии с комплексами хроматина и их
модуляции во время развития и болезни.
За 50 лет, прошедших с тех пор, как РНК была
идентифицирована как центральный компонент
потока генетической информации, становится все
более очевидным, что РНК — это больше чем про-
сто мессенджер: она выполняет обширные и раз-
нообразные функции (Amaral et al., 2008). Факти-
чески днкРНК составляют критический уровень
эпигенетической регуляции, в котором разные
днкРНК ассоциированы с различными эпигене-
тическими состояниями, но проявляют общий
механизм действия; они физически связаны с ком-
плексами, модифицирующими и моделирующими
хроматин, и направляют их к конкретным геном-
ным локусам, которые имеют решающее значение
для надлежащего исполнения той или иной кле-
точной функции. Однако это только один аспект
биологии днкРНК; существует множество дру-
гих функциональных ролей, которые они играют
в многочисленных биологических процессах, упо-
мянутых у Amaral et al. (2008).
ЛИТЕРАТУРА
* Ссылка на источник уже есть в этой книге.
Amaral P. P., Dinger M. E., Mercer T. R., Mattick J. S. 2008.
The eukaryotic genome as an RNA machine. Science 319:
1787–1789.
* Brockdorff N., Turner B. M. 2014. Dosage compensation
in mammals. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. doi: 10.1101/
cshperspect .a019406.
Gupta R. A., Shah N., Wang K. C., Kim J., Horlings H. M.,
Wong D. J., Tsai M. C., Hung T., Argani P., Rinn J. L.
et al. 2010. Long non-coding RNAHOTAIR reprograms
chromatin state to promote cancer metastasis. Nature 464:
1071–1076.
Khalil A. M., Guttman M., Huarte M., Garber M., Raj A.,
Rivea Morales D., Thomas K., Presser A., Bernstein B. E.,
van Oudenaarden A. et al. 2009. Many human large intergenic
noncoding RNAs associate with chromatin-modifying
complexes and aff ect gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci.
106: 11667–11672.
Rinn J. L., Kertesz M., Wang J. K., Squazzo S. L., Xu X., Brugmann
S. A., Goodnough L. H., Helms J. A., Farnham P. J.,
Segal E. et al. 2007. Functional demarcation of active and
silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding
RNAs. Cell 129: 1311–1323.
Tsai M. C., Manor O., Wan Y., Mosammaparast N., Wang J. K.,
Lan F., Shi Y., Segal E., Chang H. Y. 2010. Long noncoding
RNA as modular scaff old of histone modifi cation complexes.
Science 329: 689–693.
Zhao J., Ohsumi T. K., Kung J. T., Ogawa Y., Grau D. J., Sarma
K., Song J. J., Kingston R. E., Borowsky M., Lee J. T.
2010. Genome-wide identifi cation of polycomb-associated
RNAs by RIP-seq. Mol. Cell 40: 939–953.
Энхансерные РНК: класс длинных
некодирующих РНК, синтезированных
в энхансерах
Tae-Kyung Kim1, Martin Hemberg2 и Jesse M. Gray3
1 The University of Texas Southwestern Medical Center, Department of Neuroscience, Dallas, Texas 75390-9111;
2 Boston Children’s Hospital, Department of Ophthalmology, Boston, Massachusetts 02215;
3 Genetics Department, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115
e-mail: taekyung.kim@utsouthwestern.edu
Недавние исследования показали, что активные
энхансеры транскрибируются, образуя класс неко-
дирующих РНК, называемых энхансерными РНК
(эРНК). эРНК отличаются от длинных некодирующих
РНК (днкРНК), но эти два вида некодирующих РНК
могут играть сходную роль в активации транскрипции
мРНК. Новые исследования, демонстрирующие, что
эРНК функционируют, осуществляя контроль за тран-
скрипцией мРНК, ставят под сомнение идею о том, что
энхансеры являются просто участками сборки факто-
ров транскрипции. Вместо этого связь между промото-
рами и энхансерами может быть двунаправленной,
когда промоторы требуются для активации транскрип-
ции энхансера. В свою очередь, эРНК могут облегчить
взаимодействие энхансер—промотор или активиро-
вать транскрипцию, направляемую промотором.
За последние три десятилетия достаточно хорошо
был продемонстрирован функциональный вклад
энхансеров в экспрессию генов. Однако механизмы,
с помощью которых энхансеры влияют на экспрес-
сию генов, остаются малоизученными. Недавние
технологические достижения позволили наблюдать
в масштабе всего генома за молекулами и механиз-
мами, которые управляют функционированием
энхансера. Мы знаем, что энхансеры рекрутируют
генеральные коактиваторы, такие как p300/CBP,
которые демонстрируют общую сигнатуру хро-
матина. Эта сигнатура включает в себя высокие
уровни монометилирования гистона H3 по лизину
4 (H3K4me1), но низкие уровни промотор-специ-
фической метки H3K4me3 (рис. 1). С использова-
нием CBP и паттернов метилирования гистонов для
идентификации нейрональных энхансеров в на-
шем исследовании показано, что несколько тысяч
энхансеров могут рекрутировать РНК-полимера-
зу II (Pol II) и транскрибировать некодирующие
РНК при активации нейронов (Kim et al., 2010).
Транскрипты, которые мы назвали энхансерными
РНК (эРНК), с тех пор были обнаружены независи-
мыми исследователями во многих различных типах
и видах клеток, свидетельствуя о том, что синтез
эРНК не уникален для нейронов, а скорее является
универсальным клеточным механизмом, участвую-
щим в управлении функцией энхансера.
Энхансерные РНК четко отличаются от кано-
нических длинных некодирующих РНК (днкРНК),
функции которых лучше охарактеризованы. Первое
отличие состоит в том, что, хотя днкРНК в широ-
ком смысле идентифицировались по присутствию
H3K4me3 на их промоторах, эРНК могут быть по-
лучены от энхансеров без детектируемых уровней
H3K4me3. Это различие может иметь место из-за
того, что уровни экспрессии эРНК в 10–100 раз
ниже, чем в случае днкРНК, поскольку уровни
H3K4me3 обычно коррелируют с уровнем экспрес-
сии генов. Во-вторых, в отличие от промоторов
днкРНК и генов, кодирующих белки, энхансеры
демонстрируют небольшое смещение в направле-
нии инициации транскрипции. В-третьих, тогда как
днкРНК подвергаются процессам созревания, таким
как сплайсинг и полиаденилирование, эРНК короче
(менее 2 килобаз), хотя присутствуют доказатель-
ства небольшого сплайсинга и полиаденилирова-
ния. Отсутствие полиаденилирования было сделано
на основании того факта, что эРНК были впервые
обнаружены при анализе общей клеточной РНК
(с использованием процедуры секвенирования то-
тальной РНК (РНК-seq)) в нейронах, но не наблю-
дались в полиаденилированной РНК (с использова-
нием секвенирования мРНК (мРНК-seq)). Однако
о полиаденилированных эРНК сообщалось (или
предполагалось) из анализа других типов не ней-
рональных клеток. Несмотря на некоторые из этих
различий между стереотипными эРНК и днкРНК,
мы и другие исследователи наблюдали относительно
небольшое количество геномных локусов, которые
было нелегко классифицировать как энхансеры
или промоторы днкРНК из-за присутствия меток
H3K4me3 и H3K4me1. Эти локусы могут представ-
лять отдельный класс энхансеров или указывать
на то, что принятая идентификация энхансера
и промотора применима лишь в определенной сте-
пени. Различие между энхансером и промотором
может быть просто количественным, касающимся
уровней экспрессии транскриптов. Действительно,
сообщалось, что промоторы, кодирующие белок,
действуют как энхансеры, регулируя другие близ-
лежащие промоторы.
Главный вопрос, поднятый открытием эРНК,
связан с тем, вносит ли транскрипционная актив-
ность энхансеров вклад в их функцию. Несколько
линий косвенных доказательств предполагают, что
синтез эРНК — это регулируемый процесс, а не
просто транскрипционный шум. При нейрональ-
ной стимуляции только часть энхансеров продуци-
рует эРНК, и эта часть, как правило, расположена
рядом с довольно активно индуцируемыми мРНК
(Kim et al., 2010). Основываясь на этом наблюде-
нии, мы предполагаем, что энхансеры, продуци-
рующие эРНК, активно участвуют в стимулирова-
нии экспрессии генов-мишеней в ответ на передачу
сигналов, индуцируемую стимулом. Эта гипотеза
была подтверждена коррелятивными исследова-
ниями эРНК в различных типах клеток. Более того,
кинетический анализ эРНК в макрофагах, акти-
вированных липополисахаридами (ЛПС), пока-
зал, что синтез эРНК предшествует транскрипции
соседних генов, кодирующих белок, что указывает
на активную роль эРНК в регуляции гена-мишени.
Этот факт получил дополнительное подтвержде-
ние в недавней работе по изучению днкРНК чело-
века с помощью нокдауна, вызываемого миРНК
(малые интерферирующие РНК, small interfering
RNA). Данное исследование позволило сделать
вывод о том, что днкРНК вносят вклад в активацию
окружающих белок-кодирующих мРНК (Lai et al.,
2013). Хотя не было ясно показано, происходят ли
днкРНК с энхансер-подобной функцией из энхан-
серных областей, эти днкРНК из базы последова-
тельностей GENCODE отличаются от эРНК тем,
что они обычно в результате процессинга подвер-
гаются сплайсингу и полиаденилированию, а также
имеют высокие уровни H3K4me3 на своих про-
моторах. Тем не менее комбинация этих двух неза-
висимых открытий — эРНК, получаемая из функ-
ционально определенных энхансеров, и днкРНК,
демонстрирующая функцию, подобную энхансе-
ру, — предполагает, что участки генома, не коди-
рующие белки, могут продуцировать транскрипты
со специфическими регуляторными функциями
и играть более активную роль в экспрессии генов,
чем предполагалось ранее.
В поддержку этого вывода недавние исследования
предоставили более прямые доказательства, демон-
стрирующие, что по крайней мере некоторые эРНК
функционально важны для экспрессии генов-ми-
шеней. Нокдаун нескольких эРНК вызывает сниже-
ние экспрессии близлежащих генов-мишеней (Lam
et al., 2013; Li et al., 2013; Melo et al., 2013). Кроме
того, искусственная вставка эРНК перед минималь-
ным промотором в репортерной системе на основе
плазмиды усиливает экспрессию репортерного гена.
Эти результаты согласуются с предполагаемой ро-
лью эРНК в активации транскрипции. Интересно,
что активирующая функция эРНК, по-видимому,
является специфичной по отношению к последо-
вательности или цепи, хотя критические детерми-
нанты этой специфичности не были идентифици-
рованы (Lam et al., 2013). В других экспериментах
на клетках раковых опухолей молочной железы
человека РНК, экспрессируемые с энхансеров, свя-
занных с рецептором α-эстрогена (ER-α), увели-
чивают силу специфического образования петель
между энхансером и промотором, частично за счет
взаимодействия с когезином (Li et al., 2013). Было
также показано, что днкРНК с энхансер-подобной
функцией, упомянутые выше, опосредуют образо-
вание петель в хроматине, но путем взаимодействия
с медиаторным комплексом (Lai et al., 2013).
Хотя эти результаты в совокупности подтверж-
дают, что образование петель хроматина явля-
ется важным регуляторным этапом, с помощью
которого обычно действуют эти отдельные классы
активирующих днкРНК (см. рис. 1), у эРНК мо-
гут быть и другие функции. Наше исследование,
сосредоточенное на нейрональном гене Arc и энхан-
сере, связанном с ним, показало, что синтез эРНК
требует присутствия интактного промотора гена
Arc (Kim et al., 2010); то есть детектируемые уровни
эРНК не синтезируются при делеции промотора
гена Arc, хотя РНК Pol II и факторы транскрипции
все еще связываются с энхансером. Одним возмож-
ным объяснением может быть то, что без промотора
в энхансере Arc отсутствует неизвестный фактор,
необходимый для его собственной транскрипцион-
ной активности. Такой неизвестный фактор может
присутствовать на промоторе и обеспечивать син-
тез эРНК на энхансере только тогда, когда энхансер
находится в непосредственной близости от промо-
тора, посредством механизма образования петель.
Эти результаты бросают вызов стандартной модели
однонаправленных взаимодействий энхансер—
промотор, в которых энхансеры действуют на про-
моторы. Вместо этого для активации энхансера
и промотора может потребоваться обратная связь,
при которой каждый из элементов белкового ком-
племента необходим для активации другого. В этом
сценарии маловероятно, что образование петель
хроматина полностью обеспечивается эРНК, по-
скольку ее синтез может происходить только после
образования петель между энхансером и промото-
ром. Выпетливание хроматина также удерживало бы
образующиеся эРНК в непосредственной близости
от промоторов-мишеней, потенциально обеспечи-
вая элегантный способ предотвращения активации
неспецифических генов-мишеней посредством
данных эРНК. Затем формирующийся транскрипт
эРНК может способствовать привлечению акти-
ваторов к промотору, действуя как скаффолд для
собирания активирующих белков. Поскольку эРНК
обычно нестабильны, специфичность функции
эРНК будет частично определяться их коротким
периодом полужизни, предотвращая неспецифи-
ческую активацию вне локального сайта синтеза
эРНК после его завершения. Также необходимо
указать, что акт транскрипции эРНК, в дополнение
к самому транскрипту эРНК, может иметь специ-
фическую биологическую функцию. Например,
задействованная в транскрипции РНК-полимераза
II может рекрутировать модификаторы хроматина
на энхансеры, стабилизируя энхансерный домен
в активном состоянии.
Открытие новых функциональных ролей эРНК,
безусловно, расширяет растущую регуляторную
способность некодирующих РНК. Эти результаты
не только иллюстрируют более сложную роль цис-
регуляторных последовательностей, чем считалось
ранее, но также предоставляют большие возможно-
сти для будущих исследований в раскрытии сложных
уровней генной регуляции, в которых переплетают-
ся днкРНК, цис-регуляторные последовательности,
эпигенетические модификации и трехмерная кон-
фигурация хроматина.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим докторов наук М. Э. Гринберга
(M. E. Greenberg) и Г. Креймана (G. Kreiman) за их
руководство и поддержку. Эта работа была поддер-
жана Фондом Уайтхолла (T-K.K.), Фондом Уэлча
(T-K.K.) и Фондом Клингенштейна (T-K.K.).
ЛИТЕРАТУРА
Kim T. K., Hemberg M., Gray J. M., Costa A. M., Bear D. M.,
Wu J., Harmin D. A., Laptewicz M., Barbara-Haley K.,
Kuersten S. et al. 2010. Widespread transcription at neuronal
activity-regulated enhancers. Nature 465: 182–187.
Lai F., Orom U. A., Cesaroni M., Beringer M., Taatjes D. J.,
Blobel G. A., Shiekhattar R. 2013. Activating RNAs associate
with Mediator to enhance chromatin architecture and
transcription. Nature 494: 497–501.
Lam M. T., Cho H., Lesch H. P., Gosselin D., Heinz S., Tanaka-
Oishi Y., Benner C., Kaikkonen M. U., Kim A. S., Kosaka
M. et al. 2013. Rev-Erbs repress macrophage gene expression
by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature
498: 511–515.
Li W., Notani D., Ma Q., Tanasa B., Nunez E., Chen A. Y.,
Merkurjev D., Zhang J., Ohgi K., Song X. et al. 2013. Functional
roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional
activation. Nature 498: 516–520.
Melo C. A., Drost J., Wij chers P. J., van de Werken H.,
de Wit E., Oude Vrielink J. A., Elkon R., Melo S. A., Leveille
N., Kalluri R. et al. 2013. eRNAs are required for 53-dependent
enhancer activity and gene transcription. Mol. Cell
49: 524–535.
Расширение эпигенетического ландшафта:
новые модификации цитозина в геномной
ДНК
Skirmantas Kriaucionis1 и Mamta Tahiliani2
1 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd., University of Oxford, Nuffi eld Department of Clinical Medicine, Old Road
Campus Research Building, Headington, Oxford OX3 7DQ, United Kingdom;
2 Skirball Institute / NYU School of Medicine, New York, New York 10016
e-mail: mamta.tahiliani@med.nyu.edu
Метилирование оснований цитозина в ДНК имеет
решающее значение для замолкания активности
эндогенных ретровирусов, регулирования экспрес-
сии генов и установления клеточной идентичности,
поэтому оно долгое время считалась неотъемлемой
эпигенетической меткой. Недавно было установ-
лено, что белки транслокации десять-одиннадцать
(TET — ten eleven translocation) могут окислять 5-ме-
тилцитозин (5mC — 5-methylcytosine), что, в свою
очередь, приводит к образованию 5-гидроксиметил-
цитозина (5hmC — 5-hydroxymethylcytosine) и других
окисленных вариантов цитозина в геноме. Это от-
крытие вызвало сдвиг парадигмы в нашем понима-
нии того, каким образом динамические изменения
в метилировании ДНК регулируют транскрипцию
и клеточную дифференцировку, тем самым влияя
на нормальное развитие и болезненные состояния.
Метилирование оснований цитозина (называе-
мого 5-метилцитозином, или 5mC) является эпи-
генетической меткой, которую часто называют
пятым основанием, чтобы подчеркнуть его насле-
дуемость и важность в развитии. 5mC считается
эпигенетической меткой, потому что он управляет
биологической функцией (то есть репрессией тран-
скрипции) без изменения способности кодирова-
ния белка локальной последовательности ДНК,
состоящей из определенной комбинации четырех
стандартных нуклеотидных оснований. 5mC жиз-
ненно важен для различных процессов, включая
эмбриогенез, родительский импринтинг, инакти-
вацию X-хромосомы, замолкание эндогенных ре-
тровирусов, а также регуляцию генной экспрессии
и сплайсинга. Метилирование цитозина влияет
на эти процессы как путем модуляции взаимодей-
ствий белок-ДНК, так и за счет образования зачат-
ков репрессивных гетерохроматиновых структур.
В 2009 году 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) был
одновременно идентифицирован двумя исследо-
вательскими группами как нормальный компо-
нент геномной ДНК в нейронах млекопитающих
и эмбриональных стволовых (ES — embryonic stem)
клетках (Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al.,
2009). Это знаменательное открытие стимулиро-
вало огромное количество исследований, направ-
ленных на понимание того, как эта модификация
оказывает свое влияние на регуляцию генома
и как она связана с путем деметилирования 5mC,
который ранее не был обнаружен у ферментов.
5hmC был случайно идентифицирован в лабора-
тории Натаниэля Хайнца (Nathaniel Heintz), когда
Скирмантас Криаучионис (Skirmantas Kriaucionis)
выделил хроматин из ярко выраженных эухромати-
новых ядер мозжечковых нейронов Пуркинье. Вы-
деление ядер из клеток Пуркинье само по себе было
техническим достижением, требующим использо-
вания трансгенных мышей с ядрышками, мечены-
ми eGFP (bacTRAP), и высокопроизводительного
флюоресцентно-активируемого сортинга клеток,
чтобы получить достаточно материала для анализов.
Цель состояла в том, чтобы сравнить содержание
5mC в клетках Пуркинье с гранулированными клет-
ками, используя классический метод анализа соста-
ва «ближайшей соседней» ДНК, восходящий к клас-
сическим экспериментам Корнберга (Kornberg)
1961 года и использованный в новаторских экспери-
ментах Адриана Берда (Adrian Bird) по количествен-
ной оценке глобальных уровней метилированных
CpG. Беспристрастный и надежный метод выявил
дополнительный сигнал, который был воспроизво-
димо богаче представлен в нейронах Пуркинье и об-
наруживался в других типах нейрональных клеток.
Самой захватывающей фазой этих экспериментов
было определение сигнала как 5hmC, новой моди-
фикации основания в геномной ДНК (Kriaucionis
and Heintz, 2009).
5hmC был одновременно открыт Мамтой Тахи-
лиани (Mamta Tahiliani) в лаборатории Анджаны
Рао (Anjana Rao), когда ее поиски ДНК-деметилазы
приняли неожиданный поворот. Поиск такого фер-
мента был в первую очередь мотивирован демон-
страцией активной ликвидации метилирования
ДНК в родительском геноме сразу после оплодо-
творения. Это многообещающее открытие сильно
свидетельствовало в пользу того, что снятие паттер-
нов метилирования может быть критическим для
эпигенетического репрограммирования (как про-
иллюстрировано на рис. 3 главы 15 [Li and Zhang,
2014]). Сотрудник Мамты в области биоинформа-
тики Л. Аравинд (L. Aravind) предсказал, что семей-
ство белков ТЕТ представляет собой диоксигеназы
со специфичностью к нуклеиновым кислотам. Не-
давно было показано, что отдаленно родственные
диоксигеназы удаляют метильные группы как с ги-
стонов, так и с оснований поврежденной ДНК. Сле-
довательно, белки TET были чрезвычайно привле-
кательными кандидатами на роль ДНК-деметилазы.
В своих начальных экспериментах Мамта обнару-
жила, что сверхэкспрессия TET1 снижает уровни
5mC, детектируемые благодаря иммунофлуорес-
ценции, что указывает на то, что TET1 действует
как истинная ДНК-деметилаза. Однако ее попытки
подтвердить деметилирование с помощью тонко-
слойной хроматографии дали неожиданные резуль-
таты, потому что снижение уровня 5mC не сопро-
вождалось прогнозируемым увеличением цитозина.
Однако, отрегулировав контраст на отсканирован-
ном изображении, она заметила, что то, что казалось
слабым шмером (пятном) под цитозином, приняло
форму независимого пятна, свидетельствуя о том,
что TET1 может преобразовывать 5mC в новый вид
нуклеотида. Поскольку многие диоксигеназы ини-
циируют катализ, гидроксилируя свои субстраты,
Мамта предположила, а затем подтвердила, что этот
нуклеотид был 5hmC. Исследователи также пока-
зали, что 5hmC присутствует в геноме ES-клеток
и что уровни TET1 и 5hmC снижаются при диф-
ференцировке ES-клеток. Это указывало на то, что
5hmC является обычным компонентом ДНК мле-
копитающих и что TET-белки и 5hmC играют важ-
ную роль в регуляции экспрессии генов и клеточной
идентичности в ES-клетках (Tahiliani et al., 2009).
Последующие исследования в нескольких лабора-
ториях установили, что каждый член семейства TET
(TET1 / TET2 / TET3) способен преобразовывать
5mC в 5hmC (Wu and Zhang, 2011). Однако исследо-
вания на мышах показали, что Tet3 является един-
ственным членом семейства TET, необходимым
in vivo для нормального развития.
Открытие окисления 5mC до 5hmC ферментами
семейства TET подняло вопрос о том, являлось
ли полное деметилирование ДНК от 5hmC до C
пассивным (то есть производимым путем разбав-
ления после каждого репликационного цикла или
активно катализируемым). Ферменты семейства
ТЕТ продемонстрировали последовательное окис-
ление 5hmC до 5-формилцитозина (5fC — 5-formylcytosine)
и 5-карбоксилцитозина (5acC — 5-carboxylcytosine),
что описано в обзоре Wu и Zhang
(2011). Быстрая потеря 5mC в родительском геноме
совпадает с транслокацией TET3 в ядро и крупно-
масштабным превращением 5mC в 5hmC, 5fC
и 5caC (Wu and Zhang, 2011). Иммуноокрашивание
хроматина в метафазе также продемонстрировало,
что все три окисленных производных 5mC боль-
шей частью сохраняются на исходных нитях ДНК
и пассивно разбавляются репликацией во время
ранних циклов расхождения нитей, что указывает
на то, что TET-опосредованное окисление 5mC мо-
жет стимулировать пассивную потерю продуктов
окисления 5mC через циклы репликации. Альтер-
нативно или даже одновременно 5fC и 5caC могут
быть ДНК-гликозилатом тимина (TDG — thymine
DNA glycosylate) и их можно заменить цитозином
посредством эксцизионной репарации оснований
(рис. 1А) (Wu and Zhang, 2011; рис. 6 в главе 15 [Li
and Zhang, 2014]). Когда и где в геноме действуют
эти механизмы, остается предметом активных
исследований.
Понимание биологической функции 5hmC
потребовало разработки инновационных инстру-
ментов для его обнаружения и однозначного уста-
новления его отличия от 5mC и C. Теперь ясно, что
бисульфитное секвенирование не может отличить
5hmC от 5mC, также оно неверно интерпретирует
5fC и 5caC как цитозин (Pastor et al., 2013). Поэтому
важно отметить, что данные, полученные за десяти-
летия бисульфитного секвенирования, следует ин-
терпретировать с осторожностью, поскольку «мети-
лирован» может быть либо 5mC, либо 5hmC, тогда
как позиции, ранее идентифицированные как пози-
ции цитозина, могут фактически содержать 5fC или
5caC. В настоящее время разработан ряд методов
для обогащения 5hmC-содержащей ДНК и совсем
недавно — для ее секвенирования с разрешением
до одного нуклеотида (Pastor et al., 2013).
Многочисленные доказательства указывают
на то, что 5hmC является не просто промежуточ-
ным продуктом деметилирования, а скорее новой
модификацией ДНК со своей собственной эффек-
торной программой. 5hmC присутствует в различ-
ных типах зрелых клеток взрослых организмов,
и его уровни колеблются от 0,05 % всех оснований
в некоторых иммунных клетках до 0,6 % в клетках
Пуркинье. Это приводит к вопросу о том, сущест-
вуют ли считыватели этой метки, способные пре-
образовать присутствие этой модификации в био-
логическую функцию, как, например, в случае,
когда неметилированные цитозины могут «счи-
тываться» белками, содержащими домен CXXC
(см. главу 2 [Blackledge et al., 2013]), или когда ме-
тилированные CpG распознаются белками MBD.
Уже идентифицирован ряд белков, связывающих-
ся с 5hmC, включая MeCP2, MBD3 и Uhrf2, кото-
рые, как известно, регулируют транскрипцию.
Связанные с 5fC и 5caC белки включают ряд ДНК-
репарационных белков, что согласуется с ролью
этих модификаций в качестве промежуточных
продуктов деметилирования.
Тип клетки, стадия развития и специфическое
распределение 5hmC по геномному локусу пред-
полагают особые функции этой модификации
ДНК. Методы обогащения 5hmC, а также методы
однонуклеотидного секвенирования показали, что
в ES-клетках уровни 5hmC повышены на энхан-
серах и промоторах, содержащих CpG-островки
(CGI), которые не подвергаются метилированию,
несмотря на высокое содержание CpG (Pastor et al.,
2013). В нейрональных клетках 5hmC обильно пред-
ставлен в последовательностях собственно генов
(рис. 1Б, В) (Mellén et al., 2012; Pastor et al., 2013).
Хотя в ES-клетках также было отмечено обогащение
кодирующих последовательностей генов 5hmC, од-
нонуклеотидные методы не подтвердили это откры-
тие. Было высказано предположение, что белки се-
мейства TET и 5hmC играют роль в предохранении
CGI от метилирования в ES-клетках, тогда как
функция 5hmC в кодирующей последовательности
собственно генов в нейрональных клетках все еще
остается неясной.
В будущих исследованиях необходимо изучить
точную функцию 5hmC в процессах раннего разви-
тия, гематопоэза и функциях нейронов. Будет инте-
ресно узнать, способна ли единая модель объяснить
функцию 5hmC во всех типах клеток или его функ-
ция будет варьироваться в каждом исследуемом типе
клеток.
ЛИТЕРАТУРА
* Ссылка на источник уже есть в этой книге.
* Blackledge N. P., Thomson J. P., Skene P. J. 2013. CpG island
chromatin is shaped by recruitment of ZF-CxxC proteins.
Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5: a018648.
Kriaucionis S., Heintz N. 2009. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine
is present in Purkinje neurons and the
brain. Science 324: 929–930.
* Li E., Zhang Y. 2014. DNA methylation in mammals. Cold
Spring Harb. Perspect. Biol. 6: a019133.
Mellén M., Ayata P., Dewell S., Kriaucionis S., Heintz N.
2012. MeCP2 binds to 5hmC enriched within active genes
and accessible chromatin in the nervous system. Cell 151:
1417–1430.
Pastor W. A., Aravind L., Rao A. 2013. TETonic shift: Biological
roles of TET proteins in DNA demethylation and transcription.
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14: 341–356.
Tahiliani M., Koh K. P., Shen Y., Pastor W. A., Bandukwala H.,
Brudno Y., Agarwal S., Iyer L. M., Liu D. R., Aravind L.
et al. 2009. Conversion of 5- methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine
in mammalian DNA by MLL partner TET1.
Science 324: 930–935.
Wu H., Zhang Y. 2011. Mechanisms and functions of Tet protein-
mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25:
2436–2452.
Мобильные малые РНК растений
Patrice Dunoyer1, Charles Melnyk2, Attila Molnar3 и R. Keith Slotkin4
1 IBMP-CNRS, 67084 Strasbourg Cedex, France;
2 The Sainsbury Laboratory, University of Cambridge, Cambridge CB2 1LR, United Kingdom;
3 Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge CB2 3EA, United Kingdom;
4 Department of Molecular Genetics and Center for RNA Biology, The Ohio State University,
Columbus, Ohio 43210
e-mail: patrice.dunoyer@ibmp-cnrs.unistra.fr
У растений сайленсинг посредством РНК является
фундаментальным регулятором экспрессии генов,
образования гетерохроматина, подавления мобиль-
ных элементов и защиты от вирусов. Специфичность
этих процессов, привязанная к последовательности,
основывается на молекулах малых некодирующих
РНК (мнРНК, sRNA — small noncoding RNA). Хотя
распространение сайленсинга посредством РНК
среди всех клеток и тканей растения было установ-
лено в течение почти двух десятилетий, только не-
давно мнРНК были формально продемонстрированы
в качестве мобильных сигналов сайленсинга. Здесь
мы обсуждаем различные типы мобильных молекул
мнРНК, их ближние и дальние перемещения, а так-
же их функцию в клетках-реципиентах.
Сайленсинг посредством РНК — это регулятор-
ный механизм, который контролирует экспрессию
эндогенных генов и экзогенных молекулярных
паразитов, таких как вирусы, трансгены и мобиль-
ные генетические элементы. Одним из наиболее
интересных аспектов сайленсинга посредством
РНК, обнаруживаемого у растений и беспозво-
ночных, является его подвижная природа, дру-
гими словами, его способность распространяться
от клетки, в которой он был инициирован, к сосед-
ним клеткам. Этот феномен основан на перемеще-
нии малых некодирующих молекул РНК (мнРНК,
21–24 нуклеотидов в длину), которые обеспечи-
вают специфичность последовательности при эф-
фектах сайленсинга (замолкания). У растений су-
ществуют два основных класса мнРНК: короткие
интерферирующие РНК (киРНК) и микроРНК.
Эти мнРНК генерируются различными и иногда
взаимодействующими биохимическими путями,
которые могут влиять на их подвижность. Пере-
мещение растительных мнРНК делится на две
основные категории: от клетки к клетке (ближнее)
и системное (дальнее) (Melnyk et al., 2011).
ДАЛЬНИЕ ПЕРЕМЕЩЕНИЯ МАЛЫХ РНК
Первый намек на мобильную природу сайленсинга
посредством РНК у растений был сделан в иссле-
дованиях табака, продемонстрировавших локализо-
ванный сайленсинг трансгена, который передавался
во вновь образующиеся ткани в соответствии с пат-
терном сосудистого транспорта (рис. 1). Существо-
вание сигнальной молекулы для РНК-сайленсинга
было позже подтверждено у растений элегантными
экспериментами с прививками (Melnyk et al., 2011).
Эти исследования продемонстрировали, что сигнал
сайленсинга, исходящий от «замолчавшего» транс-
генного подвоя, распространяется на большие рас-
стояния через сосудистую сеть и может запускать
de novo сайленсинг гомологичного трансгена в от-
даленно расположенных тканях растения. Однако
идентификация сигнала системного сайленсинга
заняла несколько лет и только недавно была окон-
чательно определена благодаря возможностям высо-
копроизводительного секвенирования в сочетании
с экспериментами по микропрививке арабидопсиса
(Dunoyer et al., 2010a; Molnar et al., 2010). Обнару-
жение как трансгенных, так и эндогенных киРНК
в тканях привоя с тройным мутантом по гену рибону-
клеазы Dicer (который является дефектным по био-
генезу киРНК) подтвердило, что киРНК, в отличие
от их транскриптов-предшественников, являются
мобильным сигналом сайленсинга на больших рас-
стояниях. Эти эксперименты также продемонстри-
ровали, что мобильные киРНК способны направлять
de novo метилирование на целевых локусах, находя-
щихся на больших расстояниях, с помощью РНК-
направленного метилирования ДНК (Dunoyer et al.,
2010a; Molnar et al., 2010). Интересно, что только
одна треть локусов с эндогенными киРНК в геноме
у арабидопсиса генерирует мобильные киРНК, что
указывает на сложный процесс формирования кана-
лов, лежащий в основе их мобильности.
КОРОТКИЕ ПЕРЕМЕЩЕНИЯ ОТ КЛЕТКИ
К КЛЕТКЕ
После локальной индукции сайленсинг посред-
ством РНК распространяется от места инициации
к окружающим 10–15 соседним клеткам (см. рис. 1).
Это движение от клетки к клетке, вероятно, происхо-
дит через плазмодесмы (поры, соединяющие клетки
растений), поскольку клетки без плазмодесм устой-
чивы к сигналам мобильного сайленсинга. Иногда
сайленсинг посредством РНК может быть ампли-
фицирован (каскадно размножен) путем преобразо-
вания РНК-мишени в новую двухцепочечную РНК
(дцРНК, double-stranded RNA) с помощью РНК-
зависимой РНК-полимеразы RDR6 и продукции
вторичных киРНК (Melnyk et al., 2011). Этот процесс
амплификации, известный как «транзитивность»
(см. рис. 1), приводит к более широкому распростра-
нению сайленсинга от клетки к клетке посредством
повторяющихся событий передачи сигналов на ко-
роткие расстояния. Для идентификации белков,
необходимых для биогенеза, движения или восприя-
тия сигнала сайленсинга от клетки к клетке, были
разработаны конкретные генетические скрининги
(Melnyk et al., 2011). В этих системах был идентифи-
цирован Dicer-подобный белок 4 (DCL4 — Dicerlike-
4), связанный с перемещением сайленсинга
на короткие расстояния, что указало на ключевую
роль генерируемых с помощью DCL4 21-нуклеотид-
ных киРНК. Впоследствии эти 21-нуклеотидные
киРНК были непосредственно идентифицированы
как сигнал сайленсинга, передаваемый от клетки
к клетке, для чего использовалась комбинация си-
стем с трансгеном-репортером, вирусных супрессо-
ров РНК-сайленсинга, которые специфически ней-
трализуют 21-нуклеотидные киРНК, и экзогенного
применения (бомбардировки) флуоресцентно мече-
ных 21-нуклеотидных киРНК (Dunoyer et al., 2010b).
Помимо DCL4, перемещение сайленсинга от клетки
к клетке нарушают несколько мутаций в пути РНК-
направленного метилирования ДНК, но этот меха-
низм еще нуждается в прояснении.Следует отме-
тить, что бомбардировка 24-нуклеотидными киРНК,
ассоциированными с РНК-направленным путем
метилирования ДНК, распространяется до той же
степени, что и бомбардировка 21-нуклеотидными
киРНК, что указывает на мобильность обоих классов
РНК (Dunoyer et al., 2010a, 2010b).
ФУНКЦИИ ПЕРЕМЕЩЕНИЯ МАЛЫХ РНК
Паттерны развития
Мобильные малые РНК у растений образуются
из эндогенных или экзогенных источников не-
сколькими путями. Во время развития дикого
типа движение мРНК устанавливает градиенты
концентраций целевых мРНК, используемых для
определения паттернов развития. Например, пе-
ремещение эндогенных киРНК, состоящих из 21
пары нуклеотидов, от верхушки листьев, где они
образуются, к нижним слоям клеток генерирует
градиент, функция которого заключается в уста-
новлении паттерна формирования листа — от вер-
хушки к основанию (Melnyk et al., 2011). Неко-
торые микроРНК также мобильны. Например,
miR165/166 продуцируется в определенных клет-
ках корня и перемещается в соседние клетки, где
она нацеливается на мРНК, кодирующие несколь-
ко факторов транскрипции. Результирующий
градиент мРНК-мишени определяет типы сосу-
дистых клеток (Melnyk et al., 2011). Интересно, что
некоторые микроРНК также могут перемещаться
на большие расстояния в растениях. При фосфат-
ном голодании одна микроРНК перемещается
из верхушки растения в корень, где она разрушает
свою мРНК-мишень, которая кодирует супрессор
поглощения фосфата (Melnyk et al., 2011).
Вирусная устойчивость
Поскольку вирусы являются потенциальными
триггерами сайленсинга посредством РНК в ин-
фицированных клетках, они также представляют
собой огромные источники мобильных малых
РНК. Эти полученные из вируса киРНК могут пе-
ремещаться как от клетки к клетке, так и системно,
опережая фронт инфекции, и запускают антиви-
русную реакцию сайленсинга в интактных клет-
ках, которые еще не инфицированы. Этот эффект
был продемонстрирован с использованием вируса,
дефектного по функции перемещения и несущего
фрагмент эндогенного гена. Хотя инфицирование
этим вирусом ограничивалось нижними листь-
ями, он запускал замолкание эндогенного гена
внутри и вокруг не защищенных от него сосуди-
стых частей растения. Кроме того, вирусные су-
прессоры сайленсинга посредством РНК, которые
специфически нейтрализуют киРНК, необходимы
для успешного инфицирования соседних клеток
(Dunoyer et al., 2010b; Melnyk et al., 2011).
Эпигенетические изменения
Работа с вирусами свидетельствует о том, что сигна-
лы мобильного сайленсинга могут направлять эпи-
генетические изменения. После инфицирования
РНК-вирусом сайленсинг может возникать у от-
дельного растения, стабильно трансформированно-
го трансгеном, не обладающим гомологией с после-
довательностями данного вируса. Такой сайленсинг
проявляется как метилирование ДНК на промоторе
трансгена и передается последующим поколениям
в отсутствие вируса, демонстрируя наследуемый
эпигенетический сайленсинг (Melnyk et al., 2011).
Также известно, что наследственный эпигенетиче-
ский сайленсинг происходит в эндогенных мобиль-
ных генетических элементах (TE — transposable elements).
У арабидопсиса TE активируются в клетках,
которые соседствуют со сперматозоидами и клетка-
ми эмбриона, становясь источником киРНК (Slotkin
et al., 2009). Активация ТЕ в этих клетках совпадает
с соответствующим увеличением метилирования
ДНК в сперматозоидах и эмбрионе, свидетельствуя,
что ТЕ киРНК могут перемещаться в соседние гаме-
ты и развивающийся в последующем эмбрион и уси-
ливать РНК-направленное метилирование ДНК
и сайленсинг ТЕ, сохраняющийся в череде поколе-
ний (Slotkin et al., 2009). Однако прямое перемеще-
ние эндогенных ТЕ киРНК в гаметы или эмбрион
не было продемонстрировано.
ПЕРЕМЕЩЕНИЕ МАЛЫХ РНК В ДРУГИЕ
ОРГАНИЗМЫ
В качестве интересного наблюдения следует от-
метить способность мобильных сигналов сай-
ленсинга перемещаться за пределы растений.
Замолчавшие на уровне РНК трансгены, экспрес-
сирующиеся в растении, могут подавлять экспрес-
сию комплементарных генов у грибных и беспо-
звоночных патогенов, которые питаются тканями
растений (Melnyk et al., 2011). Сигналы подавления
трансгенной РНК могут также передаваться меж-
ду несколькими растениями через соединяющее
их паразитическое растение (Melnyket al., 2011).
Эти примеры представляют собой важные био-
технологические приложения для мобильного
РНК-сайленсинга и указывают на то, что подобное
движение мнРНК может происходить в природе
от растения к патогенам или симбионтам.
ЛИТЕРАТУРА
Dunoyer P., Brosnan C. A., Schott G., Wang Y., Jay F., Alioua
A., Himber C., Voinnet O. 2010a. An endogenous, systemic
RNAi pathway in plants. EMBO J. 29: 1699–1712.
Dunoyer P., Schott G., Himber C., Meyer D., Takeda A., Carrington
J. C., Voinnet O. 2010b. Small RNA duplexes function
as mobile silencing signals between plant cells. Science
328: 912–916.
Melnyk C. W., Molnar A., Baulcombe D. C. 2011. Intercellular
and systemic movement of RNA silencing. EMBO J. 30:
3553–3563.
Molnar A., Melnyk C. W., Bassett A., Hardcastle T. J., Dunn R.,
Baulcombe D. C. 2010. Small silencing RNAs in plants are
mobile and direct epigenetic modifi cation in recipient cells.
Science 328: 872–875.
Slotkin R. K., Vaughn M., Borges F., Tanurdzić M., Becker
J. D., Feij ó J. A., Martienssen R. A. 2009. Epigenetic reprogramming
and small RNA silencing of transposable elements
in pollen. Cell 136: 461–472.