eng
Содержание
СОДЕРЖАНИЕ
Авторы ......................................................................................................5
Введение ...................................................................................................7
Глава 1. Полимеры природного происхождения .......................................8
1.1.
Шелк ...................................................................................................8
1.1.1.
Возникновение шелководства................................................8
1.1.2.
Получение шелка ....................................................................9
1.1.3.
Характеристика шелка .......................................................... 12
1.1.4.
Фиброин как биоматериал ................................................... 14
1.1.4.1.
Биодеградируемые носители из фиброина шелка
для клеточных культур и лекарственных веществ .............20
1.1.4.1.1.
Клеточные микроносители ............................................20
1.1.4.1.2.
Носители лекарственных веществ .................................20
1.1.4.2.
Использование фиброина шелка при лечении
заболеваний поджелудочной железы .................................24
1.1.4.3.
Использование фиброина шелка при лечении
заболеваний роговицы ........................................................ 26
1.1.4.4.
Использование фиброина шелка при лечении
раковых заболеваний ..........................................................28
1.1.4.5.
Применение шелка в инженерии тканей ..........................33
1.1.4.5.1.
Костная ткань ................................................................. 36
1.1.4.5.2.
Хрящевая ткань ...............................................................45
1.1.4.5.3.
Ранозаживление ..............................................................50
1.1.4.5.4.
Связки..............................................................................53
1.1.4.5.5.
Кровеносные сосуды ......................................................54
1.1.4.5.6.
Желудочно-кишечный тракт, мочевыделительная
система ............................................................................58
1.1.4.5.7.
Нервная ткань ................................................................. 60
1.1.4.6.
Антимикробные свойства фиброина шелка ..................... 64
1.2.
Каркасный шелк паутины ............................................................... 64
1.3.
Коллаген ........................................................................................... 70
1.4.
Хитин, хитозан .................................................................................72
1.5.
Бактериальные полиоксиалканоаты – полиоксибутираты ..........74
1.6.
Альгиновая кислота .........................................................................75
Глава 2. Синтетические полимеры ..........................................................80
2.1.
Полигликолевая кислота ................................................................. 80
2.2.
Полилактид ......................................................................................82
2.3.
Поликапролактон .........................................................................84
Глава 3. Особенности иммунного ответа на биоматериалы ....................88
4
Биодеградируемые изделия на основе фиброина шелка
для тканевой инженерии и регенеративной медицины
Глава 4. Способы получения и методы исследования биоматериалов .....96
4.1.
Технологии изготовления 3D-матриксов ....................................... 96
4.1.1.
Метод выщелачивания ......................................................... 96
4.1.2.
Метод сублимации ................................................................ 97
4.1.3.
Метод электроспиннинга ..................................................... 97
4.1.4.
Метод биопринтирования ..................................................97
4.2.
Методы исследования биоматериалов ........................................... 98
4.2.1.
Микроскопические методы исследования
биоматериалов ....................................................................... 98
4.2.1.1.
Сканирующая электронная микроскопия ........................ 98
4.2.1.2.
Трансмиссионная электронная микроскопия .................. 99
4.2.1.3.
Конфокальная микроскопия ........................................... 101
4.2.1.4.
Сканирующая зондовая микроскопия ............................ 102
4.2.1.5.
Сканирующая зондовая нанотомография ....................... 104
4.2.2.
Инфракрасная спектроскопия ........................................... 105
Глава 5. Исследование биологических свойств
биополимеров in vitro и in vivo ...............................................................107
5.1.
Матриксы из фиброина шелка и рекомбинантного
спидроина: получение, сравнительный анализ ........................... 107
5.2.
Изучение адгезии и пролиферации фибробластов 3Т3
на каркасных матриксах из рекомбинантного спидроина и
фиброина шелка ............................................................................. 108
5.3.
Экспериментальная модель травматического повреждения
бедренной кости для исследования свойств матриксов in vivo ... 109
5.4.
Тканеспецифические матриксы .................................................... 120
Заключение ..........................................................................................122
Список сокращений ..............................................................................123
Список литературы ...............................................................................125
Авторы
Ольга Игоревна Агапова — кандидат биологических наук, научный
сотрудник лаборатории бионанотехнологий ФГБУ «НМИЦ
ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, специалист
по трехмерному структурному анализу биополимеров, клеток и
тканей.
Игорь Иванович Агапов — доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией бионанотехнологий ФГБУ «НМИЦ
ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, специалист
по молекулярной биологии, регенеративной медицине, автор
более 150 научных работ и изобретений.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Националь-
ный медицинский исследовательский центр трансплантологии и
искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» – круп-
нейшее научно-практическое учреждение, выполняющее фунда-
ментальные и прикладные исследования в области трансплантоло-
гии и искусственных органов.
Монография выполнена при поддержке Российского научного
фонда (проект № 17-75-10098).
Agapova O. I., Agapov I.I
Biodegradable products based on silk fibroin for tissue engineering and
regenerative medicine
Annotation: The book presents modern results of studying of structure
and biological properties of products based on fibroin silk and other
biodegradable polymers of natural and synthetic origin. In this book authors
examine the ways of obtaining biopolymers and products from them, the
possibility of using them for regenerative medicine, tissue engineering,
pharmaceutics. In this monograph authors analyze advantages and
disadvantages of biopolymers. The book is intended for specialists in the
fields of bioengineering, bionanotechnology, structural biology, polymer
chemistry, pharmaceutics.
Authors
Agapova Olga Igorevna — PhD in Biology, researcher of Laboratory of Bionanotechnology,
«Academician V.I.Shumakov National Medical Research
Center of Transplantology and Artificial Organs», Ministry of Health of the
Russian Federation.
Agapov Igor Ivanovich — Doctor of Science in Biology, professor, head of
Laboratory of Bionanotechnology, «Academician V.I. Shumakov National
Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs», Ministry
of Health of the Russian Federation.
Введение
Полимеры природного (биополимеры) и синтетического про-
исхождения находят широкое применение в области тканевой
инженерии, регенеративной медицины и фармацевтике. Биопо-
лимеры – класс полимеров, которые входят в состав животных и
растительных организмов. Благодаря биосовместимости и биоде-
градируемости до метаболитов, участвующих в клеточных процес-
сах, они имеют преимущество перед синтетическими полимерами.
Тем не менее такие материалы, как полигликолевая кислота, поли-
лактид и поликапролактон, благодаря своим биологическим, хи-
мическим и механическим свойствам также находят должное при-
менение. Изучение биодеградируемых полимеров открывает новые
возможности для биоинженерии и регенеративной медицины: со-
четание полимеров природного и синтетического происхождения
позволяет создавать конcтрукции с наиболее подходящими свой-
ствами для практического применения.
ГЛАВА 1
ПОЛИМЕРЫ ПРИРОДНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
1.1. Шелк
1.1.1. Возникновение шелководства
Как рассказывает история, первые упоминания о шелковичном
черве связаны с Древнем Китаем и датируются 2600 г. до н. э. В про-
цессе археологических раскопок в китайской провинции Шаньси
были найдены коконы тутового шелкопряда, возраст которых опре-
делялся 2000 г. до н. э. С давних времен китайцы хранили тайну раз-
ведения бабочек и гусениц шелкопряда. Тем не менее в IV в. н. э.
некая китайская принцесса преподнесла своему будущему мужу,
королю малой Бухары, яйца шелковичного червя в качестве подар-
ка. В 552 году монахи принесли из путешествия по Китаю яйца шел-
копряда императору Византии Юстиниану, после чего он издал указ
о разведении шелкопряда в восточных областях своих владений (1).
Расцвет шелководства начался в Малой Азии, чуть позже – в Испа-
нии и Северной Африке после арабских завоеваний. Из Константи-
нополя яйца шелковичного червя были привезены в Венецию после
крестового похода в 1203–1204 гг. в долину реки По, где и по сей
день происходит разведение шелкопряда. На юге Франции шелко-
водство появилось в 14 веке, а в России, под Москвой в селе Из-
майлово, оно зародилось в 1596 г., а чуть позже распространилось
и в более благоприятных для этого южных регионах. Несмотря на
разведение шелкопряда в Европе и умение обращаться с кокона-
ми, по большей части шелк поставляли именно из Китая, который
по сей день является крупнейшим производителем натурального
шелка (50% от производства в мире), ведь именно здесь зародилась
традиция шелководства. Другими основными поставщиками шелка
в мире являются Индия (15% мирового производства), Узбекистан,
Бразилия, Иран, Вьетнам, Таиланд (2).
1.1.2. Получение шелка
Шелковая ткань красива внешне, равномерно окрашивается,
она очень прочная, легкая, превосходно сохраняет тепло. В основе
этих качеств лежат уникальные свойства белкового волокна нити.
Тутовый шелкопряд (Bombyx mori) – бабочка из семейства на-
стоящих шелкопрядов, и именно они разводятся человеком для
производства шелка. Шелкопряд был одомашнен в Китае око-
ло 3000 лет до н. э. Предположительно его близкой и, возможно,
исходной формой является дикий тутовый шелкопряд (Bombyx
mandarina), область обитания которого распространяется от север-
ных районов Индии до северных областей Китая, Кореи, Японии,
дальневосточных регионов России. Жизненный цикл одомашнен-
ных бабочек шелкопряда из-за тысячелетней селекции находится
в большой зависимости от человека, в отличие от жизненного цик-
ла диких шелкопрядов, разведение которых не является коммер-
чески выгодным для производства шелка (3). Предполагается, что
одомашненная бабочка развивалась от шелкопрядов из регионов
Китая (4). До периода неолита шелкопрядов вряд ли разводили
в домашних условиях, так как для этого не были разработаны ин-
струменты, помогающие изготавливать большое количество шел-
ковой нити.
Чтобы понять весь этап формирования шелка, стоит рассказать
о самом насекомом Bombyx mori.
Как правило, тутовые шелкопряды делятся на три типа:
– моновольтинные – дают одно поколение в год; чаще всего
их географическая среда обитания – Европа. Яйца шелко-
пряда имеют период покоя, который приходится на холод-
ное время года, перекрестное оплодотворение происходит
только весной, производится шелк один раз в год;
– бивольтинные – дают два поколения в течение 12 месяцев,
обычно встречаются в Китае, Корее, Японии. Процесс раз-
множения этого типа шелкопряда происходит два раза в год.
Это возможно благодаря более теплому климату;
– поливольтинные – способны к воспроизведению не-
скольких поколений. Этот тип шелкопряда обитает только
в тропиках. Яйца откладываются женскими особями и вы-
сиживаются от 9 до 12 дней, поэтому этот тип может иметь
до восьми отдельных жизненных циклов в течение года.
Бабочка шелкопряда – небольшое насекомое серовато-белого
цвета с размахом крыльев от 40 до 60 мм. Как у самок, так и у самцов
имеются гребенчатые усики, которые больше у представителей муж-
ских особей. Особенностью бабочек тутового шелкопряда является
то, что они практически не имеют способности к полету, самки еще
более малоподвижны, их ротовой аппарат недоразвит, в связи с чем
на протяжении всей жизни они не питаются, что называется афаги-
ей. Бабочке необходимо найти партнера для спаривания в течение
короткого времени, так как живет она недолго – несколько дней.
Самка откладывает яйца – грену – на листья тутового дерева, ко-
личество в кладке – 500–700 штук. Кладка эллиптической формы,
сплюснутая по бокам, ее длина в среднем составляет около 1 мм,
ширина – 0,5 мм, возможны некоторые вариации между разными
породами. Откладывание яйца длится около трех суток, после чего
у шелкопряда наступает диапауза, т.е. замедление обмена веществ
и приостановление процессов формообразования, которая прихо-
дится на стадию яйца (5). Для моновольтинных видов характерна
облигатная эмбриональная диапауза. У других типов факультатив-
ная диапауза, и они приносят несколько поколений за год. Наличие
стадии диапаузы зависит от того, на протяжении какого фотопери-
ода развивался эмбрион его родителя-самки. Так, яйца пройдут че-
рез диапаузу на ранних этапах цикла, если эмбриональное развитие
самки проходило в период большой продолжительности дня в со-
четании с высокими температурами. Если же самка развивалась при
низких температурах и короткой продолжительности дня, отклады-
ваемые яйца будут развиваться без диапаузы. Особи, родившиеся
весной при коротком дне, дают потомство, вырастающее летом, без
диапаузы. Оно будет откладывать яйца, которые пройдут через диа-
паузы, перезимовав, и их развитие придется на весенний период.
Таким образом, эти виды дают два поколения в течение года (6).
Шелковичный червь, т. е. гусеница, вылупляется из яйца разме-
ром в несколько миллиметров. В течение последующих трех дней ее
вес увеличивается в десять тысяч раз. Гусеница линяет четыре раза,
после чего ее окрас приобретает желтоватый оттенок. Развитие
шелковичного червя длится от 26 до 32 дней. Продолжительность
развития зависит от таких факторов, как температура, влажность,
количество пищи, а также ее качество. Размер взрослой гусеницы
составляет около 7 см. Ее пищей являются листья тутового дерева
(шелковицы), таким образом, это насекомое называется монофагом, т. е. питающимся одним видом кормового растения (7). Вви-
ду этого территория шелководства связана с произрастанием это-
го растения. После окукливания гусеница создает кокон, начиная
с построения поддерживающего всю будущую конструкцию карка-
са. Проделывая быстрые движения головой, она укладывает шел-
ковую нить в форме восьмерки. Количество таких равномерных
движений достигает 230 000 раз, длина непрерывной нити одного
кокона составляет 300–900 м, а в самых крупных коконах может до-
ходить и до 1500 м. Коконы бывают различных оттенков, например
розового, зеленого, желтого, однако для промышленного произ-
водства разводят породы с коконами белого цвета (рис. 1). Кокон
формируется в течение 2–3 дней, и внутри происходит трансфор-
мация гусеницы в куколку. Бабочки высвобождаются на 15–18-й
день. Однако, чтобы получить шелк, коконы собирают до появ-
ления бабочки, иначе она прогрызет кокон, тем самым повредив
нить. Поэтому коконы до этой стадии не доживают и их инкубиру-
ют при температуре приблизительно в 100 °C в течение 2–2,5 часов,
таким образом убивая куколку, разрушая защитный слой, что об-
легчает раскручивание природной конструкции на отдельные нити.
Затем нити сплетаются вместе, после чего и становятся готовыми для изготовления шелковой ткани. Часть коконов оставляют до по-
явления бабочек для дальнейшего воспроизводства.
Уникальные механические, биологические, химические и фи-
зические свойства шелка, определяющие его красоту, прочность,
долговечность, обуславливаются его строением, главным образом
на молекулярном уровне. На основе этого можно понять, почему
наряду с тканевой отраслью шелк нашел свое применение и в об-
ласти медицины и фармацевтики. Например, на основе фиброина
шелка было сделано ультралегкое резистивное коммутационное за-
поминающее устройство. Фольга памяти 0,4 мг см–2 в 320 раз легче
силикона и в 20 раз легче офисной бумаги. Кроме того, устройство
обладает высоким сопротивлением – отношение OFF/ON равно
105, время удерживания составляет 104, оно также характеризуется
превосходной гибкостью (радиус изгиба 800 мкм) (8).
1.1.3. Характеристика шелка
Шелк – природное белковое волокно, нить которого состоит
из фиброиновых фибрилл, покрытых слоем клееобразного бел-
ка серицина, способствующего склеиванию фибрилл при форми-
ровании кокона. В отличие от фиброина, серицин – водораство-
рим, при кипячении кокона образует в растворе клейкую массу.
На этом основана очистка коконов, так как серицин является по-
тенциальным аллергеном и при использовании в медицине может
быть причиной аллергической реакции 1-го типа (9). В процент-
ном соотношении доля фиброина в шелковом волокне составляет
72–81%, серицина – 19–28%, кроме того, присутствуют жиры
и воск – 0,8–1,0%, красящие и другие минеральные вещества –
1,0–1,4% (10). Самым распространенным является шелк, полу-
ченный из коконов гусениц тутового шелкопряда Bombyx mori (11).
Свойство переливаться шелковая ткань получила благодаря тре-
угольному сечению нити, способной к преломлению падающего на
нее света.
Фиброин является основным белком шелка, который получают
из коконов шелкопряда Воmbух mori и родственных видов. Фибро-
ин представляет собой гетеродимер, состоящий из двух ковалентно
связанных дисульфидными связями полипептидных цепей: легкой
цепи Fib-L с массой 26 кДа (262 аминокислоты) и тяжелой Fib-H
цепи с массой 350 кДа (5263 аминокислоты) (12), (13). Гликозилиро-
ванный белок P25 с массой 30 кДа связан с Fib-L и Fib-H гидрофоб-
ными связями в единый комплекс (14). Предполагается, что этот
комплекс может формироваться из шести тяжелых и шести легких
цепей на одну молекулу гликолизированного белка P25 (15). Легкая
цепь и тяжелая цепь фиброина, а также белок Р25 кодируются в ге-
номе шелкопряда отдельно (12). Первичную структуру фиброина со-
ставляют глицин (43%), аланин (30%), серин (12%) (16). В меньшем
количестве в состав аминокислотной последовательности входят
тирозин (5%), валин (2%), аспартат, глутамат и цистеин, который
выполняет главную интегрирующую роль в объединении разных
субъединиц в одну молекулу. Глицин, аланин и серин составляют ос-
новную структурную последовательность Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser
тяжелой цепи Fib-H, доля которой – 70% всей белковой последова-
тельности (17). Более редко встречаются похожие последовательно-
сти: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr (20%), Gly-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ala (6%),
Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala (4%), каждая из которых составляет ос-
нову 12 регулярных гидрофобных кристаллических блоков, длина
каждого из них – 413 аминокислотных остатков. Эти 12 блоков –
94% общей белковой последовательности, и разделяются они 11
нерегулярными аморфными промежуточными участками длиной
в 42–43 аминокислотных остатка с отрицательным зарядом (16).
В общей структуре фиброина выделяют положительно заряжен-
ный С-конец тяжелой цепи длиной в 58 аминокислотных остат-
ков, отрицательно заряженный N-конец тяжелой цепи длиной
в 151 аминокислотный остаток и последовательность легкой цепи
Fib-L, обладающую амфифильностью с небольшим преобладани-
ем отрицательного заряда. Такая структура обуславливает амфи-
фильность молекулы фиброина шелка с существенным перевесом
в сторону гидрофобности. Фиброин не растворяется в воде, а также
в разбавленных растворах многих кислот и щелочей, но растворим
в концентрированных растворах хлорида лития, тиоцианата лития
и кальция, хлорида кальция. Благодаря тому что фиброин способен
формировать и -спирали, и -складки, он существует в несколь-
ких структурных формах: 1) рыхлой, глобулярной; 2) обогащенной
-спиралями аморфной форме (silk I); 3) прочной кристаллической
-форме (silk II). Первая форма нестабильная и механически не-
прочная, -форма (silk I) является устойчивой и упругой, а третья
-форма (silk II) обладает самой высокой прочностью на разрыв,
она устойчива к сильным механическим воздействиям, но менее
упругая, чем -форма (16). Кристаллизуется белок под воздействи-
ем непредельных алифатических спиртов, метанола или этанола,
высоких температур, концентрированных растворов солей, а также
при доведении pH раствора фиброина шелка до изоэлектрической
точки. Фиброин способен сохранять кристаллическую структуру
в течение долгого времени (18). Именно насыщенная -структурами
форма белка задает и поддерживает форму создаваемой из фиброи-
на тканеинженерной конструкции, обеспечивает его целостность и
стабильность в водных растворах в течение долгого времени (19).
В связи с этим конструкции из фиброина перед применением не-
обходимо подвергать -кристаллизации в целях сохранения их
целостности и увеличения периода деградации в среде культивиро-
вания или в условиях in vivo. Боковые группы аминокислот, входя-
щих в состав фиброина (аминогруппы, спиртовые, карбоксильные,
тио-группы, ароматические) влияют на химические свойства белка.
Доля фиброина в шелковой нити составляет 70–80% массы белка,
остальная часть – это серицин, скрепляющий фибриллы в коконе,
а также несколько процентов жиро- и воскоподобных веществ, не-
органических анионов и катионов (менее 1%) (20), (21). Фиброин
является термостабильным белком, температура его денатурации
выше 127°С, его модуль упругости равен 15–17 ГПа. Конструкции
из фиброина шелка обладают высокой прочностью на разрыв (610–
690 МПа), что позволяет применять его в работах по созданию ис-
кусственных сухожилий (150 МПа) и костной ткани (160 МПа) (22).
Раствор фиброина характеризуется высокой прозрачностью, его
коэффициент пропускания видимого спектра излучения составляет
90–95%, а коэффициент преломления света фиброиновыми плен-
ками толщиной 30–50 мкм равен 1,55 (23).
Шелкопряд вырабатывает шелковую нить, которая содержит
большое количество воды, поэтому молекулы фиброина в составе
шелковой нити находятся в неупорядоченном состоянии, тогда как
в зрелом волокне молекулы фиброина упорядочены (24).
1.1.4. Фиброин как биоматериал
Выбор материала для регенеративной медицины, а также тех-
нология изготовления биоконструкций зависят от области приме-
нения: костная ткань, кровеносные сосуды, кожа, мышечная ткань,
нервные волокна. Для успешного использования биоматериал
должен обладать определенными химическими, биологическими
и механическими свойствами (25), (26). К требуемым химическим
свойствам можно отнести такие характеристики, как отсутствие
токсичных продуктов при взаимодействии с тканями и межткане-
выми жидкостями, резорбция с контролируемой скоростью внутри
организма (27). К необходимым механическим свойствам относятся
прочность конструкции, возможность осуществлять хирургические
манипуляции. Главной биологической характеристикой для ма-
териала является его биосовместимость. Фиброин обладает всеми
вышеизложенными свойствами. На основе фиброина шелка соз-
даются композитные конструкции, что позволяет получить более
функциональные изделия за счет изменения свойств конструкции
вследствие взаимодействия фиброина шелка с другим материалом.
Фиброин применяется в сфере регенеративной медицины в каче-
стве материала для изготовления матриксов (28), пленок (29), ги-
дрогелей, микро- и макроносителей для клеточных культур, а также
в составе конструкций для доставки лекарственных и биологически
активных веществ в организме (30), (31).
В экспериментах in vivo продолжительность деградации инъек-
ционных гелей из хитозана / SF (фиброина шелка) / GP (глицеро-
фосфата) и хитозана / SF / HA (гидроксиапатита) / GP значительно
выше по сравнению с гидрогелем из хитозана/GP. Скорость дегра-
дации может регулироваться компонентом фиброина шелка как
в отдельности, так и с помощью комбинации фиброина шелка и
гидроксиапатита (32).
Использование гидрогеля из фиброина шелка в качестве моду-
лятора механики и добавление компонентов внеклеточного матрик-
са как клеточных адгезивных лигандов позволило сделать материал,
отвердевающий с течением времени и при этом сохраняющий кле-
точную адгезию. При отвердевании гидрогеля образуются молеку-
лярные комплексы путем свободнорадикального сшивания остат-
ков тирозина в молекуле фиброина шелка и аналогичных остатков
в белковых молекулах внеклеточного матрикса, полученного из ле-
вого желудочка свиней, причем степень перешивки позволяет ва-
рьировать механические свойства конструкции, а включение в со-
став конструкции компонентов внеклеточного матрикса позволяет
обеспечить адгезию клеток. Добавление внеклеточного матрикса
сердечной ткани улучшает пролиферацию и миграцию сердечных
фибробластов в системе in vitro. При подкожной инъекции крысам
такие гели активируют миграцию клеток и васкуляризацию кон-
струкции в системе in vivo (33).
При позвоночном дегенеративном заболевании инъекцион-
ный жидкий гидрогель может полностью заполнить дефект, умень-
шить опасность перемещения имплантата с последующей потерей
высоты диска, минимизировать операционную травму. Гидрогель
химически сшит in situ путем двухкомпонентной реакции жид-
кого фиброина шелка с жидким полиуретаном при физиологиче-
ской температуре. Физические свойства геля оценены с помощью
тестов на ограниченное сжатие и испытаний на усталость мате-
риала. Для изучения биосовместимости проведены исследование
деградации геля в различных растворах и эксперименты на живот-
ных. На модуль гидрогеля оказывают влияние геометрические па-
раметры геля (диаметр). В результате композит может выдержать
миллион циклов, естественно сопротивляясь усталости. Хорошая
био совместимость наблюдается в течение трех месяцев при экспе-
риментах на новозеландских белых кроликах. В частности, компо-
зитные гидрогели обладают значительным клиническим достоин-
ством, обеспечивая более сильную осевую жесткость при тесте на
ограниченное сжатие, и, таким образом, потенциально могут при-
меняться для замены студенистого ядра (34).
Имплантируемое биосовместимое и биоразлагаемое волок-
но из фиброина шелка и кетгута (SGFs) разработано для доставки
светового излучения в глубокие ткани. Волокно обладает светорас-
сеивающим свойством благодаря естественным неровностям по-
верхности и явлению рассеяния внутри волокна. В отличие от пра-
вильного оптического волокна, которому свойственно эффективно
переносить свет от одной точки к другой, SGFs максимизируют
свет, рассеиваемый вдоль волокна, что желательно, когда цель – по-
влиять на значительно большее количество клеток, что важно при
необходимости активирования значительной площади внутренней
ткани, а не локализованной точки (35).
Благодаря хорошей механической и термической стабильно-
сти, многогранным и универсальным условиям обработки, воз-
можности модифицирования шелк является хорошим кандидатом
для использования в сенсорных платформах, которые используют
специ фичность взаимодействий антиген – антитело и колори-
метрическую трансдукцию структуры наноструктурированного
фотонного кристалла для распознавания окружающей среды. Пер-
спективной является разработка колориметрических датчиков на
основе биополимеров, которые используют структурный цвет как
механизм трансдукции (36).
Простые способы изготовления на водной основе, основанные
на самосборке белка, используются для получения трехмерных сы-
пучих материалов из фиброина шелка, которые могут быть легко
гибридизованы с водорастворимыми молекулами для получения
множества твердых форматов с предварительно разработанными
функциями. Управление самосборкой приводит к надежной меха-
нической обработке форматов, которые демонстрируют термопла-
стичное поведение, давая возможность изменять форму материала
на нано-, микро- и макроуровнях. В качестве наглядного примера
созданы шелковые монолиты, которые могут быть собраны, отпо-
лированы и переформированы в функциональные механические
компоненты с возможностью их наноструктурирования, внедрения
оптических функций, нагреваемых по требованию в ответ на ин-
фракрасный свет, способных визуализировать механическое по-
вреждение через колориметрические химические составы, встроен-
ные в собранный (насыпной) белковый матрикс (37).
Послойные пленки из фиброина шелка и амилоида бета-пепти-
да с длиной в 40 аминокислот (A1-40) подготовлены в целях разра-
ботки нового прототипа электрохимического иммуносенсора. Ис-
следования in vitro говорят о возможности применения этих систем
в качестве нового прототипа для предварительной диагностики бо-
лезни Альцгеймера (38).
Пленки из шелка помогают сохранить активность антител на
поверхности биосенсоров при повышенных температурах, что по-
казано на примере пленок из фиброина, которые использованы
в качестве защитного слоя для сохранения активности модельно-
го антитела (IgG кролика) и антитела к сердечному тропонину при
комнатной температуре и при 40°С на протяжении нескольких
дней. Предположительно механизм сохранения связан с образо-
ванием водородных связей между шелковым матриксом и анти-
телом и дегидратацией интерфейса. Этот энергоэффективный и
экологичный метод позволяет исключить систему холодовой цепи
во время транспортировки и хранения биосенсоров на основе анти-
тел. Важно, что простой водный процесс промывки восстанавлива-
ет функциональность биосенсора, который может использоваться
в качестве диагностического устройства в машинах скорой помощи,
отделениях интенсивной терапии, отделениях скорой помощи, в
полевых и домашних условиях. Метод может распространяться на
множество других биосенсорных платформ с учетом простого вод-
ного осаждения и удаления защитного слоя (39).
В экспериментах на крысах использована фиброиновая пено-
образная матрица в виде инжектируемого материала, которая мо-
жет служить в качестве каркаса для заполнения мягких тканей и
использоваться как самостоятельно, так и вместе с липоаспирата-
ми (40).
Из регенерированного фиброина шелка Bombyx mori созданы
пленки, трехмерные матриксы и трубки. Конструкции отличаются
прочностью и эластичностью, и исследования in vitro говорят об их
возможности поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотиче-
ских клеток, а структура конструкций способствует равномерному
распределению пролиферирующих клеток как на поверхности, так
и в толще матрикса. Эксперименты in vivo с подкожной импланта-
цией матриксов мышам демонстрируют высокую скорость биоде-
градации и их способность подвергаться неоваскуляризации (41).
Для культивирования клеточной линии LNCaP рака простаты
были сформированы пять видов пористых композитных матриксов
на основе фиброина шелка Bombyx mori: с добавлением коллаге-
на, желатина, хитозана, фиброина шелка Antheraea pernyi и реком-
бинантного спидроина SSP. Добавление тех или иных материалов
оказывает разное влияние на пористость, набухаемость, упругость
формируемых матриксов. В данном случае цель – улучшение как
физических, так и биохимических свойств композиции. Так, инте-
грация RGD-последовательности в двух видах матриксов должна
поддерживать адгезию клеточной культуры. При сравнении ма-
триксов из чистого фиброина и с добавлением хитозана композит-
ный обладает большей пористостью, улучшая рост клеток. Матрик-
сы из фиброина B.mori / A.pernyi и хитозана характеризуются более
плотной и компактной структурой с недостаточной площадью по-
верхности пор для прикрепления клеток. Матриксы с коллагеном
обладают сетью хорошо взаимосвязанных пор и высоким показате-
лем упругости, что также положительно сказывается на клеточном
росте. Матриксы из фиброина со спидроином или с коллагеном
обладают высокой набухаемостью, что приводит к равномерному
распределению лекарственных веществ в объеме матрикса. Биохимическая функционализация должна поддерживать адгезию клеток
благодаря RGD-последовательности в составе желатина и фибро-
ина из A. Pernyi, однако в обоих случаях этого не происходит из-за
низкой пористости. Данное исследование доказывает эффектив-
ность фиброиновых матриксов для культивирования клеточной
культуры, более того, некоторые созданные композитные матриксы
показывают еще большую эффективность, чем конструкции из чи-
стых биополимеров или синтетических полимеров (42).
Для оценки фенотипа, жизнеспособности и пролиферации
клеток и экспрессии маркеров мезенхимальных стволовых клеток
на трехмерных матриксах из фиброина шелка были культивиро-
ваны стволовые клетки молочных зубов человека (SHEDs). Под-
счет количества клеток и оценка пролиферации с помощью коло-
метрического анализа осуществлены после 24, 48, 72 и 168 часов
культивирования. Морфологические особенности клеток оценены
с помощью сканирующей электронной микроскопии, а их жизне-
способность и экспрессия маркеров проанализированы с помощью
проточной цитометрии. С увеличением времени культивирования
пролиферативная активность клеток увеличивается, уровень экс-
прессии CD73, CD90 или CD105 существенно не меняется до 168
часов, жизнеспособность клеток на матриксе сходна с таковой на
пластике. Вместе с тем микроскопические исследования показыва-
ют подходящую степень пролиферации, клеточной миграции и ад-
гезии, особенно после 168 часов культивирования, что указывает на
благоприятное влияние матриксов на клетки и делает актуальными
дальнейшие исследования in vivo (43).
Для применения в качестве покрытия силиконовых грудных
имплантатов изготовлены волокнистые матриксы с помощью тех-
нологии электроспиннинга из раствора, содержащего фиброин
шелка и полиэтиленоксид (ПЭО). Смесь была нанесена на имплан-
таты, в результате чего была получена конструкция со случайным
распределением волокон, структура которой оценивалась с помо-
щью сканирующей электронной микроскопии, измерений ше-
роховатости и ATR-FTIR-спектроскопии (Фурье-спектроскопии
нарушенного полного внутреннего отражения). Сравнение меха-
нических характеристик имплантатов до и после покрытия смесью
веществ говорит о том, что модификация поверхности смесью фи-
броина шелка с ПЭО способствует увеличению модуля упругости
от 0,392 ± 0,02 до 0,560 ± 0,03 МПа и более эластичному поведению
имплантатов груди. Человеческие фибробласты, культивирован-
ные на дисковидных имплантатах с этим покрытием, увеличивают
жизнеспособность до 30% по сравнению с обычными грудными им-
плантатами. Данное шелковое покрытие клинически биосовмести-
мо, обладает низкой цитотоксичностью, его физико-химические и
механические свойства позволяют улучшить биосовместимость си-
ликоновых имплантатов (44).
Пористые матриксы из фиброина шелка и поливинилового
спирта потенциально могут использоваться в качестве раневого пе-
ревязочного материала благодаря низкой цитотоксичности и под-
ходящему высвобождению загруженного в них куркумина (45).
Ольга Игоревна Агапова — кандидат биологических наук, научный
сотрудник лаборатории бионанотехнологий ФГБУ «НМИЦ
ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, специалист
по трехмерному структурному анализу биополимеров, клеток и
тканей.
Игорь Иванович Агапов — доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией бионанотехнологий ФГБУ «НМИЦ
ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, специалист
по молекулярной биологии, регенеративной медицине, автор
более 150 научных работ и изобретений.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Националь-
ный медицинский исследовательский центр трансплантологии и
искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» – круп-
нейшее научно-практическое учреждение, выполняющее фунда-
ментальные и прикладные исследования в области трансплантоло-
гии и искусственных органов.
Монография выполнена при поддержке Российского научного
фонда (проект № 17-75-10098).
Agapova O. I., Agapov I.I
Biodegradable products based on silk fibroin for tissue engineering and
regenerative medicine
Annotation: The book presents modern results of studying of structure
and biological properties of products based on fibroin silk and other
biodegradable polymers of natural and synthetic origin. In this book authors
examine the ways of obtaining biopolymers and products from them, the
possibility of using them for regenerative medicine, tissue engineering,
pharmaceutics. In this monograph authors analyze advantages and
disadvantages of biopolymers. The book is intended for specialists in the
fields of bioengineering, bionanotechnology, structural biology, polymer
chemistry, pharmaceutics.
Authors
Agapova Olga Igorevna — PhD in Biology, researcher of Laboratory of Bionanotechnology,
«Academician V.I.Shumakov National Medical Research
Center of Transplantology and Artificial Organs», Ministry of Health of the
Russian Federation.
Agapov Igor Ivanovich — Doctor of Science in Biology, professor, head of
Laboratory of Bionanotechnology, «Academician V.I. Shumakov National
Medical Research Center of Transplantology and Artificial Organs», Ministry
of Health of the Russian Federation.
Введение
Полимеры природного (биополимеры) и синтетического про-
исхождения находят широкое применение в области тканевой
инженерии, регенеративной медицины и фармацевтике. Биопо-
лимеры – класс полимеров, которые входят в состав животных и
растительных организмов. Благодаря биосовместимости и биоде-
градируемости до метаболитов, участвующих в клеточных процес-
сах, они имеют преимущество перед синтетическими полимерами.
Тем не менее такие материалы, как полигликолевая кислота, поли-
лактид и поликапролактон, благодаря своим биологическим, хи-
мическим и механическим свойствам также находят должное при-
менение. Изучение биодеградируемых полимеров открывает новые
возможности для биоинженерии и регенеративной медицины: со-
четание полимеров природного и синтетического происхождения
позволяет создавать конcтрукции с наиболее подходящими свой-
ствами для практического применения.
ГЛАВА 1
ПОЛИМЕРЫ ПРИРОДНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
1.1. Шелк
1.1.1. Возникновение шелководства
Как рассказывает история, первые упоминания о шелковичном
черве связаны с Древнем Китаем и датируются 2600 г. до н. э. В про-
цессе археологических раскопок в китайской провинции Шаньси
были найдены коконы тутового шелкопряда, возраст которых опре-
делялся 2000 г. до н. э. С давних времен китайцы хранили тайну раз-
ведения бабочек и гусениц шелкопряда. Тем не менее в IV в. н. э.
некая китайская принцесса преподнесла своему будущему мужу,
королю малой Бухары, яйца шелковичного червя в качестве подар-
ка. В 552 году монахи принесли из путешествия по Китаю яйца шел-
копряда императору Византии Юстиниану, после чего он издал указ
о разведении шелкопряда в восточных областях своих владений (1).
Расцвет шелководства начался в Малой Азии, чуть позже – в Испа-
нии и Северной Африке после арабских завоеваний. Из Константи-
нополя яйца шелковичного червя были привезены в Венецию после
крестового похода в 1203–1204 гг. в долину реки По, где и по сей
день происходит разведение шелкопряда. На юге Франции шелко-
водство появилось в 14 веке, а в России, под Москвой в селе Из-
майлово, оно зародилось в 1596 г., а чуть позже распространилось
и в более благоприятных для этого южных регионах. Несмотря на
разведение шелкопряда в Европе и умение обращаться с кокона-
ми, по большей части шелк поставляли именно из Китая, который
по сей день является крупнейшим производителем натурального
шелка (50% от производства в мире), ведь именно здесь зародилась
традиция шелководства. Другими основными поставщиками шелка
в мире являются Индия (15% мирового производства), Узбекистан,
Бразилия, Иран, Вьетнам, Таиланд (2).
1.1.2. Получение шелка
Шелковая ткань красива внешне, равномерно окрашивается,
она очень прочная, легкая, превосходно сохраняет тепло. В основе
этих качеств лежат уникальные свойства белкового волокна нити.
Тутовый шелкопряд (Bombyx mori) – бабочка из семейства на-
стоящих шелкопрядов, и именно они разводятся человеком для
производства шелка. Шелкопряд был одомашнен в Китае око-
ло 3000 лет до н. э. Предположительно его близкой и, возможно,
исходной формой является дикий тутовый шелкопряд (Bombyx
mandarina), область обитания которого распространяется от север-
ных районов Индии до северных областей Китая, Кореи, Японии,
дальневосточных регионов России. Жизненный цикл одомашнен-
ных бабочек шелкопряда из-за тысячелетней селекции находится
в большой зависимости от человека, в отличие от жизненного цик-
ла диких шелкопрядов, разведение которых не является коммер-
чески выгодным для производства шелка (3). Предполагается, что
одомашненная бабочка развивалась от шелкопрядов из регионов
Китая (4). До периода неолита шелкопрядов вряд ли разводили
в домашних условиях, так как для этого не были разработаны ин-
струменты, помогающие изготавливать большое количество шел-
ковой нити.
Чтобы понять весь этап формирования шелка, стоит рассказать
о самом насекомом Bombyx mori.
Как правило, тутовые шелкопряды делятся на три типа:
– моновольтинные – дают одно поколение в год; чаще всего
их географическая среда обитания – Европа. Яйца шелко-
пряда имеют период покоя, который приходится на холод-
ное время года, перекрестное оплодотворение происходит
только весной, производится шелк один раз в год;
– бивольтинные – дают два поколения в течение 12 месяцев,
обычно встречаются в Китае, Корее, Японии. Процесс раз-
множения этого типа шелкопряда происходит два раза в год.
Это возможно благодаря более теплому климату;
– поливольтинные – способны к воспроизведению не-
скольких поколений. Этот тип шелкопряда обитает только
в тропиках. Яйца откладываются женскими особями и вы-
сиживаются от 9 до 12 дней, поэтому этот тип может иметь
до восьми отдельных жизненных циклов в течение года.
Бабочка шелкопряда – небольшое насекомое серовато-белого
цвета с размахом крыльев от 40 до 60 мм. Как у самок, так и у самцов
имеются гребенчатые усики, которые больше у представителей муж-
ских особей. Особенностью бабочек тутового шелкопряда является
то, что они практически не имеют способности к полету, самки еще
более малоподвижны, их ротовой аппарат недоразвит, в связи с чем
на протяжении всей жизни они не питаются, что называется афаги-
ей. Бабочке необходимо найти партнера для спаривания в течение
короткого времени, так как живет она недолго – несколько дней.
Самка откладывает яйца – грену – на листья тутового дерева, ко-
личество в кладке – 500–700 штук. Кладка эллиптической формы,
сплюснутая по бокам, ее длина в среднем составляет около 1 мм,
ширина – 0,5 мм, возможны некоторые вариации между разными
породами. Откладывание яйца длится около трех суток, после чего
у шелкопряда наступает диапауза, т.е. замедление обмена веществ
и приостановление процессов формообразования, которая прихо-
дится на стадию яйца (5). Для моновольтинных видов характерна
облигатная эмбриональная диапауза. У других типов факультатив-
ная диапауза, и они приносят несколько поколений за год. Наличие
стадии диапаузы зависит от того, на протяжении какого фотопери-
ода развивался эмбрион его родителя-самки. Так, яйца пройдут че-
рез диапаузу на ранних этапах цикла, если эмбриональное развитие
самки проходило в период большой продолжительности дня в со-
четании с высокими температурами. Если же самка развивалась при
низких температурах и короткой продолжительности дня, отклады-
ваемые яйца будут развиваться без диапаузы. Особи, родившиеся
весной при коротком дне, дают потомство, вырастающее летом, без
диапаузы. Оно будет откладывать яйца, которые пройдут через диа-
паузы, перезимовав, и их развитие придется на весенний период.
Таким образом, эти виды дают два поколения в течение года (6).
Шелковичный червь, т. е. гусеница, вылупляется из яйца разме-
ром в несколько миллиметров. В течение последующих трех дней ее
вес увеличивается в десять тысяч раз. Гусеница линяет четыре раза,
после чего ее окрас приобретает желтоватый оттенок. Развитие
шелковичного червя длится от 26 до 32 дней. Продолжительность
развития зависит от таких факторов, как температура, влажность,
количество пищи, а также ее качество. Размер взрослой гусеницы
составляет около 7 см. Ее пищей являются листья тутового дерева
(шелковицы), таким образом, это насекомое называется монофагом, т. е. питающимся одним видом кормового растения (7). Вви-
ду этого территория шелководства связана с произрастанием это-
го растения. После окукливания гусеница создает кокон, начиная
с построения поддерживающего всю будущую конструкцию карка-
са. Проделывая быстрые движения головой, она укладывает шел-
ковую нить в форме восьмерки. Количество таких равномерных
движений достигает 230 000 раз, длина непрерывной нити одного
кокона составляет 300–900 м, а в самых крупных коконах может до-
ходить и до 1500 м. Коконы бывают различных оттенков, например
розового, зеленого, желтого, однако для промышленного произ-
водства разводят породы с коконами белого цвета (рис. 1). Кокон
формируется в течение 2–3 дней, и внутри происходит трансфор-
мация гусеницы в куколку. Бабочки высвобождаются на 15–18-й
день. Однако, чтобы получить шелк, коконы собирают до появ-
ления бабочки, иначе она прогрызет кокон, тем самым повредив
нить. Поэтому коконы до этой стадии не доживают и их инкубиру-
ют при температуре приблизительно в 100 °C в течение 2–2,5 часов,
таким образом убивая куколку, разрушая защитный слой, что об-
легчает раскручивание природной конструкции на отдельные нити.
Затем нити сплетаются вместе, после чего и становятся готовыми для изготовления шелковой ткани. Часть коконов оставляют до по-
явления бабочек для дальнейшего воспроизводства.
Уникальные механические, биологические, химические и фи-
зические свойства шелка, определяющие его красоту, прочность,
долговечность, обуславливаются его строением, главным образом
на молекулярном уровне. На основе этого можно понять, почему
наряду с тканевой отраслью шелк нашел свое применение и в об-
ласти медицины и фармацевтики. Например, на основе фиброина
шелка было сделано ультралегкое резистивное коммутационное за-
поминающее устройство. Фольга памяти 0,4 мг см–2 в 320 раз легче
силикона и в 20 раз легче офисной бумаги. Кроме того, устройство
обладает высоким сопротивлением – отношение OFF/ON равно
105, время удерживания составляет 104, оно также характеризуется
превосходной гибкостью (радиус изгиба 800 мкм) (8).
1.1.3. Характеристика шелка
Шелк – природное белковое волокно, нить которого состоит
из фиброиновых фибрилл, покрытых слоем клееобразного бел-
ка серицина, способствующего склеиванию фибрилл при форми-
ровании кокона. В отличие от фиброина, серицин – водораство-
рим, при кипячении кокона образует в растворе клейкую массу.
На этом основана очистка коконов, так как серицин является по-
тенциальным аллергеном и при использовании в медицине может
быть причиной аллергической реакции 1-го типа (9). В процент-
ном соотношении доля фиброина в шелковом волокне составляет
72–81%, серицина – 19–28%, кроме того, присутствуют жиры
и воск – 0,8–1,0%, красящие и другие минеральные вещества –
1,0–1,4% (10). Самым распространенным является шелк, полу-
ченный из коконов гусениц тутового шелкопряда Bombyx mori (11).
Свойство переливаться шелковая ткань получила благодаря тре-
угольному сечению нити, способной к преломлению падающего на
нее света.
Фиброин является основным белком шелка, который получают
из коконов шелкопряда Воmbух mori и родственных видов. Фибро-
ин представляет собой гетеродимер, состоящий из двух ковалентно
связанных дисульфидными связями полипептидных цепей: легкой
цепи Fib-L с массой 26 кДа (262 аминокислоты) и тяжелой Fib-H
цепи с массой 350 кДа (5263 аминокислоты) (12), (13). Гликозилиро-
ванный белок P25 с массой 30 кДа связан с Fib-L и Fib-H гидрофоб-
ными связями в единый комплекс (14). Предполагается, что этот
комплекс может формироваться из шести тяжелых и шести легких
цепей на одну молекулу гликолизированного белка P25 (15). Легкая
цепь и тяжелая цепь фиброина, а также белок Р25 кодируются в ге-
номе шелкопряда отдельно (12). Первичную структуру фиброина со-
ставляют глицин (43%), аланин (30%), серин (12%) (16). В меньшем
количестве в состав аминокислотной последовательности входят
тирозин (5%), валин (2%), аспартат, глутамат и цистеин, который
выполняет главную интегрирующую роль в объединении разных
субъединиц в одну молекулу. Глицин, аланин и серин составляют ос-
новную структурную последовательность Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser
тяжелой цепи Fib-H, доля которой – 70% всей белковой последова-
тельности (17). Более редко встречаются похожие последовательно-
сти: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Tyr (20%), Gly-Ala-Gly-Tyr-Gly-Ala (6%),
Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala (4%), каждая из которых составляет ос-
нову 12 регулярных гидрофобных кристаллических блоков, длина
каждого из них – 413 аминокислотных остатков. Эти 12 блоков –
94% общей белковой последовательности, и разделяются они 11
нерегулярными аморфными промежуточными участками длиной
в 42–43 аминокислотных остатка с отрицательным зарядом (16).
В общей структуре фиброина выделяют положительно заряжен-
ный С-конец тяжелой цепи длиной в 58 аминокислотных остат-
ков, отрицательно заряженный N-конец тяжелой цепи длиной
в 151 аминокислотный остаток и последовательность легкой цепи
Fib-L, обладающую амфифильностью с небольшим преобладани-
ем отрицательного заряда. Такая структура обуславливает амфи-
фильность молекулы фиброина шелка с существенным перевесом
в сторону гидрофобности. Фиброин не растворяется в воде, а также
в разбавленных растворах многих кислот и щелочей, но растворим
в концентрированных растворах хлорида лития, тиоцианата лития
и кальция, хлорида кальция. Благодаря тому что фиброин способен
формировать и -спирали, и -складки, он существует в несколь-
ких структурных формах: 1) рыхлой, глобулярной; 2) обогащенной
-спиралями аморфной форме (silk I); 3) прочной кристаллической
-форме (silk II). Первая форма нестабильная и механически не-
прочная, -форма (silk I) является устойчивой и упругой, а третья
-форма (silk II) обладает самой высокой прочностью на разрыв,
она устойчива к сильным механическим воздействиям, но менее
упругая, чем -форма (16). Кристаллизуется белок под воздействи-
ем непредельных алифатических спиртов, метанола или этанола,
высоких температур, концентрированных растворов солей, а также
при доведении pH раствора фиброина шелка до изоэлектрической
точки. Фиброин способен сохранять кристаллическую структуру
в течение долгого времени (18). Именно насыщенная -структурами
форма белка задает и поддерживает форму создаваемой из фиброи-
на тканеинженерной конструкции, обеспечивает его целостность и
стабильность в водных растворах в течение долгого времени (19).
В связи с этим конструкции из фиброина перед применением не-
обходимо подвергать -кристаллизации в целях сохранения их
целостности и увеличения периода деградации в среде культивиро-
вания или в условиях in vivo. Боковые группы аминокислот, входя-
щих в состав фиброина (аминогруппы, спиртовые, карбоксильные,
тио-группы, ароматические) влияют на химические свойства белка.
Доля фиброина в шелковой нити составляет 70–80% массы белка,
остальная часть – это серицин, скрепляющий фибриллы в коконе,
а также несколько процентов жиро- и воскоподобных веществ, не-
органических анионов и катионов (менее 1%) (20), (21). Фиброин
является термостабильным белком, температура его денатурации
выше 127°С, его модуль упругости равен 15–17 ГПа. Конструкции
из фиброина шелка обладают высокой прочностью на разрыв (610–
690 МПа), что позволяет применять его в работах по созданию ис-
кусственных сухожилий (150 МПа) и костной ткани (160 МПа) (22).
Раствор фиброина характеризуется высокой прозрачностью, его
коэффициент пропускания видимого спектра излучения составляет
90–95%, а коэффициент преломления света фиброиновыми плен-
ками толщиной 30–50 мкм равен 1,55 (23).
Шелкопряд вырабатывает шелковую нить, которая содержит
большое количество воды, поэтому молекулы фиброина в составе
шелковой нити находятся в неупорядоченном состоянии, тогда как
в зрелом волокне молекулы фиброина упорядочены (24).
1.1.4. Фиброин как биоматериал
Выбор материала для регенеративной медицины, а также тех-
нология изготовления биоконструкций зависят от области приме-
нения: костная ткань, кровеносные сосуды, кожа, мышечная ткань,
нервные волокна. Для успешного использования биоматериал
должен обладать определенными химическими, биологическими
и механическими свойствами (25), (26). К требуемым химическим
свойствам можно отнести такие характеристики, как отсутствие
токсичных продуктов при взаимодействии с тканями и межткане-
выми жидкостями, резорбция с контролируемой скоростью внутри
организма (27). К необходимым механическим свойствам относятся
прочность конструкции, возможность осуществлять хирургические
манипуляции. Главной биологической характеристикой для ма-
териала является его биосовместимость. Фиброин обладает всеми
вышеизложенными свойствами. На основе фиброина шелка соз-
даются композитные конструкции, что позволяет получить более
функциональные изделия за счет изменения свойств конструкции
вследствие взаимодействия фиброина шелка с другим материалом.
Фиброин применяется в сфере регенеративной медицины в каче-
стве материала для изготовления матриксов (28), пленок (29), ги-
дрогелей, микро- и макроносителей для клеточных культур, а также
в составе конструкций для доставки лекарственных и биологически
активных веществ в организме (30), (31).
В экспериментах in vivo продолжительность деградации инъек-
ционных гелей из хитозана / SF (фиброина шелка) / GP (глицеро-
фосфата) и хитозана / SF / HA (гидроксиапатита) / GP значительно
выше по сравнению с гидрогелем из хитозана/GP. Скорость дегра-
дации может регулироваться компонентом фиброина шелка как
в отдельности, так и с помощью комбинации фиброина шелка и
гидроксиапатита (32).
Использование гидрогеля из фиброина шелка в качестве моду-
лятора механики и добавление компонентов внеклеточного матрик-
са как клеточных адгезивных лигандов позволило сделать материал,
отвердевающий с течением времени и при этом сохраняющий кле-
точную адгезию. При отвердевании гидрогеля образуются молеку-
лярные комплексы путем свободнорадикального сшивания остат-
ков тирозина в молекуле фиброина шелка и аналогичных остатков
в белковых молекулах внеклеточного матрикса, полученного из ле-
вого желудочка свиней, причем степень перешивки позволяет ва-
рьировать механические свойства конструкции, а включение в со-
став конструкции компонентов внеклеточного матрикса позволяет
обеспечить адгезию клеток. Добавление внеклеточного матрикса
сердечной ткани улучшает пролиферацию и миграцию сердечных
фибробластов в системе in vitro. При подкожной инъекции крысам
такие гели активируют миграцию клеток и васкуляризацию кон-
струкции в системе in vivo (33).
При позвоночном дегенеративном заболевании инъекцион-
ный жидкий гидрогель может полностью заполнить дефект, умень-
шить опасность перемещения имплантата с последующей потерей
высоты диска, минимизировать операционную травму. Гидрогель
химически сшит in situ путем двухкомпонентной реакции жид-
кого фиброина шелка с жидким полиуретаном при физиологиче-
ской температуре. Физические свойства геля оценены с помощью
тестов на ограниченное сжатие и испытаний на усталость мате-
риала. Для изучения биосовместимости проведены исследование
деградации геля в различных растворах и эксперименты на живот-
ных. На модуль гидрогеля оказывают влияние геометрические па-
раметры геля (диаметр). В результате композит может выдержать
миллион циклов, естественно сопротивляясь усталости. Хорошая
био совместимость наблюдается в течение трех месяцев при экспе-
риментах на новозеландских белых кроликах. В частности, компо-
зитные гидрогели обладают значительным клиническим достоин-
ством, обеспечивая более сильную осевую жесткость при тесте на
ограниченное сжатие, и, таким образом, потенциально могут при-
меняться для замены студенистого ядра (34).
Имплантируемое биосовместимое и биоразлагаемое волок-
но из фиброина шелка и кетгута (SGFs) разработано для доставки
светового излучения в глубокие ткани. Волокно обладает светорас-
сеивающим свойством благодаря естественным неровностям по-
верхности и явлению рассеяния внутри волокна. В отличие от пра-
вильного оптического волокна, которому свойственно эффективно
переносить свет от одной точки к другой, SGFs максимизируют
свет, рассеиваемый вдоль волокна, что желательно, когда цель – по-
влиять на значительно большее количество клеток, что важно при
необходимости активирования значительной площади внутренней
ткани, а не локализованной точки (35).
Благодаря хорошей механической и термической стабильно-
сти, многогранным и универсальным условиям обработки, воз-
можности модифицирования шелк является хорошим кандидатом
для использования в сенсорных платформах, которые используют
специ фичность взаимодействий антиген – антитело и колори-
метрическую трансдукцию структуры наноструктурированного
фотонного кристалла для распознавания окружающей среды. Пер-
спективной является разработка колориметрических датчиков на
основе биополимеров, которые используют структурный цвет как
механизм трансдукции (36).
Простые способы изготовления на водной основе, основанные
на самосборке белка, используются для получения трехмерных сы-
пучих материалов из фиброина шелка, которые могут быть легко
гибридизованы с водорастворимыми молекулами для получения
множества твердых форматов с предварительно разработанными
функциями. Управление самосборкой приводит к надежной меха-
нической обработке форматов, которые демонстрируют термопла-
стичное поведение, давая возможность изменять форму материала
на нано-, микро- и макроуровнях. В качестве наглядного примера
созданы шелковые монолиты, которые могут быть собраны, отпо-
лированы и переформированы в функциональные механические
компоненты с возможностью их наноструктурирования, внедрения
оптических функций, нагреваемых по требованию в ответ на ин-
фракрасный свет, способных визуализировать механическое по-
вреждение через колориметрические химические составы, встроен-
ные в собранный (насыпной) белковый матрикс (37).
Послойные пленки из фиброина шелка и амилоида бета-пепти-
да с длиной в 40 аминокислот (A1-40) подготовлены в целях разра-
ботки нового прототипа электрохимического иммуносенсора. Ис-
следования in vitro говорят о возможности применения этих систем
в качестве нового прототипа для предварительной диагностики бо-
лезни Альцгеймера (38).
Пленки из шелка помогают сохранить активность антител на
поверхности биосенсоров при повышенных температурах, что по-
казано на примере пленок из фиброина, которые использованы
в качестве защитного слоя для сохранения активности модельно-
го антитела (IgG кролика) и антитела к сердечному тропонину при
комнатной температуре и при 40°С на протяжении нескольких
дней. Предположительно механизм сохранения связан с образо-
ванием водородных связей между шелковым матриксом и анти-
телом и дегидратацией интерфейса. Этот энергоэффективный и
экологичный метод позволяет исключить систему холодовой цепи
во время транспортировки и хранения биосенсоров на основе анти-
тел. Важно, что простой водный процесс промывки восстанавлива-
ет функциональность биосенсора, который может использоваться
в качестве диагностического устройства в машинах скорой помощи,
отделениях интенсивной терапии, отделениях скорой помощи, в
полевых и домашних условиях. Метод может распространяться на
множество других биосенсорных платформ с учетом простого вод-
ного осаждения и удаления защитного слоя (39).
В экспериментах на крысах использована фиброиновая пено-
образная матрица в виде инжектируемого материала, которая мо-
жет служить в качестве каркаса для заполнения мягких тканей и
использоваться как самостоятельно, так и вместе с липоаспирата-
ми (40).
Из регенерированного фиброина шелка Bombyx mori созданы
пленки, трехмерные матриксы и трубки. Конструкции отличаются
прочностью и эластичностью, и исследования in vitro говорят об их
возможности поддерживать адгезию и пролиферацию эукариотиче-
ских клеток, а структура конструкций способствует равномерному
распределению пролиферирующих клеток как на поверхности, так
и в толще матрикса. Эксперименты in vivo с подкожной импланта-
цией матриксов мышам демонстрируют высокую скорость биоде-
градации и их способность подвергаться неоваскуляризации (41).
Для культивирования клеточной линии LNCaP рака простаты
были сформированы пять видов пористых композитных матриксов
на основе фиброина шелка Bombyx mori: с добавлением коллаге-
на, желатина, хитозана, фиброина шелка Antheraea pernyi и реком-
бинантного спидроина SSP. Добавление тех или иных материалов
оказывает разное влияние на пористость, набухаемость, упругость
формируемых матриксов. В данном случае цель – улучшение как
физических, так и биохимических свойств композиции. Так, инте-
грация RGD-последовательности в двух видах матриксов должна
поддерживать адгезию клеточной культуры. При сравнении ма-
триксов из чистого фиброина и с добавлением хитозана композит-
ный обладает большей пористостью, улучшая рост клеток. Матрик-
сы из фиброина B.mori / A.pernyi и хитозана характеризуются более
плотной и компактной структурой с недостаточной площадью по-
верхности пор для прикрепления клеток. Матриксы с коллагеном
обладают сетью хорошо взаимосвязанных пор и высоким показате-
лем упругости, что также положительно сказывается на клеточном
росте. Матриксы из фиброина со спидроином или с коллагеном
обладают высокой набухаемостью, что приводит к равномерному
распределению лекарственных веществ в объеме матрикса. Биохимическая функционализация должна поддерживать адгезию клеток
благодаря RGD-последовательности в составе желатина и фибро-
ина из A. Pernyi, однако в обоих случаях этого не происходит из-за
низкой пористости. Данное исследование доказывает эффектив-
ность фиброиновых матриксов для культивирования клеточной
культуры, более того, некоторые созданные композитные матриксы
показывают еще большую эффективность, чем конструкции из чи-
стых биополимеров или синтетических полимеров (42).
Для оценки фенотипа, жизнеспособности и пролиферации
клеток и экспрессии маркеров мезенхимальных стволовых клеток
на трехмерных матриксах из фиброина шелка были культивиро-
ваны стволовые клетки молочных зубов человека (SHEDs). Под-
счет количества клеток и оценка пролиферации с помощью коло-
метрического анализа осуществлены после 24, 48, 72 и 168 часов
культивирования. Морфологические особенности клеток оценены
с помощью сканирующей электронной микроскопии, а их жизне-
способность и экспрессия маркеров проанализированы с помощью
проточной цитометрии. С увеличением времени культивирования
пролиферативная активность клеток увеличивается, уровень экс-
прессии CD73, CD90 или CD105 существенно не меняется до 168
часов, жизнеспособность клеток на матриксе сходна с таковой на
пластике. Вместе с тем микроскопические исследования показыва-
ют подходящую степень пролиферации, клеточной миграции и ад-
гезии, особенно после 168 часов культивирования, что указывает на
благоприятное влияние матриксов на клетки и делает актуальными
дальнейшие исследования in vivo (43).
Для применения в качестве покрытия силиконовых грудных
имплантатов изготовлены волокнистые матриксы с помощью тех-
нологии электроспиннинга из раствора, содержащего фиброин
шелка и полиэтиленоксид (ПЭО). Смесь была нанесена на имплан-
таты, в результате чего была получена конструкция со случайным
распределением волокон, структура которой оценивалась с помо-
щью сканирующей электронной микроскопии, измерений ше-
роховатости и ATR-FTIR-спектроскопии (Фурье-спектроскопии
нарушенного полного внутреннего отражения). Сравнение меха-
нических характеристик имплантатов до и после покрытия смесью
веществ говорит о том, что модификация поверхности смесью фи-
броина шелка с ПЭО способствует увеличению модуля упругости
от 0,392 ± 0,02 до 0,560 ± 0,03 МПа и более эластичному поведению
имплантатов груди. Человеческие фибробласты, культивирован-
ные на дисковидных имплантатах с этим покрытием, увеличивают
жизнеспособность до 30% по сравнению с обычными грудными им-
плантатами. Данное шелковое покрытие клинически биосовмести-
мо, обладает низкой цитотоксичностью, его физико-химические и
механические свойства позволяют улучшить биосовместимость си-
ликоновых имплантатов (44).
Пористые матриксы из фиброина шелка и поливинилового
спирта потенциально могут использоваться в качестве раневого пе-
ревязочного материала благодаря низкой цитотоксичности и под-
ходящему высвобождению загруженного в них куркумина (45).