eng
Содержание
Содержание
Предисловие ....................................................................................... 7
Введение ............................................................................................... 8
Классификация хроматографии ................................................................. 9
Теоретические принципы хроматографических процессов разделения ......... 12
Удерживающая способность .................................................................... 12
Теоретические основы эксклюзионной хроматографии .................................. 15
Объемные отношения в гелевом наполнителе.................................................. 16
Параметры элюирования в хроматографии исключения ................................. 17
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЕ РАЗДЕЛЕНИЯ ..................................................... 21
1.1.
Приборы (устройства) ...................................................................... 21
1.1.1.
Насосы ......................................................................................... 22
1.1.2.
Градиентные системы........................................................................... 22
1.1.3.
Дозатор для проб .................................................................................. 22
1.2.
Колонки ............................................................................................. 22
1.3.
Наполнители колонки ......................................................................... 23
1.3.1.
Силикагели и структурированные органические полимеры ............ 23
1.4.
Подвижные фазы ............................................................................ 24
1.5.
Детекторы .............................................................................................. 24
1.6.
Устройства для сбора и обработки данных ................................................. 24
ГЛАВА 2. ПРЕПАРАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ...................................................... 25
2.1.
Приборы........................................................................................................ 26
2.1.1.
Насосы .................................................................................................. 26
2.1.2.
Подготовка проб ................................................................................... 26
2.1.3.
Дозировка проб .................................................................................... 27
2.2.
Колонки ........................................................................................................ 27
2.3.
Материалы для заполнения колонки .......................................................... 27
2.3.1.
Силикагели ........................................................................................... 28
2.3.2.
Структурированные органические полимеры ................................... 28
2.4.
Подвижные фазы ............................................................................. 28
2.5.
Детекторы ............................................................................................ 29
2.6.
Коллектор фракций ............................................................................ 29
2.7.
Приборы по регистрации и обработке данных .......................................... 30
ГЛАВА 3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ .......... 31
3.1.
Выбор подходящей системы разделения .................................................... 31
3.1.1.
Растворимость в растворителях ........................................................... 33
3.1.2.
Аналитические разделения .................................................................. 35
3.1.3.
Препаративные разделения ................................................................. 35
3.2.
Тонкослойная хроматография (ТХ) в качестве пилотного метода ............ 36
3.2.1.
Перенос с ТХ на силикагеле на колонку с силикагелем .................... 374 Содержание
3.2.2.
Перенос с ТХ на колоночную хроматографию
с помощью Сефадекса LHF20 .............................................................. 39
3.3.
ВЭЖХ в качестве пилотного метода ........................................................... 39
3.3.1.
Перенос с аналитической ВЭЖХ на препаративную ВЭЖХ ............ 40
3.3.2.
Перенос аналитической ВЭЖХ на колоночную хроматографию (КХ)
низкого давления ................................................................................. 43
ГЛАВА 4. ПРИМЕРЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИЗ ПРАКТИКИ ....................................... 52
4.1.
Продукты реакции............................................................................... 52
4.1.1.
Синтез nFфенилендиизоцианата ......................................................... 52
4.1.2.
Производные mF и nFфенилендиизоцианата ...................................... 55
4.1.3.
Метанолизат моноглицерида .............................................................. 57
4.1.4.
Эмульгатор для прядильной препарации ........................................... 59
4.1.5.
Водорастворимое производное лигнина ............................................ 62
4.1.6.
Реакционный продукт из масляной (бутановой) кислоты,
глицида и акриловой кислоты ............................................................. 63
4.1.7.
Смесь триметилолпропанакрилата ..................................................... 65
4.1.8.
Сложный эфир кислоты жирного ряда
3
FдиметиламиноF1,2Fпропандиола ..................................................... 66
4.1.9.
Продукт переэтерификации – изолирование сложного
метилового эфира рицинолевой кислоты .......................................... 70
4.2.
Эмульгаторы ........................................................................................... 71
4.2.1.
Полигликоль спирта ............................................................................ 72
4.2.2.
Сложный эфир полигликоля кислоты жирного ряда ........................ 82
4.2.3.
Этоксилированный метиловый эфир полидиметилсилоксана
и полигликоль спирта жирного ряда .................................................. 91
4.2.4.
Эмульгатор и соэмульгатор ................................................................. 92
4.2.5.
Этоксилированный сложный сорбитановый эфир ........................... 95
4.2.6.
Сополимеры этилена и пропиленоксида ........................................... 97
4.2.7.
Полиэтиленгликоли ............................................................................. 99
4.3.
Сложный эфир сорбитановой кислоты жирного ряда ............................ 106
4.3.1.
Сорбитанмонолаурат ......................................................................... 107
4.3.2.
Сорбитановый моноолеат .................................................................. 108
4.3.3.
Сорбитантриолеат .............................................................................. 108
4.4.
Сложный эфир фосфорной кислоты ........................................................ 109
4.4.1.
Смеси сложных эфиров фосфорной кислоты .................................. 109
4.5.
Масла сложных эфиров ............................................................................. 112
4.5.1.
Смесь сложных тетраэфиров пентаэритрита ................................... 113
4.5.2.
Сложный эфир триметилолпропана ................................................. 116
4.5.3.
Смесь масел сложного эфира ............................................................ 118
4.6.
ЖидкостноFхроматографическое разделение
лекарственного сырья ................................................................................ 118
4.7.
Сефадекс LHF20 в сравнении с высокоэффективной
жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и гельFпроникающей
хроматографией (ГПХ) .............................................. 123
ГЛАВА 5. ПРЕПАРАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ
СМЕСЕЙ ВЕЩЕСТВ ............................................................................. 126
5.1.
Прядильные препарации ........................................................................... 126
5.2.
Свойства современных прядильных препараций .................................... 126
5.3.
Состав прядильных препараций ............................................................... 127
5.3.1.
«Внутренняя» и «внешняя» смазка (главный компонент) .............. 127
5.3.2.
Эмульгаторы (главный компонент) .................................................. 127
5.3.3.
Антистатики (главный компонент) .................................................. 127
5.3.4.
Средство для компактности (собранности) нити
(главный компонент) ......................................................................... 127
5.3.5.
Смачивающее средство (вспомогательный компонент) ................. 128
5.3.6.
Бактерициды (вспомогательный компонент) .................................. 128
5.3.7.
Средства защиты от коррозии (вспомогательный компонент) .......... 128
5.4.
КолоночноFжидкостный хроматографический анализ готовых
препараций, компонентов и экстрактов волокон .................................... 128
5.4.1.
Препаративное предварительное разделение
по возрастающей полярности ........................................................... 129
5.4.2.
Гексан в качестве элюата .................................................................... 129
5.4.3.
Дихлорметан в качестве элюата ........................................................ 129
5.4.4.
Элюат метанола .................................................................................. 138
5.4.5.
Разделение масел сложных эфиров и эмульгаторов ........................ 154
5.5.
Экстракция полиэфирных и полиамидных волокон ............................... 156
5.5.1.
Экстракция с помощью петролейного эфира и метанола ............... 157
5.5.2.
Экстракция этанолом ........................................................................ 157
5.5.3.
Разделение различных смесей ........................................................... 157
5.6.
Результаты анализов экстрактов волокон
(полиэфирные и полиамидные волокна) ................................................. 165
5.7.
Прядильные препарации для синтетического нитяного материала ........... 166
ГЛАВА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛЕДОВЫХ КОЛИЧЕСТВ –
СЛЕДОВЫЙ АНАЛИЗ .............................................................................. 168
6.1.
Количественное определение свободных мономерных
диизоцианатов в экстрактах полиуретана ................................................ 168
6.2.
Дифениловый эфир в деполимеризатах полигликолевой кислоты ........ 169
6.2.1.
Деполимеризация – обогащение – количественная оценка .......... 169
6.3.
Количественное определение изопропанола в растительных маслах......... 171
6.4.
Количественное определение фенола в воде ............................................ 172
6.5.
Количественное определение NFметилпирролидона в воде ................... 172
ГЛАВА 7. АНАЛИТИКА ПОЛИМЕРОВ .............................................................. 173
7.1.
Полиуретаны ...................................................................................... 173
7.1.1.
Анализ полиуретанов ......................................................................... 174
7.2.
Сложный полиэфир ................................................................................... 179
7.2.1.
Анализ сложных полиэфиров ............................................................ 180
7.3.
Поликарбонаты ................................................................................ 181
7.3.1.
Анализ поликарбонатов ..................................................................... 1816 Содержание
ГЛАВА 8. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ПРЕПАРАТИВНЫЕ РАЗДЕЛЕНИЯ ........... 185
8.1.
Аналитическая ВЭЖХ ......................................................................... 185
8.1.1.
Сшиватели для полиуретанов ............................................................ 186
8.1.2.
С4
Fдикарбоновые кислоты ................................................................. 187
8.1.3.
Дилаураты полиэтиленгликоляF200 (ПЭГF200) ............................... 188
8.1.4.
МальтоF и целлодекстрины ............................................................... 189
8.2.
Препаративные разделения на готовых стеклянных колонках ............... 189
8.2.1.
Технический моностеарат глицерина ............................................... 189
8.2.2.
Метанолизат сложных эфиров полигликоля кислоты
кокосового масла ................................................................................ 191
8.2.3.
Технический саркозид олеиновой кислоты ...................................... 192
8.2.4.
Экстракт полиэфирных волокон....................................................... 193
8.2.5.
Экстракт полиамидных волокон ....................................................... 194
8.2.6.
Реакционная смесь (1977) .................................................................. 195
8.3.
Препаративная гелевая хроматография ............................................. 196
8.3.1.
Разделение алифатических гидроксиF и дикарбоновых
кислот (1976) ....................................................................................... 196
8.3.2.
Алифатические кислоты (1974) ......................................................... 196
8.3.3.
Экстракт этилацетата ......................................................................... 198
8.3.4.
Полярные компоненты прядильной препарации ............................ 199
8.3.5.
Продукт реакции .......................................................................... 199
8.3.6.
Метанолизат коFэмульгатора ............................................................ 200
8.3.7.
Сложный эфир кислоты жирного ряда
полиэтиленоксидсорбитана .............................................................. 202
8.3.8.
Пробы.......................................................................................... 202
8.3.9.
Смесь тиокарбамида – роданида аммония (1971) ............................ 206
8.3.10.
ПолиамидF2,2Fдеполимеризат (1971) .............................................. 207
8.3.11.
Триэтиленгликоль и 2Fэтилгексанол ............................................... 208
8.3.12.
Разделение аддуктов додецилфенол – ЭО ...................................... 209
8.3.13.
Мальтодекстрины ....................................................................... 210
ГЛАВА 9. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРОВЕДЕНИЮ АНАЛИЗОВ ........................... 212
9.1.
Переэтерификация ...................................................................... 212
9.1.1.
Принцип ............................................................................................. 212
9.1.2.
Проведение ......................................................................................... 213
9.2.
Дериватизация через этерификацию ........................................................ 214
9.2.1.
Получение раствора простого эфира диазометана .......................... 214
9.3.
Катионит .......................................................................................... 215
9.3.1.
Проведение ......................................................................................... 215
9.4.
Определение общего количества этиленоксида ....................................... 216
9.4.1.
Принцип химикоFаналитического метода ....................................... 216
Сокращения и символы ........................................................................................... 219
Литература.......................................................................................... 220
Список фирм ....................................................................................... 224
Приложение .............................................................................................. 225
Предисловие
Выбранные в данной книге примеры разделения показывают, что используемые
схемы разделения не были приспособлены к определенным смесям веществ, но
применимы для самых различных смесей (т. е. небольшим количеством раздели
тельных систем можно решить многие проблемы разделения). Многочисленные
примеры разделения из практики доказывают широкую применяемость аналити
ческих и препаративных систем разделения, и прежде всего связи между отдель
ными способами или механизмами разделения, которые иначе можно было бы
объяснить только в теоретической форме. Здесь дается описание исключительно
разделений с названиями компонентов проб и соответствующими химическими
структурными формулами. То, что аналитик зачастую не может назвать разделен
ные субстанции по патентно правовым причинам, широко известно. Однако су
ществуют многочисленные смеси веществ или реакционные смеси, которые не
подпадают под эту категорию или с помощью тестовых веществ достигается ана
логичная или близкая по свойствам смесь.
Самым существенным в описании разделения является объяснение, почему
определенная система разделения лучше всего подходит для процесса. Из этого
понятно, что проблемы разделения могут быть решены тем скорее, чем больше
опыта у пользователя хроматографией.
Тема, исходя из многолетней практики и опыта, была так разработана для всех,
кому приходится очищать или изолировать вещества в органическо препаратив
ной лаборатории, чтобы кажущиеся трудными проблемы разделения решать про
ще и быстрее. В фармацевтическом исследовании и промышленном производ
стве это касается природных или синтетических веществ: фармацевтические ве
щества, сырье для лаков, эмульгаторы, антистатики и полимерные добавки, а также
вспомогательные вещества, такие как аддукты этиленоксида и сложные эфиры
жирных кислот одно и многоатомных спиртов.
Вся важная информация передается с помощью отобранных примеров разде
ления. Поэтому книга превосходно подходит в качестве справочника.
Я особенно благодарен моему многолетнему сотруднику Клаусу Рюльке за
отличное сотрудничество.
Эленбах на Майне Доктор Ханс Хенке
Введение
Хроматография, жидкостная или газовая, сегодня используется в аналитике в выс
ших специальных учебных заведениях, промышленных исследованиях и в произ
водственных методах в промышленности. Хроматографическая разделительная тех
нология жидкостной или газовой хроматографии имеет смысл для разделения раз
личных смесей веществ лишь в том случае, когда «классические» способы разделе
ния, такие как, например, дистилляция, экстракция или кристаллизация, не
приводят к желаемому успеху. В этой книге, возникшей из практики, будут показа
ны разделения исключительно с помощью жидкостной хроматографии. При этом
вариант низкого давления играет доминирующую роль, однако нет недостатка и в
аналитических методах – наоборот, будет показано, какую помощь оказывают бы
стрые аналитические разделения, будь то пилотный метод для препаративных раз
делений или прямой, а также косвенный метод для определения малых количеств
субстанции в различных смесях веществ (оценка следовых количеств). Препара
тивные методы имеют большое преимущество в том, что они одновременно предо
ставляют возможность с помощью гравиметрии точно определить количество как
известных, так и еще неопознанных компонентов смеси веществ. Предпосылкой
для этого является то, что отдельные пики представляют чистые составляющие проб
ной смеси. В основном речь идет о разделениях, при которых определяется количе
ство или опознаются главные компоненты, или интерес представляют все состав
ляющие реакционной смеси или экстракта.
При этом ясно, что необязательно проводить анализы современными метода
ми, чтобы достичь успеха, зачастую имеет смысл так их комбинировать, чтобы
при новых методах отказаться от многочисленной периферии, т. е. многих ком
пьютеров.
При препаративных разделениях очень эффективны как можно более про
стые и, тем не менее, очень успешные системы разделения. Наиболее удачными
они являются, когда, например, в качестве подвижной фазы используется чис
тый растворитель. Многие примеры показывают, что такие простые разделитель
ные системы зачастую являются достаточными. Кроме того, здесь делается ссыл
ка на то, что аналитические методы в виде тонкослойной хроматографии (ТХ)
или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при преодолении
проблем разделения определенно окажут хорошую услугу в будущем. Наряду с
преобладающим препаративным разделением с помощью хроматографии на ко
лонке в области низкого давления будут также показаны разделения с помощью
ТХ и ВЭЖХ.
Аналитические разделения, будь то ТХ или ВЭЖХ, которые здесь описаны,
служили в основном для анализа смеси веществ или использовались как пилот
ный метод для препаративных разделений. С помощью аналитических методов
можно быстро получить оптимальные условия разделения, чтобы можно было
применять для препаративных разделений нужную систему разделения, состоя
щую из наполнителя колонки и подвижной фазы.
Будут представлены многочисленные разделения различных продуктов реак
ции, эмульгаторов, сорбитановых сложных эфиров, сложных эфиров жирных
кислот, одно и многоатомных спиртов и прядильных препараций. Последние
являются смесями веществ, которые используются в качестве вспомогательного
средства при изготовлении различных волокон из полимеров и чаще всего явля
ются полностью природными, что касается полярности и тем самым растворимо
сти отдельных компонентов. В дальнейшем будут показаны методы следового
анализа, как в ходе прямого определения, так и комбинированные. Нет недостат
ка и в полимерной аналитике. И даже если с помощью современных спектроско
пических приборов достигаются хорошие результаты, то разделение с помощью
жидкостной хроматографии подходит лучше и для качественного, и для количе
ственного показания. Поликомпоненты могут быть представлены в исходной
форме или как стабильные производные в деполимеризате.
В главе 8 будут представлены различные аналитические разделения с помо
щью ВЭЖХ, а также разные препаративные разделения. Из наилучших побужде
ний исключены подробные тексты, так как в многочисленных случаях хромато
граммы с достаточными надписями говорят сами за себя. Немногочисленными,
однако часто используемыми на практике методами анализов, а также инструк
циями заканчивается тема.
Классификация хроматографии
Под хроматографией вообще понимается разделение веществ, базирующееся на
физико химических методах в системе, которая состоит из неподвижной и под
вижной фазы. Так, хроматографическая система разделения соединяет два несме
шиваемых друг с другом компонента. Хроматография (основное понятие), один
из важнейших методов разделения в исследовании и производстве, основывается
на двух технологиях разделения: газовой и жидкостной хроматографии. Это зна
чит, что техника исполнения называется по подвижной фазе, будь то газ или жид
кость. В аналитическом варианте с помощью газовой хроматографии разделяют
ся и определяются количественно (согласно статистике около 20% всех соедине
ний) пробы, испаряющиеся без разложения, кипящие при невысокой температу
ре или легко улетучивающиеся после количественной дериватизации. Вещества,
кипящие при высокой температуре, не испаряющиеся, а также чувствительные к
температуре (около 80% природных, а также синтетических соединений), разде
ляются и определяются количественно как в аналитическом, так и в препаратив
ном масштабе с помощью одного из различных жидкостно хроматографических
методов. Препаративная газовая хроматография напротив применяется еще ред
ко, так как по сравнению с препаративной жидкостной хроматографией ее объем
проб очень маленький, имея в виду истинное препаративное количество. Вместо
этого большое преимущество имеет аналитическая газовая хроматография, глав
ным образом в варианте капиллярной газовой хроматографии, так как ее намно
го легче связать со спектроскопическими методами (ИК – инфракрасная спект
роскопия и МС – масс спектрометрия).
На рис. Е.1 можно видеть все хроматографические технологии и способы раз
деления, а также механизмы разделения. Совокупность хроматографического раз
деления объединена в две зависимые от подвижной фазы технологии разделения.
Если подвижная фаза – жидкость, то речь идет о жидкостной хроматографии (ЖХ)
(англ. Liquid Chromatography, сокращенно LC), в отличии от газовой хроматогра
фии (ГХ), при которой подвижная фаза – это инертный газ и выполняет исклю
чительно роль транспортного средства.
Хроматография со сверхкритическими подвижными фазами (сверхкритичес
кая флюидная хроматография, сокращенно СХ) может быть расположена между
ЖХ и ГХ, так как она родственна обеим технологиям разделения. Для СХ при
этом упорядочении следует также оставаться в пределах хроматографических тех
нологий. Подробную информацию можно получить в соответствующих моногра
фиях, которые здесь конкретно не названы.
Подразделение на газовую, как и на жидкостную, хроматографию осуще
ствляется на основе комбинирования обеих фаз (ГЖХ = газожидкостная и ГАХ =
= газоадсорбционная хроматография) и обозначает, что неподвижная фаза яв
ляется жидкостью или твердым телом; таким образом, речь идет о распредели
тельной или адсорбционной хроматографии. Это подразделение, как видно на
рис. Е.1, можно также найти в ЖХ, с той лишь разницей, что эта технология
после исполнения претерпевает последующую классификацию. В основном ЖХ
состоит из бумажной и тонкослойной хроматографии в различных вариантах.
Электрофорез не является настоящим хроматографическим разделительным ме
тодом.
Рис. Е.1
Способы разделения
Методы разделения
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ РАЗДЕЛЕНИЯ
ЖХ СХ ГХ
Жидкостная
хроматография
Хроматография
со сверхкритическими
подвижными фазами
Газовая
хроматография
ГАХ ГЖХ
Газоадсорбционная Газожидкостная
хроматография хроматография
Хроматография на колонке
АДСОРБЦИОННАЯ
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ
ОБРАЩЕНО ФАЗОВАЯ
ИОНООБМЕННАЯ
ГЕЛЬ
АФФИННАЯ
ИОНПАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Бумажная хроматография
Тонкослойная хроматография
Фильтрационная
ХРОМАТОГРАФИЯ
Гель проникающая
хроматография
Аналитическая
и препаративная
В основном
аналитическая
В большей степени нас интересует в связи с препаративной гель хроматогра
фией на Сефадексе LH 20 общая и специальная колоночно жидкостная хрома
тография. Как следует из рис. Е.1, ЖХ по исполнению подразделяется на два раз
личных способа или метода разделения: на бумажную хроматографию и хромато
графию на колонке.
Первый состоит из ТХ и бумажной хроматографии (БХ). Из этих двух методов
с введением ВТХ (высокоэффективной тонкослойной хроматографии) ТХ пре
терпела возрождение, по сравнению с «классической» ЖХ на колонке, которая
познала свое второе рождение, а также обновление в форме ВЭЖХ. БХ была вы
теснена ускоренной, и после стандартизации ТХ стала значительно лучшей в вос
производстве и в течение ряда лет в форме ВТХ является аналитическим стандар
тным методом с многочисленными, не названными здесь, преимуществами по
сравнению с ВЭЖХ.
Далее следует более детально остановиться на отдельных механизмах разделе
ния внутри обоих способов или методов разделения жидкостной хроматографии
(БХ и колоночной хроматографии).
В БХ применяются три разных механизма разделения: распределительная, фа
зовая и ионообменная хроматография. На рис. Е.1 три механизма разделения объе
динены рамкой с помощью обеих стрелок. Более варьируемой в механизме разде
ления является ТСХ, так как к трем названным в БХ присоединяются еще адсор
бционные и гель хроматографические разделения на тонкослойной пластинке,
хотя последние в течение ряда лет проводится в более скромном объеме.
В этой связи не следует, однако, забывать об электрофорезе в качестве разде
лительного и определительного методов.
Все известные механизмы разделения ЖХ могут проводиться только на ко
лонке (будь то ЖХ низкого, среднего или высокого давления). На колонке мож
но, следовательно, осуществлять адсорбционную, распределительную, обращен
но фазную, ионообменную, гель , аффинную и ион парную хроматографию.
Законченности ради надо здесь упомянуть еще следующие хроматографичес
кие методы разделения, которые можно назвать более молодыми членами в семье
хроматографии.
• Капельная противоточная хроматография (КПХ).
• Распределительно противоточная хроматография вращения (РХ) (ротаци
онная).
• Центробежная противоточная хроматография (ЦПХ).
• Кольцевая (циркулярная) хроматография.
• Экстракционная хроматография.
• Хроматография среднего давления.
Они используются в основном при разделении и изоляции природных веществ
в препаративных количествах.
Если рассматривать схематическую классификацию хроматографии на рис. Е.1,
то можно заметить, что под колоночной хроматографией отсутствует одна графа:
хроматография на сорбентах с химически привитыми группами, таких как: ами
ногруппы, диольные, нитрильные и нитрогруппы. Точная классификация меха
низма разделения не всегда возможна, так как на химически связанных фазах мож
но точно так же проводить разделения, как они практикуются в плане обычной
хроматографии или с обращено фазовой хроматографии на силикагеле или об
ращенной фазе.
В основном применяются эти четыре химически соединенные фазы для раз
деления определенных химических классов материалов. Так, аминофаза в тече
ние ряда лет применяется для разделения и количественной оценки сахарных
смесей. Диолфаза среди прочего хорошо подходит для разделения стероидов, орга
нических кислот и биополимеров. На нитрильной фазе хорошо разделяются ве
щества с двойными связями, и, наконец, нитрофаза используется как наполни
тель для колонки при разделении различных полициклических ароматических
веществ и гетероциклов.
Теоретические принципы хроматографических процессов разделения
Как уже отмечалось, хроматография – это процесс разделения смеси веществ на
отдельные компоненты с помощью системы, состоящей из двух не смешиваемых
друг с другом фаз. Далее будут обсуждаться процессы разделения исключительно
ЖХ с использованием колоночной технологии. Хроматографические разделения
в основном, не говоря о специальных хроматографических механизмах разделе
ния, таких как обращено фазная хроматография, ионообменная, гель хроматог
рафия, ион парнораспределительная и биоаффинная хроматография, можно
описать с помощью двух физико химических процессов адсорбции и распреде
ления.
Подробнее адсорбционные и распределительно хроматографические процес
сы разделения, как и специальные технологии разделения, обсуждаются в соот
ветствующих монографиях [3].
Хроматографический процесс разделения будет описан и определен на хро
матограмме в основном с помощью хроматографических параметров. Под хрома
тограммой в колоночно жидкостной хроматографии подразумевается элюентный
профиль смеси веществ в форме пика на бумаге самописца. Форма пика есть не
что иное, как изменение концентрации элюированного вещества в зависимости
от времени. Для описания или характеристики отдельных пиков и всей хромато
граммы могут привлекаться параметры, названные в следующем разделе.
Удерживающая способность
Она содержит время удерживания (tR), объем удерживания (VR), коэффициент
емкости (k′) и относительное удерживание (α), названное также коэффициентом
разделения. С помощью этих параметров, как уже упоминалось, проводится опи
сание пиков в хроматограмме.
Для этого применяют следующее схематическое представление: время запаз
дывания t0 – это то время, которое требуется незапаздывающему веществу, чтобы
пройти разделительную колонку, т. е. это время, которое для этого также требует
ся подвижной фазе. Если, напротив, соединение запоздает при прохождении раз
делительной системы, то оно появится после времени запаздывания t0, т. е. оно
указывает время удержания tR. Это отставание или запаздывание основывается на
том, что соединения наряду со временем удерживания в подвижной фазе вступа
ют во взаимодействие с неподвижной фазой. Если два вещества неподвижной фазы
запаздывают по разному, то происходит их элюирование со смещением времени
(tR1 и tR2), и это приводит к разделению, как можно видеть на рис. Е.2. Время удер
жания нетто неподвижной фазой t′
R получают из tR – t0.
Чтобы можно было также сравнить друг с другом разделения на колонках раз
личных размеров при различных скоростях потока, время удерживания превраща
ется в безразмерную величину, в коэффициент емкости k′, следующим образом:
.
0
R
0
r 0
t
t
t
t t
k
′
=
−
′ =
k′ – это соотношение времени удерживания вещества в неподвижной и под
вижной фазе. Уравнение означает, что коэффициент емкости k′ – это время удер
живания в неподвижной фазе в пересчете на время запаздывания. Предпочитает
ли вещество оставаться в подвижной или неподвижной фазе, можно описать с
помощью коэффициентов распределения К:
.
концентрация в подвижной фазе
концентрация в неподвижной фазе К =
Величину k′ можно определить следующим образом:
.
объем подвижной фазы
объем неподвижной фазы
k′ = K
Следовательно, возникает логический вывод, что два вещества могут отделить
ся друг от друга только тогда, когда обнаруживается разность коэффициентов.
Критерием этого является относительное удерживание (α):
.
1
2
k
k
′
′
α =
Рис. Е.2
Время
Сигнал детектора
14 Введение
Разделение возможно только тогда, когда k′
2 > k′
1 . Относительное удерживание
является как раз при препаративных разделениях важнейшим критерием для ха
рактеристики хроматографической разделительной системы, т. е. для ее избира
тельности!
Высота пика h и площадь пика F пропорциональны концентрации веществ и
тем самым служат для количественной оценки с помощью интегратора или систе
мы обработки данных. Количественно можно определить отдельные пики и с по
мощью ручной обработки данных хотя и несколько медленно, но довольно точно.
Для этого ширина пика в половинной высоте (1/2Br) умножается на высоту пика h:
F = 1/2Br · h.
Перед рассмотрением упомянутого хроматографического разделения R нужно
еще объяснить два важных понятия. Число тарелок или ступеней разделения N яв
ляется непосредственным критерием для производительности колонны, для опре
деленного вещества при определенных условиях. Число тарелок N пропорциональ
но длине колонки L, и его расчет осуществляется по следующему уравнению:
16 ,
2
R
⎟ ⎟⎠
⎞
⎜ ⎜⎝
⎛
= ⋅
W
t
H
L
N
где L – длина колонки, H – высота тарелки, tR – время удерживания, W – базовая
ширина пика.
Высота тарелки Н колонки – это отрезок пути, который должно пройти веще
ство в колонне, чтобы установилось равновесие. Установление равновесия обознача
ет равенство между адсорбцией и десорбцией вещества. Чем короче отрезок пути
для этого процесса, тем меньше высота тарелки Н. При постоянной длине колон
ки L увеличивается количество тарелок N с уменьшением высоты тарелки H.
Высоту тарелки Н можно определить из хроматограммы или на основе пика
следующим образом:
.
16
2
R
⎟ ⎟
⎠
⎞
⎜ ⎜
⎝
⎛
= ⋅
t
L W
H
Степень разделения R двух пиков определяется через удаленность их друг от
друга (tR – разница) и средним арифметическим из базовой ширины W:
( ).
W
2
1 2
R2 R1
W
t t
R
+
−
=
При некоторых хроматографических разделениях стараются достичь достаточ
ной и небольшой степени разделения. При R = 1,5 получается разделение почти по
основной линии. Большая степень разделения только бы удлинила время анализа.
Из ранее обговоренных параметрических значений следует вывести важней
шее уравнение хроматографии:
.
1
1
4
1
k
k
R N
+ ′
′
= ⋅ − ⋅ ⋅
α
α
Уравнение содержит важнейшие параметры, которые благодаря оптимизации
ведут к улучшению степени разделения R. Чем проще можно повысить избиратель
ность, т. е. относительное удерживание α, тем эффективнее система разделения.
Теоретические основы эксклюзионной хроматографии
Если осуществляется разделение веществ на пористых гелях в результате ситово
го эффекта, т. е. по степени уменьшения размеров молекул, то механизм разделе
ния прост и обозрим. Все соединения, которые имеют одинаковую или бóльшую
молярную массу, чем указанный изготовителем предел исключения геля, выходят
неразделенными в качестве первого пика в элюате, так как они проходят только
объем между гранулами, недействительный для хроматографического процесса
разделения. Предпосылкой, разумеется, является то, что вещества не задержива
ются гелем. Меньшие соединения покидают колонку в соответствии с размером
молекул по мере уменьшения. Они также не могут препятствовать своему элюи
рованию, не будучи адсорбированы гелем. Элюированием мельчайших молекул
(объем элюирования = объем между гранулами плюс объем пор: Vz + VP) заканчи
вается «гель хроматографический» процесс разделения.
Разделение смеси веществ по уменьшающемуся размеру молекул имеет много
названий. Речь идет о гель хроматографии, эксклюзионной хроматографии, мо
лекулярно ситовой хроматографии, гель проникающей хроматографии, диффу
зии полого пространства и гель фильтрации.
Несмотря на определенные различия, имеется в виду всегда один и тот же ме
ханизм разделения, краткое описание которого можно выразить в следующих
предложениях.
• Гель хроматографией называется колоночно хроматографический способ раз
деления, при котором вещества разделяются по их молекулярному размеру.
• Гель хроматография принципиально отличается от всех других методов хро
матографии. Здесь способствует разделению не какое то взаимодействие, а
простой процесс сортировки по размеру молекул.
• Гель хроматография, а также гель проникающая хроматография – это хро
матографический метод, который применяется прежде всего в биохимии и
химии природных веществ и который разделяет смесь веществ по разнице
размеров.
• При гель хроматографии компоненты смеси сортируются исключительно
по размеру молекул.
• Механизм разделения при гель хроматографии – это чисто физический ме
ханизм и основывается на сортировке по размерам молекул.
• Гель хроматография – это особый вид жидкостно/жидкостной хроматог
рафии для разделения веществ на базе их различных размеров молекул.
Эти описания в основном соответствуют тогда, когда разделяют высокомоле
кулярные вещества, т. е. полимеры на наполнителе колонки с соответствующим
размером пор. Если, напротив, используются гели с низким пределом исключе
ния, которые тоже обнаруживают сравнительно узкий пористый спектр, то и низ
16 Введение
комолекулярные соединения с молярными массами (1000) также хорошо могут
разделяться не только по убывающему размеру молекул, но и благодаря избира
тельным адсорбционным эффектам.
Если колонку в качестве суспензии заполняют пористым гелем, способным
выдерживать высокое давление или набухающим для хроматографии при низком
давлении, то слой геля состоит из трех фаз: растворителя (при набухающих гелях
растворитель одновременно является также жидкостью для набухания) между гра
нулами геля и в порах, а также матрицей геля в форме неорганического и органи
ческого материала. Общий объем гелевого слоя Vt cскладывается в соответствии с
этим следующим образом:
Vt = Vz + Vp + Vm,
где Vz – объем между гранулами, Vp – объем пор, Vm – объем матрицы геля
Объемные составляющие гелевого наполнителя лучше всего можно продемон
стрировать на хроматограмме элюирования.
Объемные отношения в гелевом наполнителе
Чтобы разделить все соединения от мельчайших молекул до высокомолекулярных
полимеров по снижающейся молярной массе, нужно иметь несколько гелей с воз
растающим пределом исключения, которые своим пористым спектром перекрыва
ют весь диапазон молярных масс. В зависимости от размера и спектра пор каждый
гель наряду с пределом исключения имеет приблизительный диапазон разделения
и фракционирования. Подробную информацию относительно отдельных гелей
можно получить из специальной литературы и фирменных изданий.
Чтобы можно было охарактеризовать гель хроматограмму, требуются объемы
элюирования в качестве параметра элюирования.
• Объем между гранулами VZ – это объем жидкости между гранулами (зерна
ми) геля набивки колонки. Гель может быть не набухающим, предназна
ченным для высоких давлений, или набухающим, выдерживающим лишь
незначительное давление. Объем между гранулами Vz определяют с помо
щью высокомолекулярного вещества, которое не может проникнуть даже в
самые большие поры геля. На рис. Е.3 пик 1 наглядно представляет объем
между гранулами Vz и одновременно маркирует первый пик с наибольшей
молярной массой. Как уже говорилось, разные изготовители предлагают
многочисленные сорта гелей, будь то декстрановые, полиакриламидные или
стирогели, с разными диапазонами фракционирования. Вследствие этого у
них пониженный или повышенный предел исключения. Vz можно также
определить исходя из размеров колонок, что составляет при статистичес
кой упаковке и приблизительно шарообразных частичках геля около 0,37 Vt
• Объем пор Vp – это объем жидкости во всем объеме пор. Этот объем опре
деляется с помощью веществ, которые в состоянии попасть во все, даже
мельчайшие поры геля, при условии что они не будут удерживаться матри
цей геля, как последний пик разделения. На рис. Е.3 пик маркирует мель
чайшие молекулы с самым продолжительным временем элюирования, и это
обозначает максимальный общий объем элюирования. Все соединения,
которые меньше пика 1 или больше пика 6, появляются в соответствии с
уменьшением молярных масс между крайними пиками в хроматограмме элю
ирования. Итак, Vp – это объем, в котором происходит разделение. Вслед
ствие этого пик 6 испытывает полное, а пики 2–5 только частичное проник
новение. Пики 7 и 8 задерживаются за счет адсорбции. То, что определение
объема пор Vp не составляет проблемы, будет обсуждаться позже.
• Объем гелевой матрицы, Vm, назваемый также объемом матрицы, это объем
чистой гелевой матрицы и представляет собой ту часть объема колонки,
которая не доступна как для растворителя, так и для пробы.
Параметры элюирования в хроматографии исключения
В хроматографии исключения характер элюирования веществ определяется с по
мощью значений Kd и Kav:
, .
t z
e z
av
p
e z
d V V
V V
K
V
V V
K
−
−
=
−
=
Ve – это объем элюирования вещества, которое претерпевает частичное про
никновение и поэтому появляется после Vz, однако раньше, чем самые маленькие
соединения. Ve может рассчитываться следующим образом:
Ve = Vz + Kd ⋅ Vp,
при этом под Kd подразумевают долю внутреннего объема гранул, доступную для
молекул данного размера. Как правило, измеряют объем элюирования и рассчи
тывают значения Kd при условии, что Vz и Vp известны.
Определить точные значения Kd проблематично, так как они связаны с нена
дежностью в определении Vp. Значительно точнее можно определить значения Kav
(av – англ.: available, нем.: zugünglich, рус.: доступно), так как вместо объема пор
Vp для расчета используется общий объем гелевой фазы. На практике, если даже
представлены многочисленные интересные разделения, нет в наличии ни значе
ний Kd, ни значений Kav для характеристики результатов разделения. Практикам
остается довольствоваться временем или характером элюирования, так как раз
деления проводятся в препаративном, а не в аналитическом масштабе.
На рис. Е.3 можно увидеть, что по объему элюирования малейших молекул на
пике 6 (Vz + Vp или Kd = 1) разделение еще не закончено. Все вещества, которые
появляются позднее, будут в большей или меньшей степени сильно запаздывать,
но внутри объема пор Vp также можно очень часто наблюдать разделения по уве
личивающейся молярной массе.
Насколько хорошо отделились друг от друга два компонента одной пробы с
помощью хроматографических методов, можно хорошо определить в эксклюзи
онной хроматографии с помощью понятия степени разделения R. В эксклюзион
ной хроматографии время удерживания не адаптируется к механизму разделения,
а применяются объемы жидкости, такие как Vz, Vp и Ve, для характеристики режи
18 Введение
ма элюирования веществ. Исходя из этого, степень разделения R определяется
следующим образом:
( )
,
2
1
1 2
2 1
W W
V V
R
+
−
=
где V2 – V1 – расстояние между вершинами пиков, W1 и W2 – ширина зоны или
ширина пика двух разделенных веществ.
Степень разделения R, как известно, зависит от коэффициента емкости k′,
коэффициента избирательности α (относительное удерживание) и производитель
ности колонки, которая измеряется по количеству теоретических тарелок N.
Названные параметры определяются следующим образом:
16 .
2
1 z
2 z
z
z 1 ⎟⎠
⎞
⎜⎝
⎛ =
−
′ = − = −
W
V
N
V V
V V
V
V V
k α
Они связаны со степенью разделения R по следующему известному уравнению:
.
1
1
4
1
k
k
R N
+ ′
′
= ⋅ − ⋅ ⋅
α
α
Рис. Е.3
Объем и параметры элюирования
в гелевой хроматографии на Сефадексe LH 20 (Sephadex LH 20)
Vp (полное проникновение), Kd = 1
Доля
объема
пор + Vz
Pазмер молекул уменьшается
увеличи
вается
Высокая
избира
тельность
благодаря
адсорбции
Oбъем
разде
ления
Исключен
ный объем Частичное проник новение
Отсутствие Диапазон молекулярно ситовой Адсорбционные
разделения и адсорбционные разделения разделения
Конец
молеку
лярно
ситовой
хромато
Начало графии
молекулярно
ситовой
хроматографии
Старт (пуск)
(впрыски
вание)
Введение 19
Разделения можно достичь эффективнее всего путем изменения коэффици
ента избирательности α.
Улучшение и изменение избирательности на Сефадексе LH 20 может быть
очень хорошо реализовано с помощью чистых растворителей. Для этого требует
ся максимально 4 колонки с растворителями метанол, ацетон, метиленхлорид и
вода в качестве подвижной фазы.
Рис. Е.4
Нет Молекулярно ситовая хромато Адсорбционное разделение
разделения графия. Сита и адсорбция
Объем пор Vp
a d: «каналы»
с подвижной фазой
Cоединения, разделенные
за счет адсорбции, имеют
бóльшую молярную массу,
чем вода.
Вода = Vz + Vp
Полное проникновение
Aдсорбция
20 Введение
Улучшение селективности на Сефадексе LH 20 обозначает, что, например, для
разделения смеси метанолом требуется 5 метровая колонна, а с помощью ацето
на достаточно уже высоты гелевого слоя 870 мм, при разделении же метиленхло
ридом достаточно всего лишь высоты гелевого слоя в 200…350 мм.
Изменения и улучшения селективности в смысле перемены последователь
ности элюирования можно также наблюдать при смене подвижной фазы.
В молекулярно ситовой хроматографии объем элюирования Ve любого низ
комолекулярного вещества можно формулировать следующим образом:
Vz < Ve < Vz + Vp.
Однако это формулирование ничего не говорит о возможном отставании внут
ри объема пор Vp. Замедляется ли определенное вещество декстрангелем и насколь
ко при элюировании адсорбировано, можно легко определить исключительно с
помощью тестовых веществ.
Для этого лучше всего использовать соединения с идентичными молярными
массами, которые элюируются в зоне объема пор Vp. Однако если объем элюиро
вания Ve > Vz + Vp, то соединение удерживается за счет адсорбции, т. е. оно появля
ется позже Vz + Vp и выражается иначе:
Ve = Vads.
На рис. Е.4 представлен обращенный ситовой эффект благодаря становящимся
все ýже порам и каналам, которые заполнены подвижной фазой. В практической
части будет показано, что в диапазоне объема пор, т. е. между пиками 1 и 5, также
возможно разделение за счет адсорбции. Чисто адсорбционно хроматографичес
кие разделения осуществляются, как уже говорилось, в диапазоне объема элюи
рования по формуле Vz + Vp, и, таким образом, значения Kd > 1.
Глава 1
Аналитические разделения
Под аналитическими разделениями подразумеваются методы быстрого качествен
ного, а также количественного определения веществ в смесях синтетического или
натурального происхождения. Под термином «качественный» понимается иден
тификация отдельных компонентов пробы с помощью значений Rt (хроматогра
фия на бумаге и тонкослойная хроматография) или на основе времени удержа
ния (хроматография на колонке, т. е. ЖХ и ГХ жидкостная и газовая хроматог
рафия). При количественном определении после проведенной калибровки из
меряются пятна в хроматографии на бумаге и в тонкослойной хроматографии.
В хроматографии на колонке, жидкостной и газовой хроматографии количе
ственная оценка компонентов смеси – равным образом и по предшествовавшей
калибровке – проводится посредством стандартов на основе площади пика, реже
высоты пика.
В разделах 3.2.1 до 4.1.3 будут представлены различные аналитические и пре
паративные разделения с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Здесь описание приборов и
колонок будет дано лишь кратко; больше информации можно почерпнуть из об
щеизвестных монографий (см. список литературы). Далее в краткой форме будет
представлено устройство аппаратуры ВЭЖХ. Автор полностью отказывается от
описания приборной части и ее компоновки, особенно в количественной тонко
слойной хроматографии, так как в этой книге, ориентированной на практичес
кое применение, она является в основном пилотным методом. Приборы для ВЭЖХ
имеются в модульной и компактной конструкции. Выбор аппаратуры зависит от
недостатков и преимуществ, которые выявляются при соответствующем случае
применения. Модульные установки ВЭЖХ имеют большое преимущество в том,
что при необходимости отдельные приборы, такие как, например, насос или де
тектор, быстро могут быть заменены.
1.1. Приборы (устройства)
Аппаратура ВЭЖХ состоит из следующих компонентов:
• сборник для подвижной фазы (элюента),
• насос,
• градиентная система,
• дозатор для проб,
• колонка и наполнитель для нее,
• детектор
• прибор регистрации и обработки данных.
1.1.1. Насосы
В ВЭЖХ чаще всего применяются насосы с одним и сдвоенным поршнями с ко
ротким ходом. Поршень в большинстве случаев состоит из сапфира (оксида алю
миния). Верхняя часть поршня, а также все детали, которые соприкасаются с элю
ентом, выполнены из устойчивой против коррозии нержавеющей стали. Наряду с
поршневыми насосами с коротким ходом используются также таковые с длин
ным ходом и мембранные насосы.
Аналитические насосы ВЭЖХ должны соответствовать следующим требо
ваниям:
• регулируемая норма (скорость) потока в диапазоне 0,1…10 мл/мин,
• стабильность потока ± 2% и лучше при противодавлении до 250 бар.
1.1.2. Градиентные системы
Градиентные системы служат для того, чтобы во время элюирования многоком
понентной смеси проб непрерывно изменять состав подвижной фазы. Благодаря
изменению процента содержания двух или трех растворителей в элюенте изменя
ют его элюционную силу и только благодаря этому достигают удовлетворитель
ного разделения. Другими словами, с помощью градиентов растворителей, ана
логично температурному градиенту (перепаду) в ГХ, создается оптимальная сис
тема разделения для смеси веществ.
Существует 2 системы градиента, а именно градиенты низкого и высокого
давления. Если происходит смешивание растворителей на стороне низкого дав
ления насоса, то говорят о градиенте низкого давления, и наоборот.
1.1.3. Дозатор для проб
Ввод проб в верхнюю часть колонки осуществляется, как правило, через 6 ка
нальный поворотный кран, который можно обслуживать вручную или через
электронное управление. Объемы завихрений проб, вводимых в дозирующую
петлю через нагнетательные клапаны, задаются исходя из выбора размеров ко
лонок, длины и внутреннего диаметра. Объемы завихрений проб могут состав
лять 1…250 мкл, при этом в аналитической ВЭЖХ чаще всего используются та
ковые в 10 или 20 мкл.
1.2. Колонки
Колонка, будь то жидкостная или газовая хроматография, является основой любой
разделительной аппаратуры, так как именно в ней происходит разделение. Разде
ления могут достигаться благодаря оптимизации разделительной системы, которая
состоит из наполнителя колонки и подвижной фазы. Улучшенные кривые (пики) с
помощью компьютеров скорее скрывают правильный результат разделения.
В аналитической ВЭЖХ, наряду с собственно разделительными колонками,
используют также предварительные колонки, которые должны препятствовать хи
мическому или механическому загрязнению основной колонки. Предваритель
1.3. Наполнители колонки 23
ная колонка, примерно 4…5 см длиной, содержит, как правило, тот же заполни
тель, что и разделительная колонка.
Колонки состоят из трубы из нержавеющей стали, которые на обоих концах
имеют резьбовое соединение. Спекшаяся масса (агломерат), которая удерживает
содержимое колонки, крепится с помощью уплотнения на верхней части колон
ки. Внутренний размер чаще всего применяемых аналитических колонок состав
ляет 4 × 125 мм или 4 × 250 мм. Более точные данные относительно колонок и их
конструкции можно получить в фирменных изданиях или цитируемом ранее «Ру
ководстве по ВЭЖХ».
1.3. Наполнители колонки
Наполнители колонки, названные также неподвижными фазами, состоят в основ
ном из двух различных материалов: на основе силикагеля и структурированных
органических полимеров. На немодифицированных силикагелях адсорбционно
хроматографические разделения проводятся, как правило, с помощью смесей орга
нических растворителей в качестве подвижных фаз. Поверхностно модифициро
ванные силикагели по своим свойствам и их применению подразделяются, как в
следующих разделах.
1.3.1. Силикагели и структурированные органические полимеры
При этом различаются следующие фазы.
• Химические модифицированные полярные силикагельные фазы с гидро
ксильными, нитриловыми, нитро и аминоконцевыми группами для адсор
бционных разделений.
• Силикагелевые фазы с обращенной фазой с n октадецил , n октил , метил
и фенил группами.
Эти фазы обладают как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами
и поэтому могут применяться разносторонне. С полярными подвижными
фазами элюирование осуществляется по снижающейся полярности.
• Неподвижные фазы с ионными группами, такими как –SO3H и –СООН в
качестве сильных и слабых катионообменников. Есть также сильные и
слабые анионообменники с функциональными группами (–+NR3OH) и
(–+NH3Cl). В качестве основного материала наряду с силикагелями исполь
зуются также структурированные органические полимеры.
В эксклюзионной или молекулярно ситовой хроматографии используются как
силикагели, так и структурированные органические полимеры, которые обладают
более узким или более широким спектром пор. При наличии 2–3 таких колонок,
которые имеют различные размеры пор, можно перекрыть бóльшие диапазоны мо
лекулярных весов, это значит, что с помощью последовательно соединенного на
бора колонок можно хорошо разделить и охарактеризовать смеси веществ разной
молярной массы. Подробные сведения относительно гель проникающей хромато
графии (ГПХ), названной также методом эксклюзионной хроматографии, можно
найти в различных монографиях о ЖХ. Есть монографии, которые занимаются ис
ключительно ГПХ. Следует указать на материалы для аффинной хроматографии.
1.4. Подвижные фазы
Подвижные фазы, называемые также элюентом, действуют как растворитель и
средство переноса для растворенной смеси веществ. У немодифицированных и
химически полярно связанных силикагелей следующие растворители в разных
комбинациях используют в качестве подвижных фаз: 1 пентан, 1 гексан, цикло
гексан, дихлорметан, ацетон, тетрагидрофуран, диоксан и сложный этиловый эфир
уксусной кислоты, если называть только наиболее часто используемые. Благода
ря модифицированию поверхности с помощью гидрофобных групп, таких как
1 октадецил, 1 октил, метил или фенилен, получают наполнители для колонок,
которые применяют в основном для разделений по снижающейся полярности.
Для этого используют смеси из следующих растворителей в качестве подвижных
фаз: вода, метанол, ацетонитрил, пропанол, тетрагидрофуран и диоксан. В от
дельном случае могут использоваться также другие растворители или смеси в ка
честве элюентов. В гл. 3 будут даны предложения, какие подвижные фазы, чистые
растворители или смеси, с какими наполнителями колонок комбинируются, что
бы образовать оптимальную разделительную систему.
1.5. Детекторы
Детекторы для ВЭЖХ имеют проточную ячейку, через которую непрерывно про
ходит элюат, при этом замеряются изменения в потоке жидкости. Могут быть
физические или химические свойства, которые определяются в компонентах про
бы с помощью избирательных индикаторных приборов, таких как ультрафиоле
товые, флюоросцентные и электрохимические детекторы, а также универсальные
и часто применяемые приборы, такие как детектор показателей расчета.
1.6. Устройства для сбора и обработки данных
Самый простой способ регистрации сигнала детектора осуществляется с помо
щью самописца, и используют его чаще всего при разработке метода. Интегриро
ванные устройства, напротив, служат для обработки, распечатки и сохранения в
памяти хроматограмм и их данных.
Глава 2
Препаративное разделение
Препаративное разделение всегда служит для выделения чистых веществ из про
дуктов реакции или смесей природных веществ, независимо от того, в каких ко
личествах мг, г или кг они проводятся. При выделении чистых компонентов из
смесей веществ нужно всегда помнить о том, что хроматографические методы или
процессы имеет смысл использовать лишь тогда, когда другие способы разделе
ния, такие как перегонка, кристаллизация, экстракция и т. д., не приводят к же
лаемому результату. Следующие критерии, без претензии на полный охват, отве
чают на вопрос: с какой целью проводится препаративное разделение:
• наработка стандартных веществ или веществ сравнения для аналитических
хроматографических методик, включая: ВЭЖХ (высокоэффективная жид
костная хроматография), ГХ (газовая хроматография) или ВЭTCХ (высо
коэффективная хроматография в тонком слое сорбента);
• идентификация, качественное и количественное изучение продуктов хи
мических реакций или процессов:
• выделение и очистка полупродуктов или очистка конечного продукта хи
мического синтеза;
• регенерация ценных исходных компонентов синтеза;
• выделение примесей из конечного продукта синтеза для изучения их струк
туры и степени токсичности;
• очистка биологически активных веществ при синтезе фармацевтических
субстанций;
• выделение и очистка природных биологически активных веществ для экс
периментального изучения;
• выделение и очистка природных индивидуальных компонентов из экстрак
тов на основе растительного сырья.
Процессы препаративного разделения при низком давлении рассматривается
в гл. 6. Процессы препаративного разделения при высоком давлении часто при
меняются для получения индивидуальных веществ в промышленном масштабе.
Более точные описания их можно найти в различных публикациях и монографи
ях, а также фирменных изданиях.
Хотя препаративное разделение при низком давлении может продолжаться
многие часы, его использование не следует категорически отклонять. Для окупа
емости процесса разделения в промышленных масштабах продолжительность его
должна быть сокращена. С помощью автоматической дозировки проб и фракци
онирования элюата можно проводить длительные процессы разделения в ночные
часы. Для повышения эффективности процесса и гарантии количественного раз
деление возможно увеличение длины хроматографической колонки. Такой про
цесс, как уже упоминалось, можно проводить в ночные часы. Этот вариант опти
мизации разделения дешевле, чем поиск более эффективной системы разделе
ния, что, исходя из опыта, может занять до двух дней.
Цели и задачи препаративной ЖХ могут быть представлены так же, как на
рис. Е.1.
2.1. Приборы
Оборудование и приборы для препаративной жидкостной колоночной хрома
тографии по конструкции сравнимы с аналитическими приборами. Сборник для
подвижной фазы, насос, система ввода пробы, колонка и материал для запол
нения колонки, а также детектор самописец или интегратор аналогичны по своим
функциям. Отличие в оборудовании для препаративного разделения состоит в
том, что дополнительно нужны коллектор фракций и ротационный испаритель
для их концентрирования, обогащения и выделения. Оборудование и приборы
обычно подбирают к процессу препаративного хроматографического разделе
ния: производительность насоса, объем дозатора, конструкционные особенно
сти колонки.
2.1.1. Насосы
Детальное описание и принцип работы насосов можно найти в монографиях
по жидкостной колоночной хроматографии. Для различных видов препаратив
ного хроматографического разделения можно использовать следующие марки
насосов:
• Duramat® 80 – Pro Minent B,
• Sepapress PCP – 150/75 – Constakron 3 и 4,
• Buechi 681 – Desaga KP 2000,
• Gilson Modell 302,
а также насосы многих других производителей.
В случае необходимости, например при работах с мягкими, сильно набухаю
щими гелями типа Сефадекс LH 20, используют различные демпфирующие сис
темы для снижения пульсации насоса. В препаративной жидкостной хроматогра
фии низкого и среднего давления используют демпферы, работающие в диапазо
не 1…6, 0…20 и 0…50 бар. Полное устранение пульсации достигается путем уста
новки проточных, стальных или тефлоновых капиллярных демпферов (5…10 м)
между насосом и хроматографической колонкой.
2.1.2. Подготовка проб
Подготовка пробы для аналитической или препаративной жидкостной колоноч
ной хроматографии заключается в удалении нежелательных компонентов, как
растворимых, так и нерастворимых. Удаление нежелательных примесей осуще
ствляют путем фильтрации, дистилляции, экстракции, центрифугирования или
кристаллизации. Установка предколонок или дополнительных колонок позволя
2.3. Материалы для заполнения колонки 27
ет исключить из пробы нежелательные вещества и защитить сорбент основной
колонки от вредного химического или механического воздействия.
2.1.3. Дозировка проб
Система ввода пробы осуществляется устройствами, способными количественно
наносить смесь разделяемых веществ в головную часть разделительной колонны.
Введение пробы может осуществляться вручную или с помощью автоматических
устройств.
Ручной ввод пробы производится с помощью 6 портового петлевого дозато
ра. Эти дозаторы в зависимости от конструкции могут выдерживать давление до
35 бар и поставляются различными производителями.
Устройства, работающие в автоматическом режиме, сравнимы с ручными доза
торами. Ввод пробы производится через заданный промежуток времени автомати
чески. Простая система ввода пробы представлена автором. С помощью 3 ходово
го шарового крана и электронного привода можно с любыми интервалами регули
ровать объем пробы.
2.2. Колонки
В препаративной жидкостной колоночной хроматографии применяются колон
ки из стали, стекла и пластмассы. Стальные колонки используются для разделе
ния при высоком давлении. Стеклянные, а также пластмассовые колонки нахо
дят свое применение в хроматографии низкого и среднего давления. В настоя
щем издании рассматриваются исключительно стеклянные колонки, работающие
при низком давлении. Определение параметров стеклянных колонок, будь то дли
на и/или внутренний диаметр, может быть очень разным, как это можно будет
заключить из последующей компоновки.
Очень важными конструкционными элементами этих колонок являются на
конечники или адаптеры, регулируемые или не регулируемые. При использова
нии жестких сорбентов, например силикагелей, применяются в основном два не
регулируемых наконечника. При использовании для заполнения колонок мягких,
набухающих сорбентов (гелей) хотя бы один наконечник должен быть с регули
ровкой. Регулируемые адаптеры позволяют корректировать высоту слоя геля при
загрузке и перезагрузке колонки. При выборе адаптера необходимо обращать вни
мание на его конструкцию для оценки возможности провести ремонт собствен
ными силами при появлении негерметичности системы.
2.3. Материалы для заполнения колонки
Колонки, заполненные сорбентами в комбинации с подвижными фазами, являются
основой любой хроматографической разделительной установки. Неподвижные фазы
или сорбенты можно разделить на две основные группы (обозначение «неподвижная
фаза» для сорбентов не всегда адекватно, так как элюент, находящийся в геле или
порах сорбента, оказывает влияние на процесс разделения компонентов пробы):
• жесткие сорбенты, устойчивые к высоким давлениям, на основе модифи
цированных или не модифицированных силикагелей и синтетических со
полимеров с большим числом поперечных связей;
• мягкие сильно набухающие гели, чувствительные к давлению, на основе при
родных и синтетических полимеров с малым числом поперечных связей.
2.3.1. Силикагели
Немодифицированные силикагели разделяют компоненты пробы по нарастаю
щей полярности. Сильно полярные или основные соединения в значительной
степени отстают из за взаимодействия с кислотными силановыми группами или
же необратимо адсорбируются по сравнению с нейтральными веществами. В та
ких случаях помогает добавка диэтиламина в незначительных количествах, чтобы
деактивировать полярный силикагель и тем самым избежать вышеназванных эф
фектов. В качестве подвижных фаз, как правило, используют безводные смеси
растворителей. Недостатком силикагеля является проблема с его регенерацией.
Гель в большинстве случаев выгоднее утилизировать, чем с большим трудом очи
стить различными растворителями. Как в немодифицированном силикагеле из
бирательно разделить сложные смеси веществ с различной полярностью с помо
щью ступенчатого (каскадного) элюирования, будет показано в разделе 5.4.
Гидрофобные силикагели, обращенные фазы С 8 и С 18, разделяют вещества
с помощью водно метаноловой или водно ацетонитриловой смеси по убываю
щей полярности. Чем выше доля органического растворителя в подвижной фазе,
тем сильнее элюирование, и наоборот.
2.3.2. Структурированные органические полимеры
Из набухающих гелей, синтетических полимеров используется в основном декст
рангель Сефадекс LH 20 и в незначительном объеме Сефадекс G 10 а также Сефа
декс LH 60. Большим преимуществом Сефадекса LH 20 является то, что на этом
наполнителе колонки можно очень выборочно производить разделение с помощью
чистых растворителей в качестве подвижных фаз. Ни с каким другим полимерным
гелем даже приблизительно нельзя достигнуть сравнимых разделений.
2.4. Подвижные фазы
Как уже упоминалось, при использовании немодифицированного силикагеля или
его вариантов с модифицированной поверхностью применяют смеси растворите
лей в качестве подвижных фаз, так как только так возникают селективные (изби
рательные) системы разделения, таков широко распространенный опыт. Но на
немодифицированном силикагеле можно достичь хорошего разделения и с по
мощью чистых органических растворителей, таких как дихлорметан, этилацетат
или ацетон, применяемых в качестве подвижных фаз. Годится ли растворитель и
насколько хорошо он подобран, можно установить на основе тонкослойного раз
деления. При использовании обращенной фазы можно в большинстве случаев
достичь хорошего разделения с помощью чистого органического растворителя вме
сто водно метаноловой или водно ацетонитриловой смеси, при условии, что бу
дут последовательно соединены две или больше колонок. Так как эти препара
тивные разделения могут проходить вне рабочего времени (например, ночью)
более высокая затрата времени не обязательно является недостатком. Чистые орга
нические растворители имеют следующие практические преимущества:
• пробы лучше растворяются;
• для разделяемых веществ (субстанций) безводная подвижная фаза являет
ся более щадящей при изолировании;
• регенерация элюента менее проблематична, происходит быстрее, почти без
потерь и, таким образом, выгоднее.
Если применяют декстрангель Сефадекс LH 20, то с помощью чистых раство
рителей, таких как метанол, ацетон, дихлорметан, этилацетат или вода, можно очень
избирательно провести детерминированное разделение. Полярный декстрангель по
сравнению с тоже полярными, но кислотными силикагелями обладает тем преиму
ществом, что адсорбция веществ очень редко заканчивается необратимо.
Хорошая растворимость в так называемом растворителе или в других, кото
рые находят применение в качестве подвижной фазы, является гарантией того,
что компоненты пробы количественно вымываются (элюируются).
2.5. Детекторы
Детекторы должны выполнять в колоночно жидкостной хроматографии две задачи:
• распознавание, т. е. детектирование разделенных субстанций,
• количественная оценка разделенных соединений по пиковой площади или
высоте после поверки (калибровки) с помощью стандарта.
Тем самым они служат в общем качественному и количественному распозна
ванию веществ, которые появляются в элюате на конце колонки. В препаратив
ной колоночно жидкостной хроматографии в основном применяются дифферен
циальные рефрактометры и ультрафиолетовые детекторы. Эти и другие детекто
ры можно получить, например, на следующих фирмах:
• Latek, D 69214 Eppelheim,
• Knauer, D 14163 Berlin,
• Bischoff, D 71229 Leonberg,
• Waters, D 65760 Eschborn,
• Kontron, D 85375 Neufarn.
Выбранные в данной книге примеры разделения показывают, что используемые
схемы разделения не были приспособлены к определенным смесям веществ, но
применимы для самых различных смесей (т. е. небольшим количеством раздели
тельных систем можно решить многие проблемы разделения). Многочисленные
примеры разделения из практики доказывают широкую применяемость аналити
ческих и препаративных систем разделения, и прежде всего связи между отдель
ными способами или механизмами разделения, которые иначе можно было бы
объяснить только в теоретической форме. Здесь дается описание исключительно
разделений с названиями компонентов проб и соответствующими химическими
структурными формулами. То, что аналитик зачастую не может назвать разделен
ные субстанции по патентно правовым причинам, широко известно. Однако су
ществуют многочисленные смеси веществ или реакционные смеси, которые не
подпадают под эту категорию или с помощью тестовых веществ достигается ана
логичная или близкая по свойствам смесь.
Самым существенным в описании разделения является объяснение, почему
определенная система разделения лучше всего подходит для процесса. Из этого
понятно, что проблемы разделения могут быть решены тем скорее, чем больше
опыта у пользователя хроматографией.
Тема, исходя из многолетней практики и опыта, была так разработана для всех,
кому приходится очищать или изолировать вещества в органическо препаратив
ной лаборатории, чтобы кажущиеся трудными проблемы разделения решать про
ще и быстрее. В фармацевтическом исследовании и промышленном производ
стве это касается природных или синтетических веществ: фармацевтические ве
щества, сырье для лаков, эмульгаторы, антистатики и полимерные добавки, а также
вспомогательные вещества, такие как аддукты этиленоксида и сложные эфиры
жирных кислот одно и многоатомных спиртов.
Вся важная информация передается с помощью отобранных примеров разде
ления. Поэтому книга превосходно подходит в качестве справочника.
Я особенно благодарен моему многолетнему сотруднику Клаусу Рюльке за
отличное сотрудничество.
Эленбах на Майне Доктор Ханс Хенке
Введение
Хроматография, жидкостная или газовая, сегодня используется в аналитике в выс
ших специальных учебных заведениях, промышленных исследованиях и в произ
водственных методах в промышленности. Хроматографическая разделительная тех
нология жидкостной или газовой хроматографии имеет смысл для разделения раз
личных смесей веществ лишь в том случае, когда «классические» способы разделе
ния, такие как, например, дистилляция, экстракция или кристаллизация, не
приводят к желаемому успеху. В этой книге, возникшей из практики, будут показа
ны разделения исключительно с помощью жидкостной хроматографии. При этом
вариант низкого давления играет доминирующую роль, однако нет недостатка и в
аналитических методах – наоборот, будет показано, какую помощь оказывают бы
стрые аналитические разделения, будь то пилотный метод для препаративных раз
делений или прямой, а также косвенный метод для определения малых количеств
субстанции в различных смесях веществ (оценка следовых количеств). Препара
тивные методы имеют большое преимущество в том, что они одновременно предо
ставляют возможность с помощью гравиметрии точно определить количество как
известных, так и еще неопознанных компонентов смеси веществ. Предпосылкой
для этого является то, что отдельные пики представляют чистые составляющие проб
ной смеси. В основном речь идет о разделениях, при которых определяется количе
ство или опознаются главные компоненты, или интерес представляют все состав
ляющие реакционной смеси или экстракта.
При этом ясно, что необязательно проводить анализы современными метода
ми, чтобы достичь успеха, зачастую имеет смысл так их комбинировать, чтобы
при новых методах отказаться от многочисленной периферии, т. е. многих ком
пьютеров.
При препаративных разделениях очень эффективны как можно более про
стые и, тем не менее, очень успешные системы разделения. Наиболее удачными
они являются, когда, например, в качестве подвижной фазы используется чис
тый растворитель. Многие примеры показывают, что такие простые разделитель
ные системы зачастую являются достаточными. Кроме того, здесь делается ссыл
ка на то, что аналитические методы в виде тонкослойной хроматографии (ТХ)
или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при преодолении
проблем разделения определенно окажут хорошую услугу в будущем. Наряду с
преобладающим препаративным разделением с помощью хроматографии на ко
лонке в области низкого давления будут также показаны разделения с помощью
ТХ и ВЭЖХ.
Аналитические разделения, будь то ТХ или ВЭЖХ, которые здесь описаны,
служили в основном для анализа смеси веществ или использовались как пилот
ный метод для препаративных разделений. С помощью аналитических методов
можно быстро получить оптимальные условия разделения, чтобы можно было
применять для препаративных разделений нужную систему разделения, состоя
щую из наполнителя колонки и подвижной фазы.
Будут представлены многочисленные разделения различных продуктов реак
ции, эмульгаторов, сорбитановых сложных эфиров, сложных эфиров жирных
кислот, одно и многоатомных спиртов и прядильных препараций. Последние
являются смесями веществ, которые используются в качестве вспомогательного
средства при изготовлении различных волокон из полимеров и чаще всего явля
ются полностью природными, что касается полярности и тем самым растворимо
сти отдельных компонентов. В дальнейшем будут показаны методы следового
анализа, как в ходе прямого определения, так и комбинированные. Нет недостат
ка и в полимерной аналитике. И даже если с помощью современных спектроско
пических приборов достигаются хорошие результаты, то разделение с помощью
жидкостной хроматографии подходит лучше и для качественного, и для количе
ственного показания. Поликомпоненты могут быть представлены в исходной
форме или как стабильные производные в деполимеризате.
В главе 8 будут представлены различные аналитические разделения с помо
щью ВЭЖХ, а также разные препаративные разделения. Из наилучших побужде
ний исключены подробные тексты, так как в многочисленных случаях хромато
граммы с достаточными надписями говорят сами за себя. Немногочисленными,
однако часто используемыми на практике методами анализов, а также инструк
циями заканчивается тема.
Классификация хроматографии
Под хроматографией вообще понимается разделение веществ, базирующееся на
физико химических методах в системе, которая состоит из неподвижной и под
вижной фазы. Так, хроматографическая система разделения соединяет два несме
шиваемых друг с другом компонента. Хроматография (основное понятие), один
из важнейших методов разделения в исследовании и производстве, основывается
на двух технологиях разделения: газовой и жидкостной хроматографии. Это зна
чит, что техника исполнения называется по подвижной фазе, будь то газ или жид
кость. В аналитическом варианте с помощью газовой хроматографии разделяют
ся и определяются количественно (согласно статистике около 20% всех соедине
ний) пробы, испаряющиеся без разложения, кипящие при невысокой температу
ре или легко улетучивающиеся после количественной дериватизации. Вещества,
кипящие при высокой температуре, не испаряющиеся, а также чувствительные к
температуре (около 80% природных, а также синтетических соединений), разде
ляются и определяются количественно как в аналитическом, так и в препаратив
ном масштабе с помощью одного из различных жидкостно хроматографических
методов. Препаративная газовая хроматография напротив применяется еще ред
ко, так как по сравнению с препаративной жидкостной хроматографией ее объем
проб очень маленький, имея в виду истинное препаративное количество. Вместо
этого большое преимущество имеет аналитическая газовая хроматография, глав
ным образом в варианте капиллярной газовой хроматографии, так как ее намно
го легче связать со спектроскопическими методами (ИК – инфракрасная спект
роскопия и МС – масс спектрометрия).
На рис. Е.1 можно видеть все хроматографические технологии и способы раз
деления, а также механизмы разделения. Совокупность хроматографического раз
деления объединена в две зависимые от подвижной фазы технологии разделения.
Если подвижная фаза – жидкость, то речь идет о жидкостной хроматографии (ЖХ)
(англ. Liquid Chromatography, сокращенно LC), в отличии от газовой хроматогра
фии (ГХ), при которой подвижная фаза – это инертный газ и выполняет исклю
чительно роль транспортного средства.
Хроматография со сверхкритическими подвижными фазами (сверхкритичес
кая флюидная хроматография, сокращенно СХ) может быть расположена между
ЖХ и ГХ, так как она родственна обеим технологиям разделения. Для СХ при
этом упорядочении следует также оставаться в пределах хроматографических тех
нологий. Подробную информацию можно получить в соответствующих моногра
фиях, которые здесь конкретно не названы.
Подразделение на газовую, как и на жидкостную, хроматографию осуще
ствляется на основе комбинирования обеих фаз (ГЖХ = газожидкостная и ГАХ =
= газоадсорбционная хроматография) и обозначает, что неподвижная фаза яв
ляется жидкостью или твердым телом; таким образом, речь идет о распредели
тельной или адсорбционной хроматографии. Это подразделение, как видно на
рис. Е.1, можно также найти в ЖХ, с той лишь разницей, что эта технология
после исполнения претерпевает последующую классификацию. В основном ЖХ
состоит из бумажной и тонкослойной хроматографии в различных вариантах.
Электрофорез не является настоящим хроматографическим разделительным ме
тодом.
Рис. Е.1
Способы разделения
Методы разделения
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ РАЗДЕЛЕНИЯ
ЖХ СХ ГХ
Жидкостная
хроматография
Хроматография
со сверхкритическими
подвижными фазами
Газовая
хроматография
ГАХ ГЖХ
Газоадсорбционная Газожидкостная
хроматография хроматография
Хроматография на колонке
АДСОРБЦИОННАЯ
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ
ОБРАЩЕНО ФАЗОВАЯ
ИОНООБМЕННАЯ
ГЕЛЬ
АФФИННАЯ
ИОНПАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Бумажная хроматография
Тонкослойная хроматография
Фильтрационная
ХРОМАТОГРАФИЯ
Гель проникающая
хроматография
Аналитическая
и препаративная
В основном
аналитическая
В большей степени нас интересует в связи с препаративной гель хроматогра
фией на Сефадексе LH 20 общая и специальная колоночно жидкостная хрома
тография. Как следует из рис. Е.1, ЖХ по исполнению подразделяется на два раз
личных способа или метода разделения: на бумажную хроматографию и хромато
графию на колонке.
Первый состоит из ТХ и бумажной хроматографии (БХ). Из этих двух методов
с введением ВТХ (высокоэффективной тонкослойной хроматографии) ТХ пре
терпела возрождение, по сравнению с «классической» ЖХ на колонке, которая
познала свое второе рождение, а также обновление в форме ВЭЖХ. БХ была вы
теснена ускоренной, и после стандартизации ТХ стала значительно лучшей в вос
производстве и в течение ряда лет в форме ВТХ является аналитическим стандар
тным методом с многочисленными, не названными здесь, преимуществами по
сравнению с ВЭЖХ.
Далее следует более детально остановиться на отдельных механизмах разделе
ния внутри обоих способов или методов разделения жидкостной хроматографии
(БХ и колоночной хроматографии).
В БХ применяются три разных механизма разделения: распределительная, фа
зовая и ионообменная хроматография. На рис. Е.1 три механизма разделения объе
динены рамкой с помощью обеих стрелок. Более варьируемой в механизме разде
ления является ТСХ, так как к трем названным в БХ присоединяются еще адсор
бционные и гель хроматографические разделения на тонкослойной пластинке,
хотя последние в течение ряда лет проводится в более скромном объеме.
В этой связи не следует, однако, забывать об электрофорезе в качестве разде
лительного и определительного методов.
Все известные механизмы разделения ЖХ могут проводиться только на ко
лонке (будь то ЖХ низкого, среднего или высокого давления). На колонке мож
но, следовательно, осуществлять адсорбционную, распределительную, обращен
но фазную, ионообменную, гель , аффинную и ион парную хроматографию.
Законченности ради надо здесь упомянуть еще следующие хроматографичес
кие методы разделения, которые можно назвать более молодыми членами в семье
хроматографии.
• Капельная противоточная хроматография (КПХ).
• Распределительно противоточная хроматография вращения (РХ) (ротаци
онная).
• Центробежная противоточная хроматография (ЦПХ).
• Кольцевая (циркулярная) хроматография.
• Экстракционная хроматография.
• Хроматография среднего давления.
Они используются в основном при разделении и изоляции природных веществ
в препаративных количествах.
Если рассматривать схематическую классификацию хроматографии на рис. Е.1,
то можно заметить, что под колоночной хроматографией отсутствует одна графа:
хроматография на сорбентах с химически привитыми группами, таких как: ами
ногруппы, диольные, нитрильные и нитрогруппы. Точная классификация меха
низма разделения не всегда возможна, так как на химически связанных фазах мож
но точно так же проводить разделения, как они практикуются в плане обычной
хроматографии или с обращено фазовой хроматографии на силикагеле или об
ращенной фазе.
В основном применяются эти четыре химически соединенные фазы для раз
деления определенных химических классов материалов. Так, аминофаза в тече
ние ряда лет применяется для разделения и количественной оценки сахарных
смесей. Диолфаза среди прочего хорошо подходит для разделения стероидов, орга
нических кислот и биополимеров. На нитрильной фазе хорошо разделяются ве
щества с двойными связями, и, наконец, нитрофаза используется как наполни
тель для колонки при разделении различных полициклических ароматических
веществ и гетероциклов.
Теоретические принципы хроматографических процессов разделения
Как уже отмечалось, хроматография – это процесс разделения смеси веществ на
отдельные компоненты с помощью системы, состоящей из двух не смешиваемых
друг с другом фаз. Далее будут обсуждаться процессы разделения исключительно
ЖХ с использованием колоночной технологии. Хроматографические разделения
в основном, не говоря о специальных хроматографических механизмах разделе
ния, таких как обращено фазная хроматография, ионообменная, гель хроматог
рафия, ион парнораспределительная и биоаффинная хроматография, можно
описать с помощью двух физико химических процессов адсорбции и распреде
ления.
Подробнее адсорбционные и распределительно хроматографические процес
сы разделения, как и специальные технологии разделения, обсуждаются в соот
ветствующих монографиях [3].
Хроматографический процесс разделения будет описан и определен на хро
матограмме в основном с помощью хроматографических параметров. Под хрома
тограммой в колоночно жидкостной хроматографии подразумевается элюентный
профиль смеси веществ в форме пика на бумаге самописца. Форма пика есть не
что иное, как изменение концентрации элюированного вещества в зависимости
от времени. Для описания или характеристики отдельных пиков и всей хромато
граммы могут привлекаться параметры, названные в следующем разделе.
Удерживающая способность
Она содержит время удерживания (tR), объем удерживания (VR), коэффициент
емкости (k′) и относительное удерживание (α), названное также коэффициентом
разделения. С помощью этих параметров, как уже упоминалось, проводится опи
сание пиков в хроматограмме.
Для этого применяют следующее схематическое представление: время запаз
дывания t0 – это то время, которое требуется незапаздывающему веществу, чтобы
пройти разделительную колонку, т. е. это время, которое для этого также требует
ся подвижной фазе. Если, напротив, соединение запоздает при прохождении раз
делительной системы, то оно появится после времени запаздывания t0, т. е. оно
указывает время удержания tR. Это отставание или запаздывание основывается на
том, что соединения наряду со временем удерживания в подвижной фазе вступа
ют во взаимодействие с неподвижной фазой. Если два вещества неподвижной фазы
запаздывают по разному, то происходит их элюирование со смещением времени
(tR1 и tR2), и это приводит к разделению, как можно видеть на рис. Е.2. Время удер
жания нетто неподвижной фазой t′
R получают из tR – t0.
Чтобы можно было также сравнить друг с другом разделения на колонках раз
личных размеров при различных скоростях потока, время удерживания превраща
ется в безразмерную величину, в коэффициент емкости k′, следующим образом:
.
0
R
0
r 0
t
t
t
t t
k
′
=
−
′ =
k′ – это соотношение времени удерживания вещества в неподвижной и под
вижной фазе. Уравнение означает, что коэффициент емкости k′ – это время удер
живания в неподвижной фазе в пересчете на время запаздывания. Предпочитает
ли вещество оставаться в подвижной или неподвижной фазе, можно описать с
помощью коэффициентов распределения К:
.
концентрация в подвижной фазе
концентрация в неподвижной фазе К =
Величину k′ можно определить следующим образом:
.
объем подвижной фазы
объем неподвижной фазы
k′ = K
Следовательно, возникает логический вывод, что два вещества могут отделить
ся друг от друга только тогда, когда обнаруживается разность коэффициентов.
Критерием этого является относительное удерживание (α):
.
1
2
k
k
′
′
α =
Рис. Е.2
Время
Сигнал детектора
14 Введение
Разделение возможно только тогда, когда k′
2 > k′
1 . Относительное удерживание
является как раз при препаративных разделениях важнейшим критерием для ха
рактеристики хроматографической разделительной системы, т. е. для ее избира
тельности!
Высота пика h и площадь пика F пропорциональны концентрации веществ и
тем самым служат для количественной оценки с помощью интегратора или систе
мы обработки данных. Количественно можно определить отдельные пики и с по
мощью ручной обработки данных хотя и несколько медленно, но довольно точно.
Для этого ширина пика в половинной высоте (1/2Br) умножается на высоту пика h:
F = 1/2Br · h.
Перед рассмотрением упомянутого хроматографического разделения R нужно
еще объяснить два важных понятия. Число тарелок или ступеней разделения N яв
ляется непосредственным критерием для производительности колонны, для опре
деленного вещества при определенных условиях. Число тарелок N пропорциональ
но длине колонки L, и его расчет осуществляется по следующему уравнению:
16 ,
2
R
⎟ ⎟⎠
⎞
⎜ ⎜⎝
⎛
= ⋅
W
t
H
L
N
где L – длина колонки, H – высота тарелки, tR – время удерживания, W – базовая
ширина пика.
Высота тарелки Н колонки – это отрезок пути, который должно пройти веще
ство в колонне, чтобы установилось равновесие. Установление равновесия обознача
ет равенство между адсорбцией и десорбцией вещества. Чем короче отрезок пути
для этого процесса, тем меньше высота тарелки Н. При постоянной длине колон
ки L увеличивается количество тарелок N с уменьшением высоты тарелки H.
Высоту тарелки Н можно определить из хроматограммы или на основе пика
следующим образом:
.
16
2
R
⎟ ⎟
⎠
⎞
⎜ ⎜
⎝
⎛
= ⋅
t
L W
H
Степень разделения R двух пиков определяется через удаленность их друг от
друга (tR – разница) и средним арифметическим из базовой ширины W:
( ).
W
2
1 2
R2 R1
W
t t
R
+
−
=
При некоторых хроматографических разделениях стараются достичь достаточ
ной и небольшой степени разделения. При R = 1,5 получается разделение почти по
основной линии. Большая степень разделения только бы удлинила время анализа.
Из ранее обговоренных параметрических значений следует вывести важней
шее уравнение хроматографии:
.
1
1
4
1
k
k
R N
+ ′
′
= ⋅ − ⋅ ⋅
α
α
Уравнение содержит важнейшие параметры, которые благодаря оптимизации
ведут к улучшению степени разделения R. Чем проще можно повысить избиратель
ность, т. е. относительное удерживание α, тем эффективнее система разделения.
Теоретические основы эксклюзионной хроматографии
Если осуществляется разделение веществ на пористых гелях в результате ситово
го эффекта, т. е. по степени уменьшения размеров молекул, то механизм разделе
ния прост и обозрим. Все соединения, которые имеют одинаковую или бóльшую
молярную массу, чем указанный изготовителем предел исключения геля, выходят
неразделенными в качестве первого пика в элюате, так как они проходят только
объем между гранулами, недействительный для хроматографического процесса
разделения. Предпосылкой, разумеется, является то, что вещества не задержива
ются гелем. Меньшие соединения покидают колонку в соответствии с размером
молекул по мере уменьшения. Они также не могут препятствовать своему элюи
рованию, не будучи адсорбированы гелем. Элюированием мельчайших молекул
(объем элюирования = объем между гранулами плюс объем пор: Vz + VP) заканчи
вается «гель хроматографический» процесс разделения.
Разделение смеси веществ по уменьшающемуся размеру молекул имеет много
названий. Речь идет о гель хроматографии, эксклюзионной хроматографии, мо
лекулярно ситовой хроматографии, гель проникающей хроматографии, диффу
зии полого пространства и гель фильтрации.
Несмотря на определенные различия, имеется в виду всегда один и тот же ме
ханизм разделения, краткое описание которого можно выразить в следующих
предложениях.
• Гель хроматографией называется колоночно хроматографический способ раз
деления, при котором вещества разделяются по их молекулярному размеру.
• Гель хроматография принципиально отличается от всех других методов хро
матографии. Здесь способствует разделению не какое то взаимодействие, а
простой процесс сортировки по размеру молекул.
• Гель хроматография, а также гель проникающая хроматография – это хро
матографический метод, который применяется прежде всего в биохимии и
химии природных веществ и который разделяет смесь веществ по разнице
размеров.
• При гель хроматографии компоненты смеси сортируются исключительно
по размеру молекул.
• Механизм разделения при гель хроматографии – это чисто физический ме
ханизм и основывается на сортировке по размерам молекул.
• Гель хроматография – это особый вид жидкостно/жидкостной хроматог
рафии для разделения веществ на базе их различных размеров молекул.
Эти описания в основном соответствуют тогда, когда разделяют высокомоле
кулярные вещества, т. е. полимеры на наполнителе колонки с соответствующим
размером пор. Если, напротив, используются гели с низким пределом исключе
ния, которые тоже обнаруживают сравнительно узкий пористый спектр, то и низ
16 Введение
комолекулярные соединения с молярными массами (1000) также хорошо могут
разделяться не только по убывающему размеру молекул, но и благодаря избира
тельным адсорбционным эффектам.
Если колонку в качестве суспензии заполняют пористым гелем, способным
выдерживать высокое давление или набухающим для хроматографии при низком
давлении, то слой геля состоит из трех фаз: растворителя (при набухающих гелях
растворитель одновременно является также жидкостью для набухания) между гра
нулами геля и в порах, а также матрицей геля в форме неорганического и органи
ческого материала. Общий объем гелевого слоя Vt cскладывается в соответствии с
этим следующим образом:
Vt = Vz + Vp + Vm,
где Vz – объем между гранулами, Vp – объем пор, Vm – объем матрицы геля
Объемные составляющие гелевого наполнителя лучше всего можно продемон
стрировать на хроматограмме элюирования.
Объемные отношения в гелевом наполнителе
Чтобы разделить все соединения от мельчайших молекул до высокомолекулярных
полимеров по снижающейся молярной массе, нужно иметь несколько гелей с воз
растающим пределом исключения, которые своим пористым спектром перекрыва
ют весь диапазон молярных масс. В зависимости от размера и спектра пор каждый
гель наряду с пределом исключения имеет приблизительный диапазон разделения
и фракционирования. Подробную информацию относительно отдельных гелей
можно получить из специальной литературы и фирменных изданий.
Чтобы можно было охарактеризовать гель хроматограмму, требуются объемы
элюирования в качестве параметра элюирования.
• Объем между гранулами VZ – это объем жидкости между гранулами (зерна
ми) геля набивки колонки. Гель может быть не набухающим, предназна
ченным для высоких давлений, или набухающим, выдерживающим лишь
незначительное давление. Объем между гранулами Vz определяют с помо
щью высокомолекулярного вещества, которое не может проникнуть даже в
самые большие поры геля. На рис. Е.3 пик 1 наглядно представляет объем
между гранулами Vz и одновременно маркирует первый пик с наибольшей
молярной массой. Как уже говорилось, разные изготовители предлагают
многочисленные сорта гелей, будь то декстрановые, полиакриламидные или
стирогели, с разными диапазонами фракционирования. Вследствие этого у
них пониженный или повышенный предел исключения. Vz можно также
определить исходя из размеров колонок, что составляет при статистичес
кой упаковке и приблизительно шарообразных частичках геля около 0,37 Vt
• Объем пор Vp – это объем жидкости во всем объеме пор. Этот объем опре
деляется с помощью веществ, которые в состоянии попасть во все, даже
мельчайшие поры геля, при условии что они не будут удерживаться матри
цей геля, как последний пик разделения. На рис. Е.3 пик маркирует мель
чайшие молекулы с самым продолжительным временем элюирования, и это
обозначает максимальный общий объем элюирования. Все соединения,
которые меньше пика 1 или больше пика 6, появляются в соответствии с
уменьшением молярных масс между крайними пиками в хроматограмме элю
ирования. Итак, Vp – это объем, в котором происходит разделение. Вслед
ствие этого пик 6 испытывает полное, а пики 2–5 только частичное проник
новение. Пики 7 и 8 задерживаются за счет адсорбции. То, что определение
объема пор Vp не составляет проблемы, будет обсуждаться позже.
• Объем гелевой матрицы, Vm, назваемый также объемом матрицы, это объем
чистой гелевой матрицы и представляет собой ту часть объема колонки,
которая не доступна как для растворителя, так и для пробы.
Параметры элюирования в хроматографии исключения
В хроматографии исключения характер элюирования веществ определяется с по
мощью значений Kd и Kav:
, .
t z
e z
av
p
e z
d V V
V V
K
V
V V
K
−
−
=
−
=
Ve – это объем элюирования вещества, которое претерпевает частичное про
никновение и поэтому появляется после Vz, однако раньше, чем самые маленькие
соединения. Ve может рассчитываться следующим образом:
Ve = Vz + Kd ⋅ Vp,
при этом под Kd подразумевают долю внутреннего объема гранул, доступную для
молекул данного размера. Как правило, измеряют объем элюирования и рассчи
тывают значения Kd при условии, что Vz и Vp известны.
Определить точные значения Kd проблематично, так как они связаны с нена
дежностью в определении Vp. Значительно точнее можно определить значения Kav
(av – англ.: available, нем.: zugünglich, рус.: доступно), так как вместо объема пор
Vp для расчета используется общий объем гелевой фазы. На практике, если даже
представлены многочисленные интересные разделения, нет в наличии ни значе
ний Kd, ни значений Kav для характеристики результатов разделения. Практикам
остается довольствоваться временем или характером элюирования, так как раз
деления проводятся в препаративном, а не в аналитическом масштабе.
На рис. Е.3 можно увидеть, что по объему элюирования малейших молекул на
пике 6 (Vz + Vp или Kd = 1) разделение еще не закончено. Все вещества, которые
появляются позднее, будут в большей или меньшей степени сильно запаздывать,
но внутри объема пор Vp также можно очень часто наблюдать разделения по уве
личивающейся молярной массе.
Насколько хорошо отделились друг от друга два компонента одной пробы с
помощью хроматографических методов, можно хорошо определить в эксклюзи
онной хроматографии с помощью понятия степени разделения R. В эксклюзион
ной хроматографии время удерживания не адаптируется к механизму разделения,
а применяются объемы жидкости, такие как Vz, Vp и Ve, для характеристики режи
18 Введение
ма элюирования веществ. Исходя из этого, степень разделения R определяется
следующим образом:
( )
,
2
1
1 2
2 1
W W
V V
R
+
−
=
где V2 – V1 – расстояние между вершинами пиков, W1 и W2 – ширина зоны или
ширина пика двух разделенных веществ.
Степень разделения R, как известно, зависит от коэффициента емкости k′,
коэффициента избирательности α (относительное удерживание) и производитель
ности колонки, которая измеряется по количеству теоретических тарелок N.
Названные параметры определяются следующим образом:
16 .
2
1 z
2 z
z
z 1 ⎟⎠
⎞
⎜⎝
⎛ =
−
′ = − = −
W
V
N
V V
V V
V
V V
k α
Они связаны со степенью разделения R по следующему известному уравнению:
.
1
1
4
1
k
k
R N
+ ′
′
= ⋅ − ⋅ ⋅
α
α
Рис. Е.3
Объем и параметры элюирования
в гелевой хроматографии на Сефадексe LH 20 (Sephadex LH 20)
Vp (полное проникновение), Kd = 1
Доля
объема
пор + Vz
Pазмер молекул уменьшается
увеличи
вается
Высокая
избира
тельность
благодаря
адсорбции
Oбъем
разде
ления
Исключен
ный объем Частичное проник новение
Отсутствие Диапазон молекулярно ситовой Адсорбционные
разделения и адсорбционные разделения разделения
Конец
молеку
лярно
ситовой
хромато
Начало графии
молекулярно
ситовой
хроматографии
Старт (пуск)
(впрыски
вание)
Введение 19
Разделения можно достичь эффективнее всего путем изменения коэффици
ента избирательности α.
Улучшение и изменение избирательности на Сефадексе LH 20 может быть
очень хорошо реализовано с помощью чистых растворителей. Для этого требует
ся максимально 4 колонки с растворителями метанол, ацетон, метиленхлорид и
вода в качестве подвижной фазы.
Рис. Е.4
Нет Молекулярно ситовая хромато Адсорбционное разделение
разделения графия. Сита и адсорбция
Объем пор Vp
a d: «каналы»
с подвижной фазой
Cоединения, разделенные
за счет адсорбции, имеют
бóльшую молярную массу,
чем вода.
Вода = Vz + Vp
Полное проникновение
Aдсорбция
20 Введение
Улучшение селективности на Сефадексе LH 20 обозначает, что, например, для
разделения смеси метанолом требуется 5 метровая колонна, а с помощью ацето
на достаточно уже высоты гелевого слоя 870 мм, при разделении же метиленхло
ридом достаточно всего лишь высоты гелевого слоя в 200…350 мм.
Изменения и улучшения селективности в смысле перемены последователь
ности элюирования можно также наблюдать при смене подвижной фазы.
В молекулярно ситовой хроматографии объем элюирования Ve любого низ
комолекулярного вещества можно формулировать следующим образом:
Vz < Ve < Vz + Vp.
Однако это формулирование ничего не говорит о возможном отставании внут
ри объема пор Vp. Замедляется ли определенное вещество декстрангелем и насколь
ко при элюировании адсорбировано, можно легко определить исключительно с
помощью тестовых веществ.
Для этого лучше всего использовать соединения с идентичными молярными
массами, которые элюируются в зоне объема пор Vp. Однако если объем элюиро
вания Ve > Vz + Vp, то соединение удерживается за счет адсорбции, т. е. оно появля
ется позже Vz + Vp и выражается иначе:
Ve = Vads.
На рис. Е.4 представлен обращенный ситовой эффект благодаря становящимся
все ýже порам и каналам, которые заполнены подвижной фазой. В практической
части будет показано, что в диапазоне объема пор, т. е. между пиками 1 и 5, также
возможно разделение за счет адсорбции. Чисто адсорбционно хроматографичес
кие разделения осуществляются, как уже говорилось, в диапазоне объема элюи
рования по формуле Vz + Vp, и, таким образом, значения Kd > 1.
Глава 1
Аналитические разделения
Под аналитическими разделениями подразумеваются методы быстрого качествен
ного, а также количественного определения веществ в смесях синтетического или
натурального происхождения. Под термином «качественный» понимается иден
тификация отдельных компонентов пробы с помощью значений Rt (хроматогра
фия на бумаге и тонкослойная хроматография) или на основе времени удержа
ния (хроматография на колонке, т. е. ЖХ и ГХ жидкостная и газовая хроматог
рафия). При количественном определении после проведенной калибровки из
меряются пятна в хроматографии на бумаге и в тонкослойной хроматографии.
В хроматографии на колонке, жидкостной и газовой хроматографии количе
ственная оценка компонентов смеси – равным образом и по предшествовавшей
калибровке – проводится посредством стандартов на основе площади пика, реже
высоты пика.
В разделах 3.2.1 до 4.1.3 будут представлены различные аналитические и пре
паративные разделения с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Здесь описание приборов и
колонок будет дано лишь кратко; больше информации можно почерпнуть из об
щеизвестных монографий (см. список литературы). Далее в краткой форме будет
представлено устройство аппаратуры ВЭЖХ. Автор полностью отказывается от
описания приборной части и ее компоновки, особенно в количественной тонко
слойной хроматографии, так как в этой книге, ориентированной на практичес
кое применение, она является в основном пилотным методом. Приборы для ВЭЖХ
имеются в модульной и компактной конструкции. Выбор аппаратуры зависит от
недостатков и преимуществ, которые выявляются при соответствующем случае
применения. Модульные установки ВЭЖХ имеют большое преимущество в том,
что при необходимости отдельные приборы, такие как, например, насос или де
тектор, быстро могут быть заменены.
1.1. Приборы (устройства)
Аппаратура ВЭЖХ состоит из следующих компонентов:
• сборник для подвижной фазы (элюента),
• насос,
• градиентная система,
• дозатор для проб,
• колонка и наполнитель для нее,
• детектор
• прибор регистрации и обработки данных.
1.1.1. Насосы
В ВЭЖХ чаще всего применяются насосы с одним и сдвоенным поршнями с ко
ротким ходом. Поршень в большинстве случаев состоит из сапфира (оксида алю
миния). Верхняя часть поршня, а также все детали, которые соприкасаются с элю
ентом, выполнены из устойчивой против коррозии нержавеющей стали. Наряду с
поршневыми насосами с коротким ходом используются также таковые с длин
ным ходом и мембранные насосы.
Аналитические насосы ВЭЖХ должны соответствовать следующим требо
ваниям:
• регулируемая норма (скорость) потока в диапазоне 0,1…10 мл/мин,
• стабильность потока ± 2% и лучше при противодавлении до 250 бар.
1.1.2. Градиентные системы
Градиентные системы служат для того, чтобы во время элюирования многоком
понентной смеси проб непрерывно изменять состав подвижной фазы. Благодаря
изменению процента содержания двух или трех растворителей в элюенте изменя
ют его элюционную силу и только благодаря этому достигают удовлетворитель
ного разделения. Другими словами, с помощью градиентов растворителей, ана
логично температурному градиенту (перепаду) в ГХ, создается оптимальная сис
тема разделения для смеси веществ.
Существует 2 системы градиента, а именно градиенты низкого и высокого
давления. Если происходит смешивание растворителей на стороне низкого дав
ления насоса, то говорят о градиенте низкого давления, и наоборот.
1.1.3. Дозатор для проб
Ввод проб в верхнюю часть колонки осуществляется, как правило, через 6 ка
нальный поворотный кран, который можно обслуживать вручную или через
электронное управление. Объемы завихрений проб, вводимых в дозирующую
петлю через нагнетательные клапаны, задаются исходя из выбора размеров ко
лонок, длины и внутреннего диаметра. Объемы завихрений проб могут состав
лять 1…250 мкл, при этом в аналитической ВЭЖХ чаще всего используются та
ковые в 10 или 20 мкл.
1.2. Колонки
Колонка, будь то жидкостная или газовая хроматография, является основой любой
разделительной аппаратуры, так как именно в ней происходит разделение. Разде
ления могут достигаться благодаря оптимизации разделительной системы, которая
состоит из наполнителя колонки и подвижной фазы. Улучшенные кривые (пики) с
помощью компьютеров скорее скрывают правильный результат разделения.
В аналитической ВЭЖХ, наряду с собственно разделительными колонками,
используют также предварительные колонки, которые должны препятствовать хи
мическому или механическому загрязнению основной колонки. Предваритель
1.3. Наполнители колонки 23
ная колонка, примерно 4…5 см длиной, содержит, как правило, тот же заполни
тель, что и разделительная колонка.
Колонки состоят из трубы из нержавеющей стали, которые на обоих концах
имеют резьбовое соединение. Спекшаяся масса (агломерат), которая удерживает
содержимое колонки, крепится с помощью уплотнения на верхней части колон
ки. Внутренний размер чаще всего применяемых аналитических колонок состав
ляет 4 × 125 мм или 4 × 250 мм. Более точные данные относительно колонок и их
конструкции можно получить в фирменных изданиях или цитируемом ранее «Ру
ководстве по ВЭЖХ».
1.3. Наполнители колонки
Наполнители колонки, названные также неподвижными фазами, состоят в основ
ном из двух различных материалов: на основе силикагеля и структурированных
органических полимеров. На немодифицированных силикагелях адсорбционно
хроматографические разделения проводятся, как правило, с помощью смесей орга
нических растворителей в качестве подвижных фаз. Поверхностно модифициро
ванные силикагели по своим свойствам и их применению подразделяются, как в
следующих разделах.
1.3.1. Силикагели и структурированные органические полимеры
При этом различаются следующие фазы.
• Химические модифицированные полярные силикагельные фазы с гидро
ксильными, нитриловыми, нитро и аминоконцевыми группами для адсор
бционных разделений.
• Силикагелевые фазы с обращенной фазой с n октадецил , n октил , метил
и фенил группами.
Эти фазы обладают как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами
и поэтому могут применяться разносторонне. С полярными подвижными
фазами элюирование осуществляется по снижающейся полярности.
• Неподвижные фазы с ионными группами, такими как –SO3H и –СООН в
качестве сильных и слабых катионообменников. Есть также сильные и
слабые анионообменники с функциональными группами (–+NR3OH) и
(–+NH3Cl). В качестве основного материала наряду с силикагелями исполь
зуются также структурированные органические полимеры.
В эксклюзионной или молекулярно ситовой хроматографии используются как
силикагели, так и структурированные органические полимеры, которые обладают
более узким или более широким спектром пор. При наличии 2–3 таких колонок,
которые имеют различные размеры пор, можно перекрыть бóльшие диапазоны мо
лекулярных весов, это значит, что с помощью последовательно соединенного на
бора колонок можно хорошо разделить и охарактеризовать смеси веществ разной
молярной массы. Подробные сведения относительно гель проникающей хромато
графии (ГПХ), названной также методом эксклюзионной хроматографии, можно
найти в различных монографиях о ЖХ. Есть монографии, которые занимаются ис
ключительно ГПХ. Следует указать на материалы для аффинной хроматографии.
1.4. Подвижные фазы
Подвижные фазы, называемые также элюентом, действуют как растворитель и
средство переноса для растворенной смеси веществ. У немодифицированных и
химически полярно связанных силикагелей следующие растворители в разных
комбинациях используют в качестве подвижных фаз: 1 пентан, 1 гексан, цикло
гексан, дихлорметан, ацетон, тетрагидрофуран, диоксан и сложный этиловый эфир
уксусной кислоты, если называть только наиболее часто используемые. Благода
ря модифицированию поверхности с помощью гидрофобных групп, таких как
1 октадецил, 1 октил, метил или фенилен, получают наполнители для колонок,
которые применяют в основном для разделений по снижающейся полярности.
Для этого используют смеси из следующих растворителей в качестве подвижных
фаз: вода, метанол, ацетонитрил, пропанол, тетрагидрофуран и диоксан. В от
дельном случае могут использоваться также другие растворители или смеси в ка
честве элюентов. В гл. 3 будут даны предложения, какие подвижные фазы, чистые
растворители или смеси, с какими наполнителями колонок комбинируются, что
бы образовать оптимальную разделительную систему.
1.5. Детекторы
Детекторы для ВЭЖХ имеют проточную ячейку, через которую непрерывно про
ходит элюат, при этом замеряются изменения в потоке жидкости. Могут быть
физические или химические свойства, которые определяются в компонентах про
бы с помощью избирательных индикаторных приборов, таких как ультрафиоле
товые, флюоросцентные и электрохимические детекторы, а также универсальные
и часто применяемые приборы, такие как детектор показателей расчета.
1.6. Устройства для сбора и обработки данных
Самый простой способ регистрации сигнала детектора осуществляется с помо
щью самописца, и используют его чаще всего при разработке метода. Интегриро
ванные устройства, напротив, служат для обработки, распечатки и сохранения в
памяти хроматограмм и их данных.
Глава 2
Препаративное разделение
Препаративное разделение всегда служит для выделения чистых веществ из про
дуктов реакции или смесей природных веществ, независимо от того, в каких ко
личествах мг, г или кг они проводятся. При выделении чистых компонентов из
смесей веществ нужно всегда помнить о том, что хроматографические методы или
процессы имеет смысл использовать лишь тогда, когда другие способы разделе
ния, такие как перегонка, кристаллизация, экстракция и т. д., не приводят к же
лаемому результату. Следующие критерии, без претензии на полный охват, отве
чают на вопрос: с какой целью проводится препаративное разделение:
• наработка стандартных веществ или веществ сравнения для аналитических
хроматографических методик, включая: ВЭЖХ (высокоэффективная жид
костная хроматография), ГХ (газовая хроматография) или ВЭTCХ (высо
коэффективная хроматография в тонком слое сорбента);
• идентификация, качественное и количественное изучение продуктов хи
мических реакций или процессов:
• выделение и очистка полупродуктов или очистка конечного продукта хи
мического синтеза;
• регенерация ценных исходных компонентов синтеза;
• выделение примесей из конечного продукта синтеза для изучения их струк
туры и степени токсичности;
• очистка биологически активных веществ при синтезе фармацевтических
субстанций;
• выделение и очистка природных биологически активных веществ для экс
периментального изучения;
• выделение и очистка природных индивидуальных компонентов из экстрак
тов на основе растительного сырья.
Процессы препаративного разделения при низком давлении рассматривается
в гл. 6. Процессы препаративного разделения при высоком давлении часто при
меняются для получения индивидуальных веществ в промышленном масштабе.
Более точные описания их можно найти в различных публикациях и монографи
ях, а также фирменных изданиях.
Хотя препаративное разделение при низком давлении может продолжаться
многие часы, его использование не следует категорически отклонять. Для окупа
емости процесса разделения в промышленных масштабах продолжительность его
должна быть сокращена. С помощью автоматической дозировки проб и фракци
онирования элюата можно проводить длительные процессы разделения в ночные
часы. Для повышения эффективности процесса и гарантии количественного раз
деление возможно увеличение длины хроматографической колонки. Такой про
цесс, как уже упоминалось, можно проводить в ночные часы. Этот вариант опти
мизации разделения дешевле, чем поиск более эффективной системы разделе
ния, что, исходя из опыта, может занять до двух дней.
Цели и задачи препаративной ЖХ могут быть представлены так же, как на
рис. Е.1.
2.1. Приборы
Оборудование и приборы для препаративной жидкостной колоночной хрома
тографии по конструкции сравнимы с аналитическими приборами. Сборник для
подвижной фазы, насос, система ввода пробы, колонка и материал для запол
нения колонки, а также детектор самописец или интегратор аналогичны по своим
функциям. Отличие в оборудовании для препаративного разделения состоит в
том, что дополнительно нужны коллектор фракций и ротационный испаритель
для их концентрирования, обогащения и выделения. Оборудование и приборы
обычно подбирают к процессу препаративного хроматографического разделе
ния: производительность насоса, объем дозатора, конструкционные особенно
сти колонки.
2.1.1. Насосы
Детальное описание и принцип работы насосов можно найти в монографиях
по жидкостной колоночной хроматографии. Для различных видов препаратив
ного хроматографического разделения можно использовать следующие марки
насосов:
• Duramat® 80 – Pro Minent B,
• Sepapress PCP – 150/75 – Constakron 3 и 4,
• Buechi 681 – Desaga KP 2000,
• Gilson Modell 302,
а также насосы многих других производителей.
В случае необходимости, например при работах с мягкими, сильно набухаю
щими гелями типа Сефадекс LH 20, используют различные демпфирующие сис
темы для снижения пульсации насоса. В препаративной жидкостной хроматогра
фии низкого и среднего давления используют демпферы, работающие в диапазо
не 1…6, 0…20 и 0…50 бар. Полное устранение пульсации достигается путем уста
новки проточных, стальных или тефлоновых капиллярных демпферов (5…10 м)
между насосом и хроматографической колонкой.
2.1.2. Подготовка проб
Подготовка пробы для аналитической или препаративной жидкостной колоноч
ной хроматографии заключается в удалении нежелательных компонентов, как
растворимых, так и нерастворимых. Удаление нежелательных примесей осуще
ствляют путем фильтрации, дистилляции, экстракции, центрифугирования или
кристаллизации. Установка предколонок или дополнительных колонок позволя
2.3. Материалы для заполнения колонки 27
ет исключить из пробы нежелательные вещества и защитить сорбент основной
колонки от вредного химического или механического воздействия.
2.1.3. Дозировка проб
Система ввода пробы осуществляется устройствами, способными количественно
наносить смесь разделяемых веществ в головную часть разделительной колонны.
Введение пробы может осуществляться вручную или с помощью автоматических
устройств.
Ручной ввод пробы производится с помощью 6 портового петлевого дозато
ра. Эти дозаторы в зависимости от конструкции могут выдерживать давление до
35 бар и поставляются различными производителями.
Устройства, работающие в автоматическом режиме, сравнимы с ручными доза
торами. Ввод пробы производится через заданный промежуток времени автомати
чески. Простая система ввода пробы представлена автором. С помощью 3 ходово
го шарового крана и электронного привода можно с любыми интервалами регули
ровать объем пробы.
2.2. Колонки
В препаративной жидкостной колоночной хроматографии применяются колон
ки из стали, стекла и пластмассы. Стальные колонки используются для разделе
ния при высоком давлении. Стеклянные, а также пластмассовые колонки нахо
дят свое применение в хроматографии низкого и среднего давления. В настоя
щем издании рассматриваются исключительно стеклянные колонки, работающие
при низком давлении. Определение параметров стеклянных колонок, будь то дли
на и/или внутренний диаметр, может быть очень разным, как это можно будет
заключить из последующей компоновки.
Очень важными конструкционными элементами этих колонок являются на
конечники или адаптеры, регулируемые или не регулируемые. При использова
нии жестких сорбентов, например силикагелей, применяются в основном два не
регулируемых наконечника. При использовании для заполнения колонок мягких,
набухающих сорбентов (гелей) хотя бы один наконечник должен быть с регули
ровкой. Регулируемые адаптеры позволяют корректировать высоту слоя геля при
загрузке и перезагрузке колонки. При выборе адаптера необходимо обращать вни
мание на его конструкцию для оценки возможности провести ремонт собствен
ными силами при появлении негерметичности системы.
2.3. Материалы для заполнения колонки
Колонки, заполненные сорбентами в комбинации с подвижными фазами, являются
основой любой хроматографической разделительной установки. Неподвижные фазы
или сорбенты можно разделить на две основные группы (обозначение «неподвижная
фаза» для сорбентов не всегда адекватно, так как элюент, находящийся в геле или
порах сорбента, оказывает влияние на процесс разделения компонентов пробы):
• жесткие сорбенты, устойчивые к высоким давлениям, на основе модифи
цированных или не модифицированных силикагелей и синтетических со
полимеров с большим числом поперечных связей;
• мягкие сильно набухающие гели, чувствительные к давлению, на основе при
родных и синтетических полимеров с малым числом поперечных связей.
2.3.1. Силикагели
Немодифицированные силикагели разделяют компоненты пробы по нарастаю
щей полярности. Сильно полярные или основные соединения в значительной
степени отстают из за взаимодействия с кислотными силановыми группами или
же необратимо адсорбируются по сравнению с нейтральными веществами. В та
ких случаях помогает добавка диэтиламина в незначительных количествах, чтобы
деактивировать полярный силикагель и тем самым избежать вышеназванных эф
фектов. В качестве подвижных фаз, как правило, используют безводные смеси
растворителей. Недостатком силикагеля является проблема с его регенерацией.
Гель в большинстве случаев выгоднее утилизировать, чем с большим трудом очи
стить различными растворителями. Как в немодифицированном силикагеле из
бирательно разделить сложные смеси веществ с различной полярностью с помо
щью ступенчатого (каскадного) элюирования, будет показано в разделе 5.4.
Гидрофобные силикагели, обращенные фазы С 8 и С 18, разделяют вещества
с помощью водно метаноловой или водно ацетонитриловой смеси по убываю
щей полярности. Чем выше доля органического растворителя в подвижной фазе,
тем сильнее элюирование, и наоборот.
2.3.2. Структурированные органические полимеры
Из набухающих гелей, синтетических полимеров используется в основном декст
рангель Сефадекс LH 20 и в незначительном объеме Сефадекс G 10 а также Сефа
декс LH 60. Большим преимуществом Сефадекса LH 20 является то, что на этом
наполнителе колонки можно очень выборочно производить разделение с помощью
чистых растворителей в качестве подвижных фаз. Ни с каким другим полимерным
гелем даже приблизительно нельзя достигнуть сравнимых разделений.
2.4. Подвижные фазы
Как уже упоминалось, при использовании немодифицированного силикагеля или
его вариантов с модифицированной поверхностью применяют смеси растворите
лей в качестве подвижных фаз, так как только так возникают селективные (изби
рательные) системы разделения, таков широко распространенный опыт. Но на
немодифицированном силикагеле можно достичь хорошего разделения и с по
мощью чистых органических растворителей, таких как дихлорметан, этилацетат
или ацетон, применяемых в качестве подвижных фаз. Годится ли растворитель и
насколько хорошо он подобран, можно установить на основе тонкослойного раз
деления. При использовании обращенной фазы можно в большинстве случаев
достичь хорошего разделения с помощью чистого органического растворителя вме
сто водно метаноловой или водно ацетонитриловой смеси, при условии, что бу
дут последовательно соединены две или больше колонок. Так как эти препара
тивные разделения могут проходить вне рабочего времени (например, ночью)
более высокая затрата времени не обязательно является недостатком. Чистые орга
нические растворители имеют следующие практические преимущества:
• пробы лучше растворяются;
• для разделяемых веществ (субстанций) безводная подвижная фаза являет
ся более щадящей при изолировании;
• регенерация элюента менее проблематична, происходит быстрее, почти без
потерь и, таким образом, выгоднее.
Если применяют декстрангель Сефадекс LH 20, то с помощью чистых раство
рителей, таких как метанол, ацетон, дихлорметан, этилацетат или вода, можно очень
избирательно провести детерминированное разделение. Полярный декстрангель по
сравнению с тоже полярными, но кислотными силикагелями обладает тем преиму
ществом, что адсорбция веществ очень редко заканчивается необратимо.
Хорошая растворимость в так называемом растворителе или в других, кото
рые находят применение в качестве подвижной фазы, является гарантией того,
что компоненты пробы количественно вымываются (элюируются).
2.5. Детекторы
Детекторы должны выполнять в колоночно жидкостной хроматографии две задачи:
• распознавание, т. е. детектирование разделенных субстанций,
• количественная оценка разделенных соединений по пиковой площади или
высоте после поверки (калибровки) с помощью стандарта.
Тем самым они служат в общем качественному и количественному распозна
ванию веществ, которые появляются в элюате на конце колонки. В препаратив
ной колоночно жидкостной хроматографии в основном применяются дифферен
циальные рефрактометры и ультрафиолетовые детекторы. Эти и другие детекто
ры можно получить, например, на следующих фирмах:
• Latek, D 69214 Eppelheim,
• Knauer, D 14163 Berlin,
• Bischoff, D 71229 Leonberg,
• Waters, D 65760 Eschborn,
• Kontron, D 85375 Neufarn.