eng
Содержание
Содержание
Благодарности 13
Введение 14
Глава 1 15
Доступные инструментальные подходы 15
1.1.
Источники ионов 15
1.1.1.
Электронная ионизация 17
1.1.2.
Химическая ионизация (CI) 19
1.1.3.
Химическая ионизация
при атмосферном давлении 21
1.1.4.
Ионизация электрораспылением 23
1.1.5.
Фотоионизация при атмосферном давлении 26
1.1.6.
Лазерная десорбция-ионизация из матрицы 28
1.2.
Масс-анализаторы 30
1.2.1.
Разрешающая способность 31
1.2.2.
Секторные анализаторы 32
1.2.3.
Квадрупольные анализаторы 38
1.2.3.1.
Квадрупольные фильтры масс [20,21] 38
1.2.3.2.
Квадрупольная ионная ловушка [22,23] 41
1.2.4.
Времяпролетные приборы 43
1.3.
Газовая хроматография и масс-спектрометрия
(GC/MS) [25] 45
1.3.1.
Хроматограмма по полному ионному току (TIC) 46
1.3.2.
Хроматограмма по выделенному иону (RIC) 47
1.3.3.
Детектирование нескольких ионов 47
1.4.
Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия
(LC/MS) [26] 48
1.5.
Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) [27] 49
1.5.1.
MS/MS в приборах с двойной фокусировкой 50
1.5.2.
MS/MS в системе из трех квадруполей 50
1.5.3.
Эксперименты по тандемной
масс-спектрометрии в ионной ловушке 52
1.5.4.
Исследование диссоциации при сопряжении
квадруполя и времяпролетного анализаторов 54
Список сокращений 55
Список литературы 56
Глава 2. Основы количественного анализа 58
2.1.
Общая стратегия 60
2.1.1.
Проект 62
2.1.2.
Отбор проб 62
2.1.3.
Пробоподготовка 63
2.1.4.
Методы анализа 64
2.1.4.1.
Количественный анализ при помощи
GC/MS и LC/MS 65
2.1.4.2.
Калибровочные кривые 67
2.1.4.3.
Внутренний стандарт 69
2.1.5.
Валидация метода 74
Список литературы 77
Глава 3. Как повысить специфичность 78
3.1.
Выбор подходящей хроматографической обработки 79
3.1.1.
GC/MS в условиях низкого
и высокого разрешений 79
3.1.1.1.
Пример использования GC/MS
в биомедицинских исследованиях:
количественное определение глиоксаля
и метилглиоксаля в образцах
плазмы крови [5] 82
3.1.2.
Измерения с помощью LC/MS 85
3.2.
Выбор подходящего метода ионизации 108
3.3.
Пример высокоспецифичного и селективного
метода: анализ диоксинов 115
3.3.1.
Анализ высокого разрешения при помощи
использования метода MID 115
3.3.2.
Использование химической ионизации
отрицательных ионов (NICI) при анализе
диоксинов, фуранов и PCB [17] 124
3.3.3.
Использование MS/MS при анализе диоксинов,
фуранов и PCB [20] 125
3.4.
Пример использования MALDI при количественном
анализе полипептидов: вещество Р 133
Список литературы 141
Глава 4. Советы при проведении калибровки
и обработке результатов 143
4.1.
Калибровка 144
4.2.
Постоянная и переменная условная дисперсия 144
4.2.1.
Модели отклонения 145
4.3.
Модели калибровки 145
4.3.1.
Невзвешенная регрессия 146
4.3.1.1.
Калибровочная кривая линейного вида 147
4.3.1.2.
Вычисление концентрации 149
4.3.1.3.
Предел обнаружения и количественного
определения 153
4.3.1.4.
Калибровочная кривая квадратичного вида 155
4.3.2.
Взвешенная регрессия 158
4.3.2.1.
Линейная зависимость калибровочной
кривой при взвешенной регрессии 158
4.3.2.2.
Вычисление концентрации и пределов 160
4.3.2.3.
Калибровочная кривая квадратичного
вида при взвешенной регрессии 162
4.3.3.
Практический пример 165
4.4.
Разные подходы к оценке пределов детектирования
и количественного измерения 170
Список литературы 175
Предисловие
Эта книга родилась благодаря долгому сотрудничеству (и друж-
бе!) между двумя научно-исследовательскими группами, рабо-
тающими в Падуе. Первая группа уже больше тридцати лет ра-
ботает в области аналитической химии, а вторая — примерно
столько же занимается органической масс-спектрометрией. Об-
мен специфическими знаниями и опытом между этими груп-
пами был весьма плодотворным, в особенности, на стадии раз-
вития количественного анализа методами масс-спектрометрии.
Как практические, так и теоретические аспекты работы были
объектами многократных обсуждений, что позволило прояс-
нить многие неясности, возникавшие у работавших в области
исследований и анализа.
В последние двадцать лет масс-спектрометрия развивалась
поразительно быстро, и в настоящее время она является не-
обходимым инструментом в таких областях, как исследование
окружающей среды и биомедицина. Проблема, которая может
возникнуть в связи с этой широкой экспансией, состоит в том,
что масс-спектрометрия часто рассматривается в основном как
«магический ящик», на вход которого подается образец, а на вы-
ходе получают результаты анализа. Программное обеспечение
(и маркетинг!) убрали все сомнения и критический анализ дан-
ных. С помощью этой книги мы хотим дать информацию ис-
следователям и техническим работникам, специлизирующимся
в области количественной органической масс-спектрометрии
об ее основах.
Мы посвятили все наши усилия тому, чтобы книгу было
легко читать исследователям, которые не являются профессио-
нальными физиками или химиками, тем, кто впервые сталки-
вается с проблемами, возникающими при разработке и исполь-
зовании количественного метода. Последняя глава посвящена
описанию теоретических аспектов, касающихся калибровок
и анализа данных. Она предназначена для тех, кто хочет узнать
об этом немного больше.
Для картинки на обложке мы выбрали Доломитовый пик.
То, что он по своей форме напоминает хроматографический
пик, было не главным в нашем выборе. Такой выбор был сделан
потому, что гора является хорошим учителем жизни: если вы
хотите добраться до вершины горы напрямик, вам необходимо
затратить очень много энергии, при другом подходе вы долж-
ны изучить структуру горы и разработать маршрут, который
позволит дойти до вершины с меньшими затратами энергии.
Другими словами, каждая вершина, которую предстоит по-
корить, потребует от вас выработки общей стратегии, а также
многих тактических маневров, которые придется совершать на
всем пути. Точно такой же подход придется использовать и при
разработке количественного анализа с использованием масс-
спектрометрии: будьте уверены в каждом вашем шаге, иначе вы
никогда не доберетесь до вершин!
Предисловие к российскому изданию
Масс-спектрометрия является наиболее информативным мето-
дом анализа веществ во всех агрегатных состояниях. В последние
два десятилетия особенно бурно развиваются ее направления,
связанные с анализом смесей биологического происхождения,
с задачами экологии и контроля пищевых продуктов. В отече-
ственной научной литературе по масс-спектрометрии отсут-
ствуют современные пособия по этим вопросам.
Книга представляет хорошее введение в область коли-
чественного масс-спектрометрического анализа. Она крат-
ко знакомит читателя с основными современными метода-
ми ионизации, разделения ионов по массам, сопряжения
масс-спектрометров с хроматографами и методами обработки
масс-спектрометрической информации. Разделы книги, по-
священные собственно методикам анализа насыщены удачно
выбраными примерами, что облегчает восприятие материала.
Книга вполне может быть использована в практической рабо-
те ( в совокупности с описанием конкретного хромато -масс-
спектрометрического устройства, на котором проводится анализ)
, так как приведенные в ней методические приемы не сильно
зависят от применяемого инструментария и не претерпевают
столь быстрых изменений, какие происходят области разработ-
ки масс-спектрометрических и разделительных устройств.
Последняя глава посвящена изложению методов статисти-
ческой обработки результатов масс-спектометрического коли-
чественного анализа. Она может служить введением в область,
однако для более глубокого понимания материала этой главы
необходимо обращение к стандартным учебникам по статисти-
ческой обработке результатов измерений.
В книге приведены и использованы практически все тер-
мины, применяемые в современной аналитической масс-
спектрометрии. Мы сохранили все сокращения в их ориги-
нальном написании и свели их в таблицу, в которой дали их
расшифровку и перевод.
Доктор ф.-м. наук, профессор
Николаев Е.Н.
Благодарности
Авторы искренне благодарят доктора Роберту Зуграндо (Roberta
Zaugrando) из университета Венеции за предоставленные
данные по диоксинам, а также профессора Глориано Монети
(Gloriano Moneti) и Джузеппе Пьеррачини (Giuseppe Pieraccini)
из университета Флоренции за данные по исследованию тесто-
стерона.
Введение
В настояшее время масс-спектрометрия (МС) является наибо-
лее часто используемым методом при проведении количествен-
ного анализа. Ее специфичность, селективность и типичные
пределы обнаружения обычно более чем достаточны для боль-
шинства аналитических задач.
Это является результатом значительных усилий либо со
стороны ученых работающих в этой области, либо со стороны
индустрии, направленных на развитие новых методов иониза-
ции, расширяющих области применения масс-спектрометрии,
и новых анализаторов, способных повысить специфичность
в основном за счет столкновительных экспериментов (МС/МС
или «тандемной масс-спектрометрии») или за счет точного из-
мерения масс.
Панорама масс-спектрометрии заполнена различными кон-
фигурациями приборов, каждая их которых имеет свои силь-
ные и слабые стороны и различные отношения цена/качество.
Конечно, эти масс-спектрометрические подходы обычно
используются в сочетании с подходящей хроматографической
системой (Х). Получаемый синэргизм позволяет использовать
хромато-масс-спектрометрию при исследовании вопросов фун-
даментальной химии, контроля окружающей среды и пищи,
биохимии, биологии и медицины.
Есть все основания ожидать, что расширение этого подхода
в будущем будет расти благодаря надежности, которая обеспе-
чивается количественными методами в масс-спектрометрии,
в особенности в области здравоохранения. По этой причине
представляет интерес некоторая основная информация о физи-
ческих явлениях, составляющих основу различных инструмен-
тальных подходов, об общей стратегии, которая применяется
для разработки количественного анализа, о роли специфично-
сти в этом контексте и о некоторых теоретических аспектах ка-
либровки и анализа данных В этой книге мы постарались как
можно более просто и понятно осветить все эти вопросы.
Глава 1
Доступные
инструментальные
подходы
Фантастически быстрое развитие масс-спектрометрии (MS) за
последние 30 лет привело к тому, что эта технология применя-
ется практически во всех аналитических задачах. Мы ограни-
чимся рассмотрением таких областей, как органическая химия,
биология и медицина, поскольку именно здесь MS использует-
ся наиболее широко. Эта глава посвящена краткому описанию
различных инструментальных подходов, которые в настоящее
время используются и приборы для которых являются коммер-
чески доступными.
MS основана на получении ионов из аналита, анализе от-
ношения их массы к заряду (m / z) и их детектировании. Как
следствие на инструментальном уровне для выполнения масс-
спектрометрического эксперимента необходимы как минимум
три компонента прибора: (1) источник ионов; (2) анализатор; (3)
детектор (рис. 1.1). Естественно, что характеристики этих трех
узлов в значительной мере обусловливают качество как качествен-
ного, так и количественного анализа. Необходимо подчеркнуть,
что, как правило, эти три узла пространственно разделены друг от
друга (рис. 1.1, а) и только в двух случаях (ионная ловушка Пауля
и масс-спектрометр с преобразованием Фурье без внешнего ис-
точника ионов) они могут занимать то же самое физическое про-
странство, а, следовательно, в этих случаях процессы ионизации
и анализа должны быть разделены во времени (рис. 1.1, б).
1.1. И сточники ионов
Качество полученных при помощи MS данных очень сильно
зависит от способа получения ионов. Выбор метода ионизации
16 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
определяется физико-химическими свойствами, интересующи-
ми нас, аналита(ов) (летучесть, молекулярный вес, термостой-
кость, сложность матрицы, в которой содержится аналит).
В общем можно сказать, что все применяемые обычно ис-
точники ионов разделяются на две основные группы: в источ-
никах первой группы образец необходимо переводить в газовую
фазу перед ионизацией, в источниках второй группы можно
работать со слаболетучими веществами с большой молекуляр-
ной массой.
К первой группе можно отнести источники с электронной
ионизацией (EI) и химической ионизацией (CI). Эти источни-
ки распространены наиболее широко, поскольку они активно
Cистема управления прибором
и обработки данных
Рис. 1.1. Конструкции масс-спектрометра с: а — «простран-
ственным» и б — «временным» разделениями
Cистема
ввода
образца
а
б
Ис-
точник
ионов
Анали-
затор
Системы откачки
Система управления прибором
и обработки данных
Блок
вода
образца
Источник ионов
и анализатор
Детек-
тор
Детек-
тор
Системы откачки
MS с «про-
странственным
разделением»
MS с «вре-
менным раз-
делением»
1.1. Источники ионов 17
используются в системах GC/MS. Остальные источники можно
разделить еще на две группы: к первой отнести источники ио-
нов, работающие с растворами образцов (ионизация электро-
распылением (ESI), химическая ионизация при атмосферном
давлении (APCI), фотоионизация при атмосферном давлении
(APPI)), ко второй — источники, основанные на протекающих
одновременно процессах десорбции и ионизации из твердого
субстрата [лазерная десорбция-ионизация из матрицы (ЛДИ-
ИМ) или лазерная десорбция-ионизация (ЛДИ)].
1.1.1. Электронная ионизация
EI основана на взаимодействии пучка электронов с энергией
около 70 эВ c образцом, переведенным в газовую фазу (при
давлении пара в пределах от 10–7—10–5 Торр) (рис. 1.2). Появле-
ние ряда ионов при взаимодействии электронов с молекулами
образца зависит от химических свойств исследуемого вещества.
Теоретическое рассмотрение EI выходит за рамки этой книги,
и его можно найти в других публикациях [1]. Для наших целей
достаточно принять во внимание, что при EI в результате по-
тери нейтральной молекулой электрона образуются молекуляр-
ные ионы М+•,
M+e− →M+• + 2e−.
Кроме этого также образуются серии фрагментных ионов,
обычно очень информативные с точки зрения определения
структуры молекулы:
A+
B+
C+
M+
Некоторые из них появляются из-за простого разрыва хи-
мической связи, тогда как другие — за счет процессов перегруп-
пировки. Необходимо подчеркнуть, что EI приводит к хорошо
воспроизводимым спектрам. Другими словами, при использо-
18 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
вании различных источников EI спектры получаются практи-
чески одинаковыми, благодаря чему можно создавать библио-
теки спектров EI.
Основные усилия в последние десятилетия были сосредото-
чены на создании источника с максимальным выходом ионов.
Для этого, с одной стороны, оптимизируют геометрические
параметры источника (в основном это заключается в подбо-
ре подходящей ионной оптики, которая позволит увеличить
как эффективность образования ионов, так и эффективность
их вытягивания), с другой стороны, подбирают материал для
изготовления стенок источника ионов таким образом, чтобы
Рис. 1.2. Схема источника ионов с EI. Электроны вылетают
с нити накала, ускоряются разностью потенциалов
между нитью и камерой ионов и фокусируются на ми-
шени. Постоянный магнит (N-S) расположен соосно
с пучком электронов, что приводит к циклоидальной
траектории (и, как следствие, к увеличению взаимо-
действия с нейтральными молекулами) и увеличению
выхода ионов. Выталкивающий электрод способствует
более глубокому проникновению ускоряющего поля,
что также приводит к более высокой эффективности
вытягивания ионов
Нить накала
N
S
Ускоряющая
пластина
Ионы
Фокусирующие
линзы
Образец
Выталкивающий
электрод
1.1. Источники ионов 19
сделать их более инертными, что способствует уменьшению по-
терь образца за счет пиролиза на горячей металлической по-
верхности.
На количественные результаты, полученные при помощи EI,
влияют, в основном, два параметра: потери, связанные с вво-
дом образца и «открытой» конфигурацией источника, а также
вызванные термическим разложением как при подаче образца,
так и в самом источнике ионов, и выход образовавшихся ионов,
вызванный неидеальными параметры поля для извлечения об-
разованных ионов, за счет присутствия загрязненных поверх-
ностей. Эти два аспекта сказываются не только на величине
нижнего предела обнаружения (LOD), но также и на линейно-
сти количественных результатов.
С точки зрения количественного анализа наиболее пока-
зательным является ион М+•. Однако есть широкий класс ве-
ществ, которые легко могут быть переведены в газообразное со-
стояние, но не образуют ионов М+•. Это связано с энергетикой
процессов диссоциации, вызываемой ионизацией EI. Другими
словами, если диссоциация молекулы является энергетически
выгодным процессом, то она происходит сразу же после об-
разования иона М+• за счет его внутренней энергии. Для того,
чтобы избежать диссоциации, в 60-х годах прошлого века был
разработан другой метод ионизации, основанный на газофаз-
ных химических реакциях.
1.1.2. Х имическая ионизация (CI)
Чтобы уменьшить передачу энергии интересующим нас моле-
кулам, что должно отражаться в образовании из них главным
образом молекулярных ионов, в 60-е годы были предложены
методы химической ионизации [2]. Они основаны на образо-
вании в газовой фазе кислотных или основных ионов, взаи-
модействуя с которыми, нейтральная молекула будет или при-
обретать протон, или терять его, образовывая ионы [M + H]+
или [M – H]–. Реакции протонирования используются чаще;
возможность протекания этих реакций определяется такими
параметрами, как сродство к протону (РА) газа-реагента и ис-
следуемого вещества, а внутренняя энергия полученного иона
равна разности этих двух величин. В качестве примера рассмо-
трим эксперимент с органической молекулой, сродство к про-
20 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
тону которой составляет 180 ккал/моль. Она может быть про-
тонирована в реакции с: CH5
+ (PACH4
= 127 ккал/моль), H3O+
(PAH2O = 165 ккал/моль) и не может быть протонирована при
взаимодействии с NH4
+ (PANH3
= 205 ккал/моль) [3]. Этот при-
мер показывает важный момент: при CI можно эффективно
выбирать, какие именно молекулы из сложной смеси окажутся
ионизованы. Другими словами, правильный выбор протониру-
ющего иона [AH]+ приводит к образованию ионов [MH]+ только
для тех молекул, сродство к протону которых выше, чем у газа-
реагента A. Кроме того, процессы фрагментации ионов зависят
от разности [PAM – PAA].
С методической точки зрения CI происходит в результате
введения нейтральных молекул в EI источник ионов, выполнен-
ный в «закрытой» конфигурации, что позволяет создавать в ней
высокое давление (рис. 1.3). Если правильно подобрать условия,
то будут образовываться главным образом ионы [A + H]+ (или
[B – H]– в случае отрицательно заряженных ионов). При про-
Рис. 1.3. Схема источника ионов с CI. Отверстия для входа
электронов и выхода ионов уменьшены, что позволя-
ет получить внутри этой ионной камеры достаточное
давление газа-реагента
Нить накала
Ускоряющие
пластины
Ионы
Фокусирующие
линзы
Образец
N
S
Газ-реаген
Выталкивающий
электрод
ведении количественных экспериментов необходимо тщательно
следить за воспроизведением этих экспериментальных условий,
поскольку они, в частности, сильно влияют на нижний предел
обнаружения.
Как при EI, так и при CI образец должен быть переведен
в газофазную форму, поэтому эти методы неприменимы к не-
летучим молекулам. С 1960-х годов для преодоления этого огра-
ничения предпринимались значительные усилия: в частности,
были разработаны такие методы, как полевая десорбция (FD)
[4] и бомбардировка быстрыми атомами (FAB), открывшие но-
вые области применений масс-спектрометрии. Недавно появи-
лись методы, позволившие анализировать нелетучие молекулы
и молекулы с высокой молекулярной массой: APCI [6], ESI [7],
APPI [8] и MALDI [9].
1.1.3. Х имическая ионизация при атмосферном
давлении
Разработка метода APCI [6] началась после того, как было заме-
чено, что выход газофазной реакции зависит не только от пар-
циального давления двух реагентов, но и от общего давления
в камере. Поэтому переход от классического источника с CI,
рабочее давление в котором составляло 0,1—1 Торр, к источнику
с атмосферным давлением может в принципе привести к значи-
тельному возрастанию количества образовавшихся ионов и, как
следствие, к значительному увеличению чувствительности.
В самом начале исследований по разработке APCI стояла
задача выбора метода ионизации. Наиболее подходящим и эф-
фективным был и остается метод коронного разряда. Важность
этого метода ионизации заключается в том, что его можно ис-
пользовать при анализе веществ, растворенных в соответству-
ющем растворителе: раствор вводится в нагреваемый капил-
ляр (с температурой 350—400°С), который служит испарителем.
Раствор испаряется и двигается к выходу из капилляра в об-
ласть атмосферного давления, где происходит коронный разряд.
Обычно cоосно капилляру идет поток азота, способствующий
процессу испарения (рис. 1.4). Механизм ионизации в общем
такой же, как и при CI (рис. 1.5). Те молекулы растворителя,
которые преобладают в растворе, чаще взаимодействуют с по-
током электронов от коронного разряда; образовавшиеся ионы
22 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
взаимодействуют с другими молекулами растворителя, что
приводит к протонированию (в случае анализа положительно
заряженных ионов) или депротонированию (в случае анализа
отрицательно заряженных ионов) последних, и они становятся
реагентами для ионизации молекул образца. Среди трудностей,
с которыми столкнулись разработчики этого метода, было об-
разование кластеров исследуемых молекул с растворителем.
Для декластеризации предлагалось несколько способов, среди
которых наиболее эффективными оказались использование не-
реакционных столкновения с молекулами другого газа (обычно
азота) и температурная обработка. Эти методы используются до
сих пор. Предлагались также и различные конфигурации при-
бора, отличающиеся углом между входным капилляром (или
скиммером) и испарителем. Наибольшее распространение по-
лучили приборы с геометрией «в линию» (180°) или ортого-
нальной (90°) геометрией.
При проведении количественных экспериментов особое
внимание необходимо уделять поиску оптимальных условий
для работы APCI (температура испарения и скорость потока
образца), приводящих к наиболее стабильному сигналу и тща-
тельному поддержанию этих условий во всех дальнейших из-
мерениях.
Рис. 1.4. Схема источника ионов с APCI
К ана-
лизато-
ру
Игла
коронного
разряда Кварцевый
капилляр
диаметром
100 мкм
N2
Раствор
Область
нагрева
Заземленная
металлическая
поверхность
1.1. Источники ионов 23
1.1.4. И онизация электрораспылением
Ионизация электрораспылением [7] происходит при выталкива-
нии раствора образца через металлический капилляр1, в присут-
ствии сильного электрического поля. Образование ионов можно
рассматривать как трехэтапный процесс: (1) образование заря-
женных капель вблизи выхода из капилляра; (2) быстрое умень-
шение размера капель за счет испарения растворителя и после-
дующего образования более мелких капель за счет кулоновского
отталкивания зарядов на поверхности капли; (3) образование
ионов в газовой фазе из маленьких заряженных капель.
Схема прибора с ионизацией электрораспыленим показа-
на на рис. 1.6. К металлической игле (с радиусом rc около 10–4
1 В настоящее время в качестве материала распылительной иглы-
капилляра чаще используется плавленый кварц. – Ред.
Рис. 1.5. Область коронного разряда в APCI и протекающие
в ней химические процессы
Область коронного
разряда
Жидкость
Пары растворителя
при высоком
давлении
24 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
м), из которой вытекает раствор, приложено напряжение (Vc)
2—5 кВ. Противоэлектрод расположен на расстоянии (d) от 1 до
3 сантиметров. Этим электродом является или скиммер с от-
верстием диаметром около 10 мкм, или нагреваемый входной
капилляр (с диаметром 100—500 мкм и длиной 5—10 см), ко-
торый служит интерфейсом, отделяющим источник от масс-
анализатора. Поскольку игла, из которой вытекает раствор, до-
вольно тонкая, то напряженность электрического поля вблизи
нее достаточно велика. Например, согласно расчетам Пфайфера
и Хендрикса [10], если rc = 10–4 м, Vc = 2000 В, d = 0,02 м, то на-
пряженность электрического поля будет составлять примерно
6 × 106 В/см. Это электрическое поле взаимодействует с раство-
ром, и заряженные молекулы, присутствующие в этом раство-
ре, двигаются к поверхности, что приводит к образованию так
называемого «конуса Тейлора» [11]. Если напряженность поля
Рис. 1.6. Схема источника ионов с ESI и показанная с боль-
шим увеличением область образования капель. (Про-
порции между размерами конуса Тейлора и капель не
соблюдены)
Образование
дочерних
капель
Игла
Раствор
N2
Капилляр
К ана-
лизато-
ру
Конус
Тейлора
Испарение
раствори-
теля
1.1. Источники ионов 25
достаточно высока, то начинается отрыв заряженных капель
с вершины этого конуса. В случае анализа положительно за-
ряженных ионов к капилляру приложен положительный по-
тенциал, и капли заряжены положительно, при анализе от-
рицательно заряженных ионов — наоборот. Заряженная капля
двигается через атмосферу к противоэлектроду под действием
электростатического поля. Испарение растворителя приводит
к уменьшению радиуса капли, вследствие чего увеличивает-
ся составляющая поля, направленная перпендикулярно по-
верхности капли. При определенном значении радиуса капли
отталкивание зарядов на ее поверхности превышает силу по-
верхностного натяжения, и происходит деление с образованием
дочерних капель.
Для объяснения процесса получения ионов в газовой фазе
при ESI было предложено два механизма. Первый был сформу-
лирован в 1968 году [12] и называется «механизм остаточного
заряда» (CRM — charge residue model). В нем предполагается,
что процесс образования дочерних капель приводит к заряжен-
ным каплям маленького размера, в которых содержатся только
Рис. 1.7. Зависимость интенсивности сигнала от концентрации
исследуемого вещества (morphine HCl), полученная
в экспериментах с электрораспылением. Перепечата-
но из работы P. Kebarle, L. Tang, Anal. Chem. 65, 980A
(1993) с разрешения Американского Химического Об-
щества
26 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
одна исследуемая молекула и несколько молекул растворителя.
Когда и они испаряются, заряд переходит на молекулу образца,
и образуется наиболее стабильный ион в газовой фазе.
Позднее был предложен другой механизм, описывающий
эмиссию ионов в газовую фазу непосредственно с поверхно-
сти капли, после того как она достигает определенного размера
[13]. Этот процесс, получивший название «механизм испарения
ионов» (IEM — ion evaporation mechanism), преобладает над ку-
лоновским делением, если радиус капли меньше чем 10 мкм.
Из вышесказанного читатель может понять, какие факто-
ры сильнее всего влияют на образование ионов и воспроиз-
водимость при измерениях с использованием ESI. Типичная
зависимость интенсивности сигнала от концентрации иссле-
дуемого вещества в растворе приведена на рис. 1.7. При низких
концентрациях меньших, чем 10–6 М, наблюдается линейная
область, с наклоном около 1, за которым следует медленное
насыщение и небольшое уменьшение сигнала при самых вы-
соких концентрациях (10–3 М). Только линейная область,
в которой сигнал пропорционален концентрации, годится
для количественного анализа. Объяснить поведение графика
можно на основании соображений, что в системе присутствует
не одно вещество: всегда есть другие электролиты: примеси,
другие аналиты и буферы. Необходимо подчеркнуть, что при
концентрации анализируемого вещества меньшей, чем 10–5 М,
электрораспыление возникает за счет электролитов, присут-
ствующих в растворе в качестве примесей, благодаря которым
у жидкости возникает проводимость, необходимая для появ-
ления «конуса Тейлора».
В случае ионизации электрораспылением также были пред-
ложены и используются «прямая» и «ортогональная» геометрии
ввода образца.
1.1.5. Фотоионизация при атмосферном давлении
Этот метод был разработан относительно недавно [8]. Он осно-
ван на облучении испаренного при атмосферном давлении рас-
твора образца обычной криптоновой лампой. Устройство ион-
ного источника очень похоже на то, которое было уже описано
для системы APCI (рис. 1.8). Только здесь отсутствует игла для
коронного разряда, а устройство для испарения раствора точно
такое же. На источнике смонтирована криптоновая лампа та-
ким образом, чтобы испаренный образец облучался фотонами
с энергией до 10.6 эВ. Для фотоионизации существует простое
правило: молекула с энергией ионизации IEM будет ионизиро-
вана фотоном с энергией Eν = hν, только если
IEM ≤ hν.
Имея в виду, что у молекул большинства растворителей,
используемых в жидкостной хроматографии (LC), потенциал
ионизации больше, чем 10.6 эВ, а следовательно они не мо-
гут ионизоваться при облучении криптоновой лампой, мож-
но предположить, что APPI должен быть очень эффективен
при проведении анализа методом LC/MS веществ, потенци-
ал ионизации которых ниже, чем 10.6 эВ. Для веществ с бо-
лее высоким потенциалом ионизации был предложен метод,
в котором используются специальные фотоионизуемые при-
садки, которые передают заряд молекулам интересующих нас
веществ [8].
Рис. 1.8. Схема источника ионов с APPI
Газ-распылитель
Ввод образца после HPLC
Распылитель
Поток газа, способ-
ствующего испарению
Осушающий газ
Капилляр
УФ лампа
Некоторые исследователи показали, что в источнике ио-
нов с APPI могут проходить неожиданные реакции [14], что
свидетельствует о том, что этот метод можно применять не
только для аналитических целей, но и для фундаментальных
исследований в области органической химии и химии окру-
жающей среды.
Эта книга родилась благодаря долгому сотрудничеству (и друж-
бе!) между двумя научно-исследовательскими группами, рабо-
тающими в Падуе. Первая группа уже больше тридцати лет ра-
ботает в области аналитической химии, а вторая — примерно
столько же занимается органической масс-спектрометрией. Об-
мен специфическими знаниями и опытом между этими груп-
пами был весьма плодотворным, в особенности, на стадии раз-
вития количественного анализа методами масс-спектрометрии.
Как практические, так и теоретические аспекты работы были
объектами многократных обсуждений, что позволило прояс-
нить многие неясности, возникавшие у работавших в области
исследований и анализа.
В последние двадцать лет масс-спектрометрия развивалась
поразительно быстро, и в настоящее время она является не-
обходимым инструментом в таких областях, как исследование
окружающей среды и биомедицина. Проблема, которая может
возникнуть в связи с этой широкой экспансией, состоит в том,
что масс-спектрометрия часто рассматривается в основном как
«магический ящик», на вход которого подается образец, а на вы-
ходе получают результаты анализа. Программное обеспечение
(и маркетинг!) убрали все сомнения и критический анализ дан-
ных. С помощью этой книги мы хотим дать информацию ис-
следователям и техническим работникам, специлизирующимся
в области количественной органической масс-спектрометрии
об ее основах.
Мы посвятили все наши усилия тому, чтобы книгу было
легко читать исследователям, которые не являются профессио-
нальными физиками или химиками, тем, кто впервые сталки-
вается с проблемами, возникающими при разработке и исполь-
зовании количественного метода. Последняя глава посвящена
описанию теоретических аспектов, касающихся калибровок
и анализа данных. Она предназначена для тех, кто хочет узнать
об этом немного больше.
Для картинки на обложке мы выбрали Доломитовый пик.
То, что он по своей форме напоминает хроматографический
пик, было не главным в нашем выборе. Такой выбор был сделан
потому, что гора является хорошим учителем жизни: если вы
хотите добраться до вершины горы напрямик, вам необходимо
затратить очень много энергии, при другом подходе вы долж-
ны изучить структуру горы и разработать маршрут, который
позволит дойти до вершины с меньшими затратами энергии.
Другими словами, каждая вершина, которую предстоит по-
корить, потребует от вас выработки общей стратегии, а также
многих тактических маневров, которые придется совершать на
всем пути. Точно такой же подход придется использовать и при
разработке количественного анализа с использованием масс-
спектрометрии: будьте уверены в каждом вашем шаге, иначе вы
никогда не доберетесь до вершин!
Предисловие к российскому изданию
Масс-спектрометрия является наиболее информативным мето-
дом анализа веществ во всех агрегатных состояниях. В последние
два десятилетия особенно бурно развиваются ее направления,
связанные с анализом смесей биологического происхождения,
с задачами экологии и контроля пищевых продуктов. В отече-
ственной научной литературе по масс-спектрометрии отсут-
ствуют современные пособия по этим вопросам.
Книга представляет хорошее введение в область коли-
чественного масс-спектрометрического анализа. Она крат-
ко знакомит читателя с основными современными метода-
ми ионизации, разделения ионов по массам, сопряжения
масс-спектрометров с хроматографами и методами обработки
масс-спектрометрической информации. Разделы книги, по-
священные собственно методикам анализа насыщены удачно
выбраными примерами, что облегчает восприятие материала.
Книга вполне может быть использована в практической рабо-
те ( в совокупности с описанием конкретного хромато -масс-
спектрометрического устройства, на котором проводится анализ)
, так как приведенные в ней методические приемы не сильно
зависят от применяемого инструментария и не претерпевают
столь быстрых изменений, какие происходят области разработ-
ки масс-спектрометрических и разделительных устройств.
Последняя глава посвящена изложению методов статисти-
ческой обработки результатов масс-спектометрического коли-
чественного анализа. Она может служить введением в область,
однако для более глубокого понимания материала этой главы
необходимо обращение к стандартным учебникам по статисти-
ческой обработке результатов измерений.
В книге приведены и использованы практически все тер-
мины, применяемые в современной аналитической масс-
спектрометрии. Мы сохранили все сокращения в их ориги-
нальном написании и свели их в таблицу, в которой дали их
расшифровку и перевод.
Доктор ф.-м. наук, профессор
Николаев Е.Н.
Благодарности
Авторы искренне благодарят доктора Роберту Зуграндо (Roberta
Zaugrando) из университета Венеции за предоставленные
данные по диоксинам, а также профессора Глориано Монети
(Gloriano Moneti) и Джузеппе Пьеррачини (Giuseppe Pieraccini)
из университета Флоренции за данные по исследованию тесто-
стерона.
Введение
В настояшее время масс-спектрометрия (МС) является наибо-
лее часто используемым методом при проведении количествен-
ного анализа. Ее специфичность, селективность и типичные
пределы обнаружения обычно более чем достаточны для боль-
шинства аналитических задач.
Это является результатом значительных усилий либо со
стороны ученых работающих в этой области, либо со стороны
индустрии, направленных на развитие новых методов иониза-
ции, расширяющих области применения масс-спектрометрии,
и новых анализаторов, способных повысить специфичность
в основном за счет столкновительных экспериментов (МС/МС
или «тандемной масс-спектрометрии») или за счет точного из-
мерения масс.
Панорама масс-спектрометрии заполнена различными кон-
фигурациями приборов, каждая их которых имеет свои силь-
ные и слабые стороны и различные отношения цена/качество.
Конечно, эти масс-спектрометрические подходы обычно
используются в сочетании с подходящей хроматографической
системой (Х). Получаемый синэргизм позволяет использовать
хромато-масс-спектрометрию при исследовании вопросов фун-
даментальной химии, контроля окружающей среды и пищи,
биохимии, биологии и медицины.
Есть все основания ожидать, что расширение этого подхода
в будущем будет расти благодаря надежности, которая обеспе-
чивается количественными методами в масс-спектрометрии,
в особенности в области здравоохранения. По этой причине
представляет интерес некоторая основная информация о физи-
ческих явлениях, составляющих основу различных инструмен-
тальных подходов, об общей стратегии, которая применяется
для разработки количественного анализа, о роли специфично-
сти в этом контексте и о некоторых теоретических аспектах ка-
либровки и анализа данных В этой книге мы постарались как
можно более просто и понятно осветить все эти вопросы.
Глава 1
Доступные
инструментальные
подходы
Фантастически быстрое развитие масс-спектрометрии (MS) за
последние 30 лет привело к тому, что эта технология применя-
ется практически во всех аналитических задачах. Мы ограни-
чимся рассмотрением таких областей, как органическая химия,
биология и медицина, поскольку именно здесь MS использует-
ся наиболее широко. Эта глава посвящена краткому описанию
различных инструментальных подходов, которые в настоящее
время используются и приборы для которых являются коммер-
чески доступными.
MS основана на получении ионов из аналита, анализе от-
ношения их массы к заряду (m / z) и их детектировании. Как
следствие на инструментальном уровне для выполнения масс-
спектрометрического эксперимента необходимы как минимум
три компонента прибора: (1) источник ионов; (2) анализатор; (3)
детектор (рис. 1.1). Естественно, что характеристики этих трех
узлов в значительной мере обусловливают качество как качествен-
ного, так и количественного анализа. Необходимо подчеркнуть,
что, как правило, эти три узла пространственно разделены друг от
друга (рис. 1.1, а) и только в двух случаях (ионная ловушка Пауля
и масс-спектрометр с преобразованием Фурье без внешнего ис-
точника ионов) они могут занимать то же самое физическое про-
странство, а, следовательно, в этих случаях процессы ионизации
и анализа должны быть разделены во времени (рис. 1.1, б).
1.1. И сточники ионов
Качество полученных при помощи MS данных очень сильно
зависит от способа получения ионов. Выбор метода ионизации
16 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
определяется физико-химическими свойствами, интересующи-
ми нас, аналита(ов) (летучесть, молекулярный вес, термостой-
кость, сложность матрицы, в которой содержится аналит).
В общем можно сказать, что все применяемые обычно ис-
точники ионов разделяются на две основные группы: в источ-
никах первой группы образец необходимо переводить в газовую
фазу перед ионизацией, в источниках второй группы можно
работать со слаболетучими веществами с большой молекуляр-
ной массой.
К первой группе можно отнести источники с электронной
ионизацией (EI) и химической ионизацией (CI). Эти источни-
ки распространены наиболее широко, поскольку они активно
Cистема управления прибором
и обработки данных
Рис. 1.1. Конструкции масс-спектрометра с: а — «простран-
ственным» и б — «временным» разделениями
Cистема
ввода
образца
а
б
Ис-
точник
ионов
Анали-
затор
Системы откачки
Система управления прибором
и обработки данных
Блок
вода
образца
Источник ионов
и анализатор
Детек-
тор
Детек-
тор
Системы откачки
MS с «про-
странственным
разделением»
MS с «вре-
менным раз-
делением»
1.1. Источники ионов 17
используются в системах GC/MS. Остальные источники можно
разделить еще на две группы: к первой отнести источники ио-
нов, работающие с растворами образцов (ионизация электро-
распылением (ESI), химическая ионизация при атмосферном
давлении (APCI), фотоионизация при атмосферном давлении
(APPI)), ко второй — источники, основанные на протекающих
одновременно процессах десорбции и ионизации из твердого
субстрата [лазерная десорбция-ионизация из матрицы (ЛДИ-
ИМ) или лазерная десорбция-ионизация (ЛДИ)].
1.1.1. Электронная ионизация
EI основана на взаимодействии пучка электронов с энергией
около 70 эВ c образцом, переведенным в газовую фазу (при
давлении пара в пределах от 10–7—10–5 Торр) (рис. 1.2). Появле-
ние ряда ионов при взаимодействии электронов с молекулами
образца зависит от химических свойств исследуемого вещества.
Теоретическое рассмотрение EI выходит за рамки этой книги,
и его можно найти в других публикациях [1]. Для наших целей
достаточно принять во внимание, что при EI в результате по-
тери нейтральной молекулой электрона образуются молекуляр-
ные ионы М+•,
M+e− →M+• + 2e−.
Кроме этого также образуются серии фрагментных ионов,
обычно очень информативные с точки зрения определения
структуры молекулы:
A+
B+
C+
M+
Некоторые из них появляются из-за простого разрыва хи-
мической связи, тогда как другие — за счет процессов перегруп-
пировки. Необходимо подчеркнуть, что EI приводит к хорошо
воспроизводимым спектрам. Другими словами, при использо-
18 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
вании различных источников EI спектры получаются практи-
чески одинаковыми, благодаря чему можно создавать библио-
теки спектров EI.
Основные усилия в последние десятилетия были сосредото-
чены на создании источника с максимальным выходом ионов.
Для этого, с одной стороны, оптимизируют геометрические
параметры источника (в основном это заключается в подбо-
ре подходящей ионной оптики, которая позволит увеличить
как эффективность образования ионов, так и эффективность
их вытягивания), с другой стороны, подбирают материал для
изготовления стенок источника ионов таким образом, чтобы
Рис. 1.2. Схема источника ионов с EI. Электроны вылетают
с нити накала, ускоряются разностью потенциалов
между нитью и камерой ионов и фокусируются на ми-
шени. Постоянный магнит (N-S) расположен соосно
с пучком электронов, что приводит к циклоидальной
траектории (и, как следствие, к увеличению взаимо-
действия с нейтральными молекулами) и увеличению
выхода ионов. Выталкивающий электрод способствует
более глубокому проникновению ускоряющего поля,
что также приводит к более высокой эффективности
вытягивания ионов
Нить накала
N
S
Ускоряющая
пластина
Ионы
Фокусирующие
линзы
Образец
Выталкивающий
электрод
1.1. Источники ионов 19
сделать их более инертными, что способствует уменьшению по-
терь образца за счет пиролиза на горячей металлической по-
верхности.
На количественные результаты, полученные при помощи EI,
влияют, в основном, два параметра: потери, связанные с вво-
дом образца и «открытой» конфигурацией источника, а также
вызванные термическим разложением как при подаче образца,
так и в самом источнике ионов, и выход образовавшихся ионов,
вызванный неидеальными параметры поля для извлечения об-
разованных ионов, за счет присутствия загрязненных поверх-
ностей. Эти два аспекта сказываются не только на величине
нижнего предела обнаружения (LOD), но также и на линейно-
сти количественных результатов.
С точки зрения количественного анализа наиболее пока-
зательным является ион М+•. Однако есть широкий класс ве-
ществ, которые легко могут быть переведены в газообразное со-
стояние, но не образуют ионов М+•. Это связано с энергетикой
процессов диссоциации, вызываемой ионизацией EI. Другими
словами, если диссоциация молекулы является энергетически
выгодным процессом, то она происходит сразу же после об-
разования иона М+• за счет его внутренней энергии. Для того,
чтобы избежать диссоциации, в 60-х годах прошлого века был
разработан другой метод ионизации, основанный на газофаз-
ных химических реакциях.
1.1.2. Х имическая ионизация (CI)
Чтобы уменьшить передачу энергии интересующим нас моле-
кулам, что должно отражаться в образовании из них главным
образом молекулярных ионов, в 60-е годы были предложены
методы химической ионизации [2]. Они основаны на образо-
вании в газовой фазе кислотных или основных ионов, взаи-
модействуя с которыми, нейтральная молекула будет или при-
обретать протон, или терять его, образовывая ионы [M + H]+
или [M – H]–. Реакции протонирования используются чаще;
возможность протекания этих реакций определяется такими
параметрами, как сродство к протону (РА) газа-реагента и ис-
следуемого вещества, а внутренняя энергия полученного иона
равна разности этих двух величин. В качестве примера рассмо-
трим эксперимент с органической молекулой, сродство к про-
20 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
тону которой составляет 180 ккал/моль. Она может быть про-
тонирована в реакции с: CH5
+ (PACH4
= 127 ккал/моль), H3O+
(PAH2O = 165 ккал/моль) и не может быть протонирована при
взаимодействии с NH4
+ (PANH3
= 205 ккал/моль) [3]. Этот при-
мер показывает важный момент: при CI можно эффективно
выбирать, какие именно молекулы из сложной смеси окажутся
ионизованы. Другими словами, правильный выбор протониру-
ющего иона [AH]+ приводит к образованию ионов [MH]+ только
для тех молекул, сродство к протону которых выше, чем у газа-
реагента A. Кроме того, процессы фрагментации ионов зависят
от разности [PAM – PAA].
С методической точки зрения CI происходит в результате
введения нейтральных молекул в EI источник ионов, выполнен-
ный в «закрытой» конфигурации, что позволяет создавать в ней
высокое давление (рис. 1.3). Если правильно подобрать условия,
то будут образовываться главным образом ионы [A + H]+ (или
[B – H]– в случае отрицательно заряженных ионов). При про-
Рис. 1.3. Схема источника ионов с CI. Отверстия для входа
электронов и выхода ионов уменьшены, что позволя-
ет получить внутри этой ионной камеры достаточное
давление газа-реагента
Нить накала
Ускоряющие
пластины
Ионы
Фокусирующие
линзы
Образец
N
S
Газ-реаген
Выталкивающий
электрод
ведении количественных экспериментов необходимо тщательно
следить за воспроизведением этих экспериментальных условий,
поскольку они, в частности, сильно влияют на нижний предел
обнаружения.
Как при EI, так и при CI образец должен быть переведен
в газофазную форму, поэтому эти методы неприменимы к не-
летучим молекулам. С 1960-х годов для преодоления этого огра-
ничения предпринимались значительные усилия: в частности,
были разработаны такие методы, как полевая десорбция (FD)
[4] и бомбардировка быстрыми атомами (FAB), открывшие но-
вые области применений масс-спектрометрии. Недавно появи-
лись методы, позволившие анализировать нелетучие молекулы
и молекулы с высокой молекулярной массой: APCI [6], ESI [7],
APPI [8] и MALDI [9].
1.1.3. Х имическая ионизация при атмосферном
давлении
Разработка метода APCI [6] началась после того, как было заме-
чено, что выход газофазной реакции зависит не только от пар-
циального давления двух реагентов, но и от общего давления
в камере. Поэтому переход от классического источника с CI,
рабочее давление в котором составляло 0,1—1 Торр, к источнику
с атмосферным давлением может в принципе привести к значи-
тельному возрастанию количества образовавшихся ионов и, как
следствие, к значительному увеличению чувствительности.
В самом начале исследований по разработке APCI стояла
задача выбора метода ионизации. Наиболее подходящим и эф-
фективным был и остается метод коронного разряда. Важность
этого метода ионизации заключается в том, что его можно ис-
пользовать при анализе веществ, растворенных в соответству-
ющем растворителе: раствор вводится в нагреваемый капил-
ляр (с температурой 350—400°С), который служит испарителем.
Раствор испаряется и двигается к выходу из капилляра в об-
ласть атмосферного давления, где происходит коронный разряд.
Обычно cоосно капилляру идет поток азота, способствующий
процессу испарения (рис. 1.4). Механизм ионизации в общем
такой же, как и при CI (рис. 1.5). Те молекулы растворителя,
которые преобладают в растворе, чаще взаимодействуют с по-
током электронов от коронного разряда; образовавшиеся ионы
22 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
взаимодействуют с другими молекулами растворителя, что
приводит к протонированию (в случае анализа положительно
заряженных ионов) или депротонированию (в случае анализа
отрицательно заряженных ионов) последних, и они становятся
реагентами для ионизации молекул образца. Среди трудностей,
с которыми столкнулись разработчики этого метода, было об-
разование кластеров исследуемых молекул с растворителем.
Для декластеризации предлагалось несколько способов, среди
которых наиболее эффективными оказались использование не-
реакционных столкновения с молекулами другого газа (обычно
азота) и температурная обработка. Эти методы используются до
сих пор. Предлагались также и различные конфигурации при-
бора, отличающиеся углом между входным капилляром (или
скиммером) и испарителем. Наибольшее распространение по-
лучили приборы с геометрией «в линию» (180°) или ортого-
нальной (90°) геометрией.
При проведении количественных экспериментов особое
внимание необходимо уделять поиску оптимальных условий
для работы APCI (температура испарения и скорость потока
образца), приводящих к наиболее стабильному сигналу и тща-
тельному поддержанию этих условий во всех дальнейших из-
мерениях.
Рис. 1.4. Схема источника ионов с APCI
К ана-
лизато-
ру
Игла
коронного
разряда Кварцевый
капилляр
диаметром
100 мкм
N2
Раствор
Область
нагрева
Заземленная
металлическая
поверхность
1.1. Источники ионов 23
1.1.4. И онизация электрораспылением
Ионизация электрораспылением [7] происходит при выталкива-
нии раствора образца через металлический капилляр1, в присут-
ствии сильного электрического поля. Образование ионов можно
рассматривать как трехэтапный процесс: (1) образование заря-
женных капель вблизи выхода из капилляра; (2) быстрое умень-
шение размера капель за счет испарения растворителя и после-
дующего образования более мелких капель за счет кулоновского
отталкивания зарядов на поверхности капли; (3) образование
ионов в газовой фазе из маленьких заряженных капель.
Схема прибора с ионизацией электрораспыленим показа-
на на рис. 1.6. К металлической игле (с радиусом rc около 10–4
1 В настоящее время в качестве материала распылительной иглы-
капилляра чаще используется плавленый кварц. – Ред.
Рис. 1.5. Область коронного разряда в APCI и протекающие
в ней химические процессы
Область коронного
разряда
Жидкость
Пары растворителя
при высоком
давлении
24 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
м), из которой вытекает раствор, приложено напряжение (Vc)
2—5 кВ. Противоэлектрод расположен на расстоянии (d) от 1 до
3 сантиметров. Этим электродом является или скиммер с от-
верстием диаметром около 10 мкм, или нагреваемый входной
капилляр (с диаметром 100—500 мкм и длиной 5—10 см), ко-
торый служит интерфейсом, отделяющим источник от масс-
анализатора. Поскольку игла, из которой вытекает раствор, до-
вольно тонкая, то напряженность электрического поля вблизи
нее достаточно велика. Например, согласно расчетам Пфайфера
и Хендрикса [10], если rc = 10–4 м, Vc = 2000 В, d = 0,02 м, то на-
пряженность электрического поля будет составлять примерно
6 × 106 В/см. Это электрическое поле взаимодействует с раство-
ром, и заряженные молекулы, присутствующие в этом раство-
ре, двигаются к поверхности, что приводит к образованию так
называемого «конуса Тейлора» [11]. Если напряженность поля
Рис. 1.6. Схема источника ионов с ESI и показанная с боль-
шим увеличением область образования капель. (Про-
порции между размерами конуса Тейлора и капель не
соблюдены)
Образование
дочерних
капель
Игла
Раствор
N2
Капилляр
К ана-
лизато-
ру
Конус
Тейлора
Испарение
раствори-
теля
1.1. Источники ионов 25
достаточно высока, то начинается отрыв заряженных капель
с вершины этого конуса. В случае анализа положительно за-
ряженных ионов к капилляру приложен положительный по-
тенциал, и капли заряжены положительно, при анализе от-
рицательно заряженных ионов — наоборот. Заряженная капля
двигается через атмосферу к противоэлектроду под действием
электростатического поля. Испарение растворителя приводит
к уменьшению радиуса капли, вследствие чего увеличивает-
ся составляющая поля, направленная перпендикулярно по-
верхности капли. При определенном значении радиуса капли
отталкивание зарядов на ее поверхности превышает силу по-
верхностного натяжения, и происходит деление с образованием
дочерних капель.
Для объяснения процесса получения ионов в газовой фазе
при ESI было предложено два механизма. Первый был сформу-
лирован в 1968 году [12] и называется «механизм остаточного
заряда» (CRM — charge residue model). В нем предполагается,
что процесс образования дочерних капель приводит к заряжен-
ным каплям маленького размера, в которых содержатся только
Рис. 1.7. Зависимость интенсивности сигнала от концентрации
исследуемого вещества (morphine HCl), полученная
в экспериментах с электрораспылением. Перепечата-
но из работы P. Kebarle, L. Tang, Anal. Chem. 65, 980A
(1993) с разрешения Американского Химического Об-
щества
26 Глава 1. Доступные инструментальные подходы
одна исследуемая молекула и несколько молекул растворителя.
Когда и они испаряются, заряд переходит на молекулу образца,
и образуется наиболее стабильный ион в газовой фазе.
Позднее был предложен другой механизм, описывающий
эмиссию ионов в газовую фазу непосредственно с поверхно-
сти капли, после того как она достигает определенного размера
[13]. Этот процесс, получивший название «механизм испарения
ионов» (IEM — ion evaporation mechanism), преобладает над ку-
лоновским делением, если радиус капли меньше чем 10 мкм.
Из вышесказанного читатель может понять, какие факто-
ры сильнее всего влияют на образование ионов и воспроиз-
водимость при измерениях с использованием ESI. Типичная
зависимость интенсивности сигнала от концентрации иссле-
дуемого вещества в растворе приведена на рис. 1.7. При низких
концентрациях меньших, чем 10–6 М, наблюдается линейная
область, с наклоном около 1, за которым следует медленное
насыщение и небольшое уменьшение сигнала при самых вы-
соких концентрациях (10–3 М). Только линейная область,
в которой сигнал пропорционален концентрации, годится
для количественного анализа. Объяснить поведение графика
можно на основании соображений, что в системе присутствует
не одно вещество: всегда есть другие электролиты: примеси,
другие аналиты и буферы. Необходимо подчеркнуть, что при
концентрации анализируемого вещества меньшей, чем 10–5 М,
электрораспыление возникает за счет электролитов, присут-
ствующих в растворе в качестве примесей, благодаря которым
у жидкости возникает проводимость, необходимая для появ-
ления «конуса Тейлора».
В случае ионизации электрораспылением также были пред-
ложены и используются «прямая» и «ортогональная» геометрии
ввода образца.
1.1.5. Фотоионизация при атмосферном давлении
Этот метод был разработан относительно недавно [8]. Он осно-
ван на облучении испаренного при атмосферном давлении рас-
твора образца обычной криптоновой лампой. Устройство ион-
ного источника очень похоже на то, которое было уже описано
для системы APCI (рис. 1.8). Только здесь отсутствует игла для
коронного разряда, а устройство для испарения раствора точно
такое же. На источнике смонтирована криптоновая лампа та-
ким образом, чтобы испаренный образец облучался фотонами
с энергией до 10.6 эВ. Для фотоионизации существует простое
правило: молекула с энергией ионизации IEM будет ионизиро-
вана фотоном с энергией Eν = hν, только если
IEM ≤ hν.
Имея в виду, что у молекул большинства растворителей,
используемых в жидкостной хроматографии (LC), потенциал
ионизации больше, чем 10.6 эВ, а следовательно они не мо-
гут ионизоваться при облучении криптоновой лампой, мож-
но предположить, что APPI должен быть очень эффективен
при проведении анализа методом LC/MS веществ, потенци-
ал ионизации которых ниже, чем 10.6 эВ. Для веществ с бо-
лее высоким потенциалом ионизации был предложен метод,
в котором используются специальные фотоионизуемые при-
садки, которые передают заряд молекулам интересующих нас
веществ [8].
Рис. 1.8. Схема источника ионов с APPI
Газ-распылитель
Ввод образца после HPLC
Распылитель
Поток газа, способ-
ствующего испарению
Осушающий газ
Капилляр
УФ лампа
Некоторые исследователи показали, что в источнике ио-
нов с APPI могут проходить неожиданные реакции [14], что
свидетельствует о том, что этот метод можно применять не
только для аналитических целей, но и для фундаментальных
исследований в области органической химии и химии окру-
жающей среды.