eng
Содержание
Содержание
Предисловие к пятому изданию 13
Предисловие редактора перевода 14
Важные и полезные формулы в ВЭЖХ 15
Глава 1. Введение 18
1.1.
ВЭЖХ: эффективный метод разделения 18
1.2.
Первый эксперимент с ВЭЖХ 18
1.3.
Виды разделений в жидкостной хроматографии 20
1.4.
Хроматографическая система для ВЭЖХ 22
1.5.
Безопасность в хроматографической лаборатории 23
1.6.
Сравнение высокоэффективной жидкостной и газовой
хроматографии 24
8.6.
Уравнение Ван-Деемтера с приведенными параметрами и его
использование в диагностике колонок 154
8.7.
Кривые Ван-Деемтера и другие зависимости 156
8.8.
Коэффициенты диффузии 158
Глава 9. Адсорбционная хроматография: нормально-фазовая хроматография 161
9.1.
Что такое адсорбция? 161
9.2.
Элюотропный ряд 164
9.3.
Селективные свойства подвижной фазы 164
9.4.
Выбор и оптимизация состава подвижной фазы 167
9.5.
Приложения 170
Глава 10. Обращенно-фазовая хроматография 173
10.1.
Основы 173
10.2.
Подвижная фаза в обращенно-фазовой хроматографии 175
10.3.
Селективность и сила растворителей 177
10.4.
Обращенно-фазовые неподвижные сорбенты 180
10.5.
Разработка методики в обращенно-фазовой хроматографии 185
10.6.
Приложения 186
10.7.
Хроматография гидрофобных взаимодействий 189
Глава 11. Хроматография на химически привитых фазах 192
11.1.
Введение 192
11.2.
Свойства некоторых стационарных фаз 192
11.3.
Хроматография гидрофильных взаимодействий 196
Глава 12. Ионообменная хроматография 198
12.1.
Введение 198
12.2.
Принцип ионообменной хроматографии 198
12.3.
Свойства ионообменников 199
12.4.
Влияние подвижной фазы 201
12.5.
Особые возможности ионного обмена 203
12.6.
Практическое применение 205
12.7.
Практические приложения 207
Глава 13. Ион-парная хроматография 210
13.1.
Введение 210
13.2.
Практическая ион-парная хроматография 211
13.3.
Другие области применения 213
13.4.
Приложение: УФ-детектирование при помощи ИПА 214
Глава 14. Ионная хроматография 216
14.1.
Основы 216
14.2.
Способы подавления 216
14.3.
Элюенты 218
14.4.
Область применения 220
Глава 15. Эксклюзионная хроматография 221
15.1.
Принцип 221
15.2.
Калибровочная хроматограмма 224
15.3.
Определение молекулярной массы с помощью эксклюзионной
хроматографии 227
15.4.
Соединение нескольких колонок для эксклюзионной
хроматографии 230
15.5.
Фазовые системы 231
15.6.
Приложения 232
Глава 16. Аффинная хроматография 236
16.1.
Механизм 236
16.2.
Аффинная хроматография как частный случай ВЭЖХ 237
16.3.
Применение 239
Глава 17. Выбор метода 242
17.1.
Различные варианты и возможности 242
17.2.
Перенос методики 246
Глава 18. Проблемы разделения 249
18.1.
Проблема элюирования 249
18.2.
Градиенты 250
18.3.
Переключение колонок 255
18.4.
Комплексная двумерная ВЭЖХ 258
18.5.
Оптимизация изократического разделения с помощью четырех
растворителей 260
18.6.
Оптимизация других параметров 263
18.7.
Смешанные сорбенты 268
Глава 19. Аналитическая ВЭЖХ 270
19.1.
Качественный анализ 270
19.2.
Анализ следовых количеств вещества 272
19.3.
Количественный анализ 276
19.4.
Извлечение 281
19.5.
Определение высоты и площади пика для количественного
анализа 283
19.6.
Ошибки интегрирования 287
19.7.
Длина волны детектирования 288
19.8.
Дериватизация 290
19.9.
Неожиданные пики: пики-призраки и системные пики 292
Глава 20. Обеспечение качества 295
20.1.
Стоит ли тратить на это силы? 295
20.2.
Подтверждение вторым методом 296
20.3.
Метод валидации 296
20.4.
Стандартные операционные процедуры 298
20.5.
Погрешность измерения 299
20.6.
Аттестация, тестирование прибора и тест на пригодность
системы 300
20.7.
Задача определения качества 302
Глава 21. Препаративная ВЭЖХ 305
21.1.
Задачи 305
21.2.
Препаративная ВЭЖХ на практике 306
21.3.
Перегрузка 309
21.4.
Сбор фракций 312
21.5.
Рехроматография 313
21.6.
Вытеснительная хроматография 314
Глава 22. Разделение энантиомеров 316
22.1.
Введение 316
22.2.
Хиральные подвижные фазы 318
22.3.
Твердый носитель, покрытый хиральной жидкой неподвижной
фазой 319
22.4.
Хиральные твердые неподвижные фазы 320
22.5.
Непрямой метод разделения энантиомеров 327
Глава 23. Особые возможности 330
23.1.
Капиллярная ВЭЖХ, микро-ВЭЖХ и ВЭЖХ на чипе 330
23.2.
Высокоскоростная и сверхскоростная ВЭЖХ 333
23.3.
Экспресс-разделения при 1000 бар: УВЭЖХ 336
23.4.
ВЭЖХ со сверхкритическими подвижными фазами 337
23.5.
ВЭЖХ с перегретой водой 340
23.6.
Электрохроматография 341
Глава 24. Приложение 1: прикладная теория ВЭЖХ 343
Глава 25. Приложение 2: как провести тестирование системы 353
25.1.
Введение 353
25.2.
Порядок проведения тестирования 353
25.3.
Подготовка 354
25.4.
Тестирование насоса 357
25.5.
Тестирование УФ-детектора 361
25.6.
Тестирование автосамплера 363
25.7.
Тестирование термостата 363
25.8.
Уравнения и вычисления 364
25.9.
Протоколирование 365
Глава 26. Приложение 3: неисправности 366
26.1.
Проблемы, связанные с давлением 366
26.2.
Утечка в системе подачи подвижной фазы 368
26.3.
Изменения/отклонения времен удерживания 368
26.4.
Проблемы ввода образца 369
26.5.
Проблемы, связанные с базовой линией 370
26.6.
Проблемы, связанные с формой пика 371
26.7.
Неисправности при работе с детекторами светорассеивания 373
26.8.
Другие случаи 374
26.9.
Поверка хроматографической системы 375
Глава 27. Приложение 4: упаковка колонки 376
Указатель разделений 380
Предметный указатель 382
О группе компаний «АНАЛИТ» 395
Аттестованные и внесенные в Госреестр методики, разработанные группой
компаний «АНАЛИТ» для анализа в пищевой и технологической сферах 398
1.7.
Сравнение высокоэффективной жидкостной хроматографии
и капиллярного электрофореза 25
1.8.
Единицы измерения давления, длины и вязкости 26
1.9.
Научные журналы 27
1.10.
Рекомендованные книги 27
Глава 2. Теоретические принципы 29
2.1.
Хроматографический процесс 29
2.2.
Размывание зоны 31
2.3.
Хроматограмма и ее суть 35
2.4.
Графическое изображение пар пиков с разной степенью разрешения 41
2.5.
Факторы, влияющие на разрешение 45
2.6.
Внеколоночные объемы (мертвые объемы) 50
2.7.
Размывание заднего фронта пика 51
2.8.
Пиковая емкость и статистическая вероятность разрешения 55
2.9.
Влияние температуры на ВЭЖХ-разделение 58
2.10.
Возможности ВЭЖХ 60
2.11.
Как определить пиковую емкостью 64
Глава 3. Насосы 66
3.1.
Общие требования 66
3.2.
Короткоходовый плунжерный насос 66
3.3.
Обслуживание и ремонт 69
3.4.
Другие конструкции насосов 71
Глава 4. Подготовка оборудования к нанесению образца 72
4.1.
Выбор подвижной фазы 72
4.2.
Приготовление подвижной фазы 74
4.3.
Градиентные системы 76
4.4.
Капилляры 77
4.5.
Фитинги (соединительные муфты) 80
4.6.
Инжекторы для введения пробы 81
4.7.
Раствор образца и его объем 84
Глава 5. Свойства растворителей 87
5.1.
Таблица органических растворителей 87
5.2.
Селективность растворителя 90
5.3.
Смешиваемость 91
5.4.
Буферы 91
5.5.
Срок годности элюентов 94
5.6.
Калькулятор смесей элюентов 95
Глава 6. Детекторы 97
6.1.
Общие положения 97
6.2.
УФ-детекторы 102
6.3.
Рефрактометрические детекторы 104
6.4.
Флуоресцентные детекторы 106
6.5.
Электрохимические (амперометрические) детекторы 108
6.6.
Детекторы светорассеяния 109
6.7.
Другие детекторы 111
6.8.
Комплексное детектирование 112
6.9.
Непрямое (косвенное) детектирование 114
6.10.
Сочетание ВЭЖХ со спектроскопией 114
Глава 7. Колонки и сорбенты 121
7.1.
Колонки для ВЭЖХ 121
7.2.
Предколонки 123
7.3.
Основные свойства сорбентов 124
7.4.
Силикагель 129
7.5.
Химически модифицированные силикагели 131
7.6.
Сополимеры стирола и дивинилбензола 135
7.7.
Другие стационарные фазы 137
7.8.
Хранение и регенерация колонки 141
Глава 8. Тестирование ВЭЖХ-колонок 145
8.1.
Простое тестирование ВЭЖХ-колонок 145
8.2.
Определение размера частиц 147
8.3.
Определение времени проскока 148
8.4.
Тестовая смесь 150
8.5.
Безразмерные параметры, характеризующие колонку ВЭЖХ 152
Памяти Отто Майера
Alles ist einfacher, als man denken kann,
zugleich verschränkter, als zu begreifen ist.
Goethe, Maximen
Все проще, чем можно себе представить,
И в то же время сложнее, чем можно понять…
Гёте, Максимы и размышления
Предисловие к пятому изданию
Маленький юбилей! История этой книги началась тридцать лет назад с перво-
го немецкого издания. Никто тогда и не думал о том, что это будет успешная
история. Содержание книги омолаживается с каждым последующим изданием,
чего, увы, нельзя сказать об авторе. На самом деле, последнее — не пожелание,
а всего лишь шутка. Без сомнения, десятилетия общения с читателями пошли
книге на пользу.
Включена новая тема: глава 20 рассказывает о контроле качества. Кое-что
об этом можно прочесть в главе 19, но в настоящем издании тема освещена мак-
симально широко и независимо от главы «Аналитическая ВЭЖХ». Два раздела
в приложениях были обновлены и расширены Бруно И. Ленди, а именно раз-
дел о тестировании хроматографической системы (в нынешнем издании это
глава 25) и раздел о выявление и устранении неисправностей (теперь глава 26).
Были написаны некоторые новые разделы. В разделе 1.7 проводится сравнение
ВЭЖХ с капиллярным электрофорезом; раздел 2.11 посвящен определению пи-
ковой емкости. В разделе 8.7 рассмотрены кривые Ван-Деемтера и другие за-
висимости; в разделе 11.3 — хроматография гидрофильных взаимодействий.
В разделе 17.2 приводятся рекомендации по передаче методики; раздел 18.4 по-
священ комплексной двумерной ВЭЖХ, а раздел 23.3 — быстрым разделениям
при давлении 1000 бар. В разделе 23.5 рассмотрена ВЭЖХ с перегретой водой.
Кроме того, многое доработано и добавлено большое количество ссылок.
Рискните отправиться в полную приключений страну ВЭЖХ! Вы получите
удовлетворение, когда освоите и профессию, и ее теоретические основы.
Санкт-Галлен, июль 2009 г., Вероника Майер
Предисловие редактора перевода
Если книга выдержала пять изданий, то ее непременно нужно перевести. Так мы
и поступили с книгой Вероники Майер «Практическая высокоэффективная
жидкостная хроматография». Надо сказать, что руководств для начинающих
изучать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) издано
к сегодняшнему дню не просто много, а очень много, но книга Вероники Май-
ер подкупила нас простотой изложения и, что не менее важно, такими же про-
стыми и понятными иллюстрациями, значительно облегчающими понимание
излагаемого материала. Несомненное достоинство книги — множество практи-
ческих задач, которые автор предлагает решить начинающему хроматографисту
в ходе обучения. Безусловно, пятое издание книги отличается от первого тем,
что оно расширено за счет современных методов и оборудования. Те места в тек-
сте, где, по нашему мнению, не хватало информации о современном положении
дел в ВЭЖХ или нужны были дополнительные разъяснения, мы снабдили при-
мечаниями переводчиков и добавили ссылки на соответствующую литературу.
Пользуясь случаем, переводчики хотели бы поблагодарить И. В. Важенину
за ценные замечания и помощь при подготовке рукописи перевода к печати.
К. т. н. М. Б. Бару
Важные и полезные формулы в ВЭЖХ
(см. формулы в книге)
Это краткое изложение. Подробно уравнения обсуждаются в 2 и 8 главах.
Коэффициент удерживания:
Коэффициент селективности :
Разрешение:
Число теоретических тарелок:
Высота теоретической тарелки:
Асимметрия, уширение заднего фронта пика:
Линейная скорость подвижной фазы:
Общая пористость колонки:
Линейная скорость подвижной фазы в случае, если ɛ = 0,65 (химически при-
витая неподвижная фаза):
Время проскока в случае, если ɛ = 0,65:
Приведенная высота теоретической тарелки:
Приведенная скорость подвижной фазы:
Приведенная скорость потока в нормальной фазе (гексан, образец с малой
молекулярной массой, т. е. Dm 2,5 ∙ 103 см2/мин) в случае, если ɛ = 0,8:
Приведенная скорость потока в обращенной фазе (вода/ацетонитрил, об-
разец с малой молекулярной массой, т. е. Dm 6 ・ 104 см2/мин) в случае, если
Примечание: Оптимум скорости находится приблизительно при = 3; таким
образом, h = 3, что свидетельствует о хорошем качестве упаковки (для образца
с малой молекулярной массой и хорошими массообменными свойствами).
Приведенное сопротивление потоку:
.
Примечание: Ф = 1000 для должным образом упакованных колонок с незасо-
ренными фильтрами.
Общее время анализа:
Общий расход растворителей:
Ap — площадь пика
a0,1 — ширина передней части пика на высоте 10 % от общей высоты
b0,1 — ширина задней части пика на высоте 10 % от общей высоты
dc — внутренний диаметр колонки
Dm — коэффициент диффузии образца в подвижной фазе
dp — диаметр частиц неподвижной фазы
F — объемная скорость потока подвижной фазы
f — расстояние между фронтом пика и его максимумом на высоте 0,05h
hp — высота пика
kпос — коэффициент емкости для последнего пика
tR — время удерживания
t0 — время проскока
V — объем
w — ширина пика
w1/2 — ширина пика на его полувысоте
w0,05 — ширина пика на высоте 0,05h
η — вязкость подвижной фазы
p — перепад давления
Lc — длина колонки
ГЛАВА 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1.ВЭЖХ: Эффективный метод разделения
Эффективный метод разделения должен быть в состоянии справиться со сме-
сью, содержащей большое число похожих растворенных веществ. На рис. 1.1
приведен пример такого разделения. Восемь бензодиазепинов могут быть раз-
делены за 70 с.
Такая хроматограмма предоставляет непосредственно и качественную,
и количественную информацию: у каждого соединения в смеси свое время элю-
ции (момент, когда сигнал появляется на экране) при заданном наборе условий;
площадь и высота каждого сигнала пропорциональны количеству соответству-
ющего вещества.
Этот пример показывает, что высокоэффективная жидкостная хроматогра-
фия (ВЭЖХ) и в самом деле очень эффективна, т. е. дает превосходное разделе-
ние за короткое время. «Изобретателям» современной хроматографии, Martin
и Synge1, еще в 1941 году было известно, что теоретически неподвижная фаза
должна состоять из очень мелких частиц, и, следовательно, необходимо высо-
кое давление для прокачивания подвижной фазы через колонку. Поэтому ан-
глийское сокращение HPLC (high-performance liquid chromatography) — ВЭЖХ
(высокоэффективная жидкостная хроматография) иногда расшифровывают
как «high-pressure liquid chromatography» — ЖХВД (жидкостная хроматография
высокого давления)2.
1.2. Первый эксперимент с ВЭЖХ
Несмотря на то что описанный здесь эксперимент прост, новичкам все же луч-
ше было бы попросить помощи у опытного хроматографиста.
Удобнее всего было бы использовать систему для ВЭЖХ с двумя емкостями
для растворителей. Используйте воду и ацетонитрил. Оба растворителя надо про-
фильтровать3 (через фильтр с порами <1 мкм) и дегазировать. Промойте систему
чистым ацетонитрилом. После этого присоедините так называемую обращенно-
фазовую колонку (октадецил, ODS или С18, но можно также использовать
и октильную или С8 колонку), обращая при этом внимание на направление по-
тока (обозначено на колонке стрелкой), и промывайте ее ацетонитрилом в те-
чение примерно 10 мин. Расход растворителя зависит от диаметра колонки:
1–2 мл/мин для колонок с внутренним диаметром 4,6 мм, 0,5–1 мл/мин для 3-мм
и 0,3–0,5 мм для 2-мм колонок. Затем перейдите на смесь вода-ацетонитрилв со-
отношении 8:2 и снова промойте в течение 10–20 мин. Ультрафиолетовый де-
тектор установите на 272 нм (впрочем, 254 нм тоже подойдет). Приготовьте кофе
(только настоящий, а не без кофеина), возьмите небольшую порцию до того,
как вы добавите молоко, сахар или подсластитель, и профильтруйте (<1 мкм).
Как вариант можно использовать чай (тоже без добавок) или какой-нибудь про-
хладительный напиток с кофеином (лучше без сахара); эти напитки также надо
профильтровать. Введите 10 мкл образца. Появится хроматограмма, сходная
с изображенной на рис. 1.2. Обычно последний большой пик и есть сигнал кофе-
ина. Если он слишком высок, вводите меньше образца, и наоборот. Кроме того,
можно настроить чувствительность детектора.
Рекомендуется выбирать объем образца, который дает величину пика кофеина не больше
одной единицы поглощения (1 AU) по показаниям детектора. Если пик элюируется поздно,
скажем, позднее, чем через 10 мин, следует увеличить содержание ацетонитрила в подвижной фазе (попробуйте смесь вода-ацетонитрил в соотношении 6:4). Если же пик кофеина элюируется слишком рано и плохо разрешается с другими пиками в самом начале хроматограммы, следует уменьшить содержание ацетонитрила (например, 9:1).
Пик кофеина можно проинтегрировать и, таким образом, количественно определить
его содержание в вашем напитке. Приготовьте несколько калибровочных растворов кофеина в подвижной фазе, например в диапазоне 0,1–1,0 мг/мл, и проанализируйте их. Для количественного анализа можно использовать площади пиков или их высоты. Калибровочный график должен быть линейным и проходить через начало координат. Содержание кофеина в напитках может изменяться в широких пределах, и величина 0,53 мг/мл, показанная на рис. 1.2, всего лишь отражает вкусы автора.
После завершения работы снова промойте колонку чистым ацетонитрилом.
1.3. Виды разделений в жидкостной хроматографии
Адсорбционная хроматография
Принцип адсорбционной хроматографии (нормально-фазовой хроматографии)
известен из классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Относи-
тельно полярный материал с высокой удельной площадью поверхности исполь-
зуется как неподвижная фаза. Наиболее популярен силикагель, также часто
используются оксиды алюминия и магния. Подвижная фаза относительно не-
полярна (от гептана к тетрагидрофурану). Разная степень, с которой молекулы
различных типов, содержащиеся в смеси, адсорбируются на неподвижной фазе,
дает эффект разделения. Неполярный растворитель, такой как гексан, элюиру-
ет медленнее, чем растворитель средней полярности, например эфир.
Общее правило: полярные соединения элюируются позже, чем неполярные.
Примечание. Полярные означает водорастворимые, гидрофильные; непо-
лярные — синоним жирорастворимых, липофильных.
Обращенно-фазовая хроматография
В противоположность сказанному выше для нормально-фазовой хроматогра-
фии:
а) неподвижная фаза очень неполярная;
б) подвижная фаза относительно полярная (от воды до тетрагидрофурана);
в) полярный растворитель, такой как вода, элюирует медленнее, чем менее
полярный растворитель, такой как ацетонитрил.
Общее правило: неполярные соединения элюируются позже, чем полярные.
Хроматография на химически связанных фазах
Неподвижная (стационарная) фаза ковалентно связана со своей подложкой
с помощью химической реакции. Тщательно подбирая реагенты, можно полу-
чить огромное число стационарных фаз. Описанная выше обращенно-фазовая
хроматография представляет собой наиболее важный случай хроматографии
на химически привитой фазе.
Ионообменная хроматография
Стационарная фаза содержит ионные группы (например, NR3
+ или SO3
), кото-
рые взаимодействуют с ионными группами молекул образца. Этот метод под-
ходит для разделения аминокислот, ионных продуктов метаболизма и органи-
ческих ионов.
Ион-парная хроматография
Ион-парная хроматография также может быть использована для разделения
ионных соединений. Кроме того, она устраняет некоторые трудности, прису-
щие ионообменной хроматографии. Ионные молекулы образца «маскируются»
подходящим противоионом. Основные преимущества метода — возможность
использовать широко доступные обращенно-фазовые системы (при этом мож-
но обойтись без ионообменников) и возможен одновременный анализ кислот,
оснований и нейтральных веществ.
Ионная хроматография
Ионная хроматография была разработана как средство разделения ионов силь-
ных кислот и оснований (например, Cl, NO3
, Na+, K+). Это особый случай ионо-
обменной хроматографии, требующий, однако, другого оборудования.
Эксклюзионная хроматография
Этот вид можно подразделить на гель-проникающую хроматографию (с орга-
ническими растворителями) и гель-фильтрацию (с водными растворами).
Эксклюзионная хроматография разделяет молекулы по размеру, т. е., в со-
ответствии с молекулярной массой. Самые большие молекулы элюируются
первыми, а самые маленькие — последними. Этот метод стоит выбирать, ког-
да смесь содержит соединения с разницей молекулярных масс по крайней мере
в 10 %1.
Аффинная хроматография
В этом случае разделение обеспечивается за счет высокоспецифических биохи-
мических взаимодействий. Неподвижная фаза содержит специфические груп-
пы молекул, которые могут адсорбировать только образцы, удовлетворяющие
определенным пространственным условиям и распределению заряженных
групп (сравните с взаимодействием между антигенами и антителами). Аффин-
ная хроматография может быть использована для выделения белков (как фер-
ментов, так и структурных белков), липидов и т. д. из сложных смесей без при-
влечения больших затрат.
1.4. хроматографическая система для ВЭЖХ
Система для ВЭЖХ может представлять собой набор индивидуальных модулей
или элементов либо быть сконструированна как единый моноблок. Модуль-
ный подход более гибок в случае отказа одного из компонентов. Более того,
индивидуальные составляющие не обязательно должны быть от одного и того
же производителя. Если же вам не нравится выполнять мелкий ремонт само-
стоятельно, то вам подойдет моноблок. На рабочем столе, однако, он занимает
столько же места, как и модульная установка.
На рис. 1.3 показаны части, из которых состоит простейшая система для
ВЭЖХ: резервуар для растворителя, линия подачи элюента с входным филь-
тром, насос высокого давления, устройство ввода образца (инжектор), колонка,
детектор и устройство сбора и обработки данных. Хотя колонка является са-
мой важной частью системы, обычно она и самая маленькая ее часть. Для про-
ведения разделений при определенной температуре ее помещают в термостат.
Обычно работают более чем с одним растворителем, а значит, нужны смеси-
тель и блок управления. Если сбор данных выполняется компьютером, то его же
можно использовать и для управления всей системой.
1.5. Áåçîïàñíîñòü â õðîìàòîãðàôè÷åñêîé
ëàáîðàòîðèè
ВЭЖХ присущи три фактора, вредные для здоровья:
а) токсичные растворители;
б) раздражение дыхательных путей вследствие вдыхания неподвижной
фазы;
в) опасности, вызванные высоким давлением.
Краткосрочные и долгосрочные риски воздействия растворителей и паров
в основном известны, но им уделяют слишком мало внимания. Следует делать
во всех пластиковых крышках питающих и сливных емкостей отверстия мини-
мального размера, достаточные лишь для того, чтобы в них проходили тефлоно-
вые капилляры для заполнения или опорожнения этих емкостей. При этом ток-
сичные пары не проникают в атмосферу лаборатории и никакие загрязнения
не попадают в высокоочищенный растворитель. Всю работу с растворителями
следует выполнять только в условиях хорошей вентиляции.
То обстоятельство, что частицы размером 5 мкм и менее, используемые
в ВЭЖХ, могут попасть в легкие (они не задерживаются в бронхах и пролета-
ют насквозь), менее известно, и потенциальная долгосрочная опасность еще
должным образом не изучена. Аморфный силикагель, используемый в качестве
неподвижных фаз, сам по себе не опасен1, но тем не менее вдыхания его следу-
ет избегать. В качестве меры предосторожности любые операции, при которых
возможно распространение пыли неподвижной фазы (открывание пузырьков,
взвешивание и т. д.), следует выполнять в вытяжном шкафу.
Насос высокого давления не так уж и опасен. В противоположность газам,
жидкости почти несжимаемы (примерно 1 % объема на 100 бар). Таким обра-
зом, жидкость содержит очень мало энергии, даже в условиях высокого давле-
ния. Струя жидкости может вытечь через неисправное соединение, но при этом
отсутствует опасность взрыва. Однако эта жидкость может причинить телу
серьезный физический вред. Колонна под давлением, открытая снизу с целью
опорожнения, не должна ничем перекрываться. Настоятельно рекомендуется
к прочтению описание несчастного случая, вызванного подобного рода дей-
ствиями.
1.6. Сравнение высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии
Подобно ВЭЖХ, газовая хроматография2 (ГХ) также является высокоэффек-
тивным методом. Наиболее важное различие между этими двумя методами
состоит в том, что с помощью ГХ можно анализировать только либо летучие
соединения, либо соединения, которые устойчивы при испарении при повы-
шенной температуре, либо соединения, из которых можно надежно получать
летучие производные. Только около 20 % известных органических соединений
можно проанализировать с помощью газовой хроматографии без предваритель-
ной обработки. Для жидкостной хроматографии образец должен быть растворен
в растворителе, и, за исключением поперечно сшитых высокомолекулярных со-
единений, все органические и ионные неорганические вещества удовлетворяют
этому условию.
Сопоставление характеристик этих двух методов представлено в табл. 1.1.
По сравнению с газовой хроматографией имеются три важных отличия:
а) коэффициент диффузии образца в подвижной фазе в условиях ВЭЖХ
значительно меньше, чем в условиях ГХ (это является недостатком, поскольку
коэффициент диффузии является важнейшим фактором, определяющим ско-
рость хроматографического анализа);
б) вязкость подвижной фазы в случае ВЭЖХ выше, чем в случае ГХ (это тоже
недостаток, поскольку высокая вязкость приводит к малым коэффициентам
диффузии и высокому сопротивлению потоку подвижной фазы);
в) сжимаемость подвижной фазы под действием давления пренебрежимо
мала в случае ВЭЖХ, чего нельзя сказать о ГХ (это является преимуществом
ВЭЖХ, потому что вследствие этого скорость потока подвижной фазы постоян-
на по всей длине колонки. Следовательно, если скорость потока выбрана верно,
то оптимальные условия для хроматографического разделения наблюдаются
по всей длине колонки. Более того, ввиду несжимаемости жидкость под высо-
ким давлением не опасна).
1.7.Сравнение высокоэффективной жидкостной хроматографии
и капиллярного электрофореза
Капиллярный электрофорез1 (также называемый капиллярным зонным элек-
трофорезом, КЗЭ) подходит для электрически заряженных анализируемых ве-
ществ и разделяет их, попросту говоря, в соответствии с отношением их заряда
к размеру. К тому же форма молекулы является еще одним фактором, влияю-
щим на скорость миграции, что делает возможным разделение изомеров, а так-
же анализируемых веществ с одинаковым удельным зарядом. Катионы (поло-
жительно заряженные молекулы) движутся быстрее, чем анионы (отрицательно
заряженные молекулы), и появляются в детекторе раньше. Маленькие много-
зарядные катионы являются самыми быстрыми частицами, в то время как ма-
ленькие многозарядные анионы — самыми медленными.
Разделение происходит под действием высокого напряжения. Между конца-
ми разделяющего капилляра прикладывают электрическое поле напряжением
до 30 кВ. Как следствие, буферный раствор в капилляре движется в сторону от-
рицательно заряженного катода. Капилляры имеют длину 20–100 см и внутрен-
ний диаметр 50–250 мкм. В противоположность ВЭЖХ-колонкам они не упако-
ваны неподвижной фазой в «хроматографическом» понимании этого процесса,
но в некоторых случаях заполнены гелем, который делает возможным разделе-
ние веществ по размеру их молекул (как и в эксклюзионной хроматографии).
Эффективность разделения может быть на несколько порядков выше, чем
в ВЭЖХ (до 107 теоретических тарелок), делая капиллярный электрофорез ис-
ключительно ценным методом для пептидного картирования или секвенирова-
ния ДНК. Впрочем, можно разделять и малые молекулы, такие как аминокислоты
или неорганические ионы. Из-за малого объема капилляра можно ввести лишь
небольшое абсолютное количество образца. Главным недостатком, по сравнению
с количественной ВЭЖХ, является более низкая воспроизводимость (точность).
Кроме того, невозможно выполнение препаративных разделений.
Электрохроматография (см. раздел 23.6) является гибридом ВЭЖХ и КЭ.
Для этого метода капилляры упаковывают неподвижной фазой, а разделение
основывается на явлении распределения. Подвижная фаза действует как при
капиллярном электрофорезе; она состоит из буферного раствора и движется
благодаря приложенному электрическому полю.
1.8. Единицы измерения давления, длины и вязкости
Единицы измерения давления
Обычной единицей измерения давления в ВЭЖХ является бар, но в единицах
СИ — паскаль (Па). 1 Па = 1 Н/м2. Атмосферы (Атм или ат) использовать более
не следует. Американская единица psi (фунт на квадратный дюйм) использует-
ся по-прежнему. Обратите внимание на разницу между psia = psi (абсолютное)
и psig = psi gauge (по манометру). Последняя величина означает избыточное дав-
ление по сравнению с атмосферным.
1 бар = 105 Па = 105 кг · м1 · с2 = 0,987 атм = 1,02 ат = 14,5 psi
Пересчет:
1 МПа = 10 бар (мегапаскаль)
1 бар = 1,013 бар (физическая атмосфера)
1 ат = 0,981 бар (техническая атмосфера, 1 кгс/см2)
1 psi = 0,0689 бар
Общее правило:
1000 psi 70 бар, 100 бар = 1450 psi.
Единицы длины
Для обозначения диаметров трубопроводов или капилляров в ВЭЖХ исполь-
зуется английская мера длины дюйм (in или "). Меньшие единицы выражают
не десятыми долями, а 1/2, 1/4, 1/8 или 1/16 либо кратными им величинами.
Внешние диаметры:
1" = 25,40 мм 1/2" = 12,70 мм 3/8" = 9,525 мм 1/4" = 6,35 мм
3/16" = 4,76 мм 1/8" = 3,175 мм 1/16" = 1,59 мм
Внутренние диаметры капилляров:
0,04" = 1,0 мм 0,02" = 0,51 мм 0,01" = 0,25 мм 0,007" = 0,18 мм
Единицы вязкости
Единица СИ для динамической вязкости — паскаль на секунду:
1 Па · с = 1 кг · м1 · с1.
Вязкости растворителей составляют около 1 ∙ 103 Па · с = 1 мПа · с. Ранее ис-
пользовалась единица сантипуаз: 1 мПа · с = 1 сП.
1.9. Научные журналы
Journal of Chromatography A (все вопросы хроматографии) ISSN 0021-9673.
Journal of Chromatography B (биомедицинские науки и приложения) ISSN 1570-0232.
До тома 651 (1993) это был один журнал, в котором некоторые тома были
посвящены биомедицинским приложениям. После 1993 г. журнал был разделен
и продолжал выпускаться в виде раздельных томов, имеющих одинаковые но-
мера, но разные буквы (например, 652A и 652B). Elsevier Science, P.O. Box211, NL-
1000AE Amsterdam, The Netherlands.
Journal of Chromatographic Science, ISSN 0021-9665, Preston Publications, 6600 W.
Touhy Avenue, Niles, IL 60714-4588, USA.
Chromatographia, ISSN 0009-5893, Vieweg Publishing, P.O. Box 5829, D-65048, Wiesbaden,
Germany.
Journal of Separation Science (до 2001 г. Journal of High Resolution Chromatography),
ISSN 1615-9306, Wiley-VCH, P.O. Box 10 11 61, D-69451 Weinheim, Germany.
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, ISSN 1082-6076, Marcel
Dekker, 270 Madison Avenue, New York, NY 10016-0602, USA.
LC GC Europe (бесплатно в Европе, ранее назывался LC GC International), ISSN
1471-6577, Advanstar Communications, Advanstar House, ParkWest, Sealand Road,
Chester CH1 4RN, UK.
LC GC North America (бесплатно в США, ранее назывался LC GC Magazine), ISSN
0888-9090, Advanstar Communications, 859 Willamette Street, Eugene, OR, 97401,
USA.
LC GC Asia Pacifi c (бесплатно в Азиатско-Тихоокеанском регионе), Advanstar
Communications, 101 Pacifi c Plaza, 1/F, 410 Des Voeux Road West, Hong Kong,
People’s Republic of China.
Biomedical Chromatography, ISSN 0269-3879, John Wiley & Sons, Ltd, 1 Oldlands Way,
Bognor Regis PO22 9SA, UK.
International Journal of Bio-Chromatography, ISSN 1068-0659, Gordon and Breach, P.O.
Box 32160, Newark, NJ 07102, USA.
Separation Science and Technology, ISSN 0149-6395, Taylor & Francis, Mortimer House,
37–41 Mortimer Street, London, W1T 3JH, UK.
Chromatography Abstracts, ISSN 0268-6287, Royal Society of Chemistry, Thomas Graham
House, Cambridge CB4 0WF, UK.
The Journal of Microcolumn Separations (John Wiley & Sons, Ltd, ISSN 1040-7865) был
объединен с Тhe Journal of Separation Science после номера 8 том 13 (2001).
1.10. Рекомендованные книги
J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Aster, Chester, 1989.
M. W. Dong, Modern HPLC for Practicing Scientists, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester,
2006.
N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London,
2nd ed., 1998.
S. Kromidas, ed., HPLC Made to Measure, Wiley-VCH, Weinheim, 2006.
H. J. Kuss and S. Kromidas, Quantifi cation in LC and GC, Wiley-VCH, Weinheim,
2009.
V. R. Meyer, Pitfalls and Errors of HPLC in Pictures, Wiley-VCH, Weinheim, 2nd ed.,
2006.
S. C. Moldoveanu and V. David, Sample Preparation in Chromatography, Elsevier, Amsterdam,
2002.
U. D. Neue, HPLC Columns — Theory, Technology, and Practice, John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1997.
H. Posch and B. Trathnigg, HPLC of Polymers, Springer, Berlin, Heidelberg, 1998.
P. C. Sadek, Troubleshooting LC Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
L. R. Snyder, J. J. Kirkland, and J. W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography,
John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 3rd ed., 2010.
L. R. Snyder and J. W. Dolan, High-Performance Gradient Elution, Wiley-Interscience,
Hoboken, 2007.
L. R. Snyder, J. J. Kirkland and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, Wiley-
Interscience, New York, 2nd ed., 1997.
Основные учебники по хроматографии
E. Heftmann, ed., Chromatography, Part A: Fundamentals and Techniques, Part B:
Applications, Elsevier, Amsterdam, 6th ed., 2004.
J. M. Miller, Chromatography — Concepts and Contrasts, John Wiley & Sons, Ltd,
Chichester, 2nd ed., 2009.
C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2002.
K. Robards, P. E. Jackson and P. R. Haddad, Principles and Practice of Modern
Chromatographic Methods, Academic, London, San Diego, 1995.
ГЛАВА 2
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ
2.1. Хроматографический процесс
Определение
Хроматография — это процесс разделения, в ходе которого смесь образца рас-
пределяется между двумя фазами в хроматографическом слое (колонке или
на пластине). Одна из фаз является неподвижной, в то время как другая про-
текает сквозь этот хроматографический слой. В качестве неподвижной фазы
используют твердые, пористые, поверхностно-активные частицы либо тон-
кую пленку жидкости, нанесенную на твердую подложку или стенку колонки.
Подвижной фазой может быть газ или жидкость. Если в разделении применяют
газ, то процесс называется газовой хроматографией. Во всех остальных видах
хроматографии, включая тонкослойную хроматографию, всегда используется
жидкость.
Эксперимент: разделение тестовых красителей
«Классическую» хроматографическую колонку длиной 20 см с краном (или сте-
клянную трубку диаметром 2 см с сужающимся нижним концом, снабженным
капилляром с зажимом) наполняют суспензией силикагеля в толуоле. После
оседания силикагеля в колонке с помощью шприца наносят на сорбент пример-
но 50–100 мкл раствора красителя (например, тестовая смесь красителей II N,
произведенная фирмой Camag, Муттенц, Швейцария) и элюируют толуолом.
Наблюдения
Разные красители перемещаются по колонке с разной скоростью. Различают
шесть зон: жирный красный 7В, желтый судан, черный судан (два компонента),
жирный оранжевый и артизил синий 2RP. Вещества, проявляющие сродство
к элюенту, перемещаются по колонке быстрее по сравнению с веществами, род-
ственными сорбенту.
Преимущественное нахождение вещества в одной из фаз можно выразить
коэффициентом распределения K:
Kх =Снепод/Спод,
молей X в элюенте. Очевидно, что сорбент и элюент должны находиться в тес-
ном контакте друг с другом, чтобы обеспечить равномерное распределение.
Вещества, которые должны быть разделены, должны иметь разные коэффи-
циенты распределения и, следовательно, различные коэффициенты удержива-
ния в хроматографической системе.
Графическое изображение процесса разделения
а) На колонке разделяют смесь двух веществ, ▲ и (рис. 2.1а).
б) Вещество ▲ проявляет большее сродство к сорбенту, а вещество —
к подвижной фазе (рис. 2.1б). Здесь k▲ = 5/2 = 2,5 и k = 2/5 = 0,4.
в) Новое равновесие наступает по мере поступления свежего элюента:
молекулы образца в подвижной фазе частично адсорбируются в соот-
ветствии с их коэффициентами распределения на поверхности непод-
вижной фазы. Между тем, как молекулы, которые до этого были адсор-
бированы, вновь возвращаются в поток элюента (рис. 2.1в)
г) В результате многократного повторения процесса адсорбции-десорбции
происходит разделение двух веществ. Вещество ●, проявляющее срод-
ство к элюенту, перемещается по колонке быстрее по сравнению с веще-
ством ▲, которое склонно «застревать» на сорбенте (рис. 2.1г).
На рис. 2.1 видно, что вдоль зоны, соответствующей 3½ диаметра частиц
сорбента, установилось новое равновесное состояние. Это расстояние называ-
ется теоретической тарелкой. Чем больше слой сорбента в колонке, тем больше
теоретических тарелок в ней содержится, а значит, выше степень разделения
смеси. Этот эффект частично нивелируется размыванием зоны. Эксперименты
показали: чем больше пройденное расстояние в колонке и длительнее время
удерживания, тем сильнее размывается зона вещества.
2.2. Размывание зоны
Существует множество причин размывания зон. Важно их понимать, чтобы
само явление свести к минимуму и в результате колонка сохранила бы как мож-
но большее число теоретических тарелок.
Первая причина: турбулентная диффузия
Колонки упаковывают мелкозернистым сорбентом. Когда элюент проходит
между частицами сорбента, он переносит молекулы образца (рис. 2.2). Некото-
рые из них «счастливчики» — они покидают колонку быстрее всех, так как тра-
ектория их движения в ней в первом приближении напоминает прямую линию.
Другие молекулы элюируются позднее, поскольку
Вторая причина: распределение потока
Поток элюента, проходящий между частицами сорбента, ламинарный (рис. 2.3).
Скорость потока в каналах между частицами сорбента в середине выше, чем
в приповерхностной области. На рис. 2.3 стрелками указана скорость подвиж-
ной фазы (чем длиннее стрелка, тем выше скорость потока). Турбулентную
диффузию и распределение потока можно снизить, упаковав колонку сорбен-
том с одинаковым размером частиц.
Первое правило эффективной колонки основывается на том, что колонка
должна быть упакована сорбентом узкого фракционного состава. Соотношение
диаметров самых крупных и самых мелких частиц не должно превышать 2,0,
а еще лучше 1,5 (например, диаметр самых маленьких частиц 5,0 мкм, а самых
больших — 7,5 мкм).
Размывание, вызванное турбулентной диффузией и распределением пото-
ка, мало зависит, если вообще зависит, от скорости подвижной фазы.
Третья причина: диффузия молекул образца в подвижной фазе
Молекулы образца распространяются в растворителе без внешнего воздействия
(так же как кусок сахара растворяется в воде даже без перемешивания). Это про-
исходит из-за продольной диффузии (рис. 2.4), которая отрицательно влияет
на высоту теоретической тарелки в случае, если:
а) размер частиц сорбента мал;
б) слишком низкая скорость элюента по отношению к диаметру частиц;
в) относительно большой коэффициент диффузии образца,
и все это одновременно имеет место в хроматографической системе.
Второе правило — скорость элюента рекомендуется выбирать таким об-
разом, чтобы продольная диффузия не оказывала отрицательного влияния.
Это происходит, когда u > 2Dm/dp, где u — линейная скорость потока элюента,
Dm — коэффициент диффузии образца в подвижной фазе, dp — диаметр частиц
сорбента. Более подробно этот материал изложен в разделе 8.5.
Четвертая причина: массоперенос между подвижной,
«застойной» и неподвижной фазами
На рис. 2.5 изображена структура частицы неподвижной фазы, в которой встре-
чаются узкие и широкие каналы. Некоторые из них проходят сквозь всю части-
цу, а некоторые не имеют выхода.
Поры заполнены элюентом, который не двигается в них (застаивается). Мо-
лекула образца, попадая в пору1, не переносится потоком растворителя, и из-
менить свое положение она может только благодаря диффузии. При этом суще-
ствует два варианта событий.
а) Обратная диффузия молекулы в поток подвижной фазы. Этот про-
цесс требует времени, в течение которого молекулы, не удерживаемые
в порах, передвигаются чуть дальше. Чем короче поры (т. е. меньше ча-
стицы сорбента), тем ýже полоса вещества на выходе из колонки. Кроме
того, скорость диффузии молекул вещества в растворитель обратно про-
порциональна вязкости среды, т. е. в менее вязком растворителе молеку-
лы быстрее диффундируют внутрь пор и из них.
б) Молекула взаимодействует непосредственно с самой неподвижной фа-
зой (адсорбентом или жидкой пленкой) и адсорбируется. Она на неко-
торое время «залипает» на неподвижной фазе, а затем снова проникает
внутрь «застойной» фазы. В этом случае процесс массообмена отличает-
ся длительностью (рис. 2.6).
В обоих случаях размывание зоны вещества увеличивается с ростом скоро-
сти элюента: молекулы образца, не адсорбировавшиеся на неподвижной фазе,
смещаются дальше от молекул, попавших в поры. Чем выше скорость потока,
тем сильнее происходит размывание зоны, но затрачиваемое время на элюцию
вещества уменьшается.
Третье правило: в качестве неподвижной фазы рекомендуется использовать
мелкие частицы или частицы с тонким пористым поверхностным слоем.
Четвертое правило: рекомендуется работать с менее вязкими растворите-
лями.
Пятое правило: чем выше скорость анализа, тем хуже разрешение, и наоборот.
Однако это правило применимо для крупных, а не для мелкозернистых сор-
бентов.
Высота теоретической тарелки H зависит от скорости потока подвижной
фазы u (рис. 2.7)1. При этом кривую H/u называют кривой Ван-Деемтера. Зна-
чение оптимальной скорости потока uopt зависит от свойств анализируемого ве-
щества.
2.3. Хроматограмма и ее суть
Вещества, перемещаясь по колонке с потоком элюента, попадают в детектор,
который регистрирует их в виде Гауссовой (в форме колокола) кривой1. Сигналы
называют пиками (рис. 2.8), а совокупность всех пиков образца представляет
собой хроматограмму.
Из хроматограммы можно получить качественную и количественную ин-
формацию о пробе.
а) Качественная информация. В одних и тех же хроматографических усло-
виях время удерживания вещества постоянно. Время удерживания —
это промежуток времени между вводом образца и регистрацией макси-
мального значения сигнала. Такие параметры, как геометрия колонки,
тип сорбента, состав подвижной фазы, скорость потока, масса пробы
и температура, составляют хроматографические условия. Следователь-
но, идентифицировать тот или иной пик можно, проанализировав соот-
ветствующий образец и сравнив времена удерживания.
б) Количественная информация. Площадь, так же как и высота пика, про-
порциональна массе анализируемого вещества. Для построения кали-
бровочного графика необходимы площади и высота пиков, полученных
во время анализа разных растворов с точно известной концентрацией.
По этому графику можно определить концентрацию вещества в раство-
ре, сравнив размеры пиков.
По хроматограмме можно оценить эффективность разделения (рис. 2.9).
Здесь w — ширина пика на уровне базовой линии1, t0 — мертвое время, или
время выхода неудерживаемых веществ, т. е. время, за которое элюент проходит
весь объем колонки (также называемое время проскока). Значит, линейную ско-
рость потока u можно определить по уравнению:
u=L/т0,
где L — длина колонки. Неудерживаемые вещества, т. е. те, которые не удержива-
лись на стационарной фазе, регистрируются на хроматограмме при t0. tR — время
удерживания2 — промежуток времени между вводом образца и значением мак-
симальной интенсивности пика. Два вещества можно разделить в том случае,
если у них разные времена удерживания. tR — фактическое время удерживания,
или приведенное время удерживания. На рис. 2.9 показано, что tR = t0 + tR. Значе-
ние t0 одинаково для всех элюируемых веществ. Оно говорит лишь о времени
пребывания подвижной фазы в колонке. tR — это время удерживания вещества
неподвижной фазой, у каждого анализируемого соединения эта величина своя
Чем дольше вещество задерживается на неподвижной фазе, тем позже оно элю-
ируется.
Время удерживания зависит от скорости потока и длины колонки. Если ско-
рость подвижной фазы низкая или колонка слишком длинная, то t0, а следова-
тельно, и tR будет большим. Для описания характеристик вещества параметр tR
не годится.
Поэтому предпочитают использовать коэффициент удерживания, или зна-
чение k (ранее известный как коэффициент емкости k):
см. уравнение в тексте
Alles ist einfacher, als man denken kann,
zugleich verschränkter, als zu begreifen ist.
Goethe, Maximen
Все проще, чем можно себе представить,
И в то же время сложнее, чем можно понять…
Гёте, Максимы и размышления
Предисловие к пятому изданию
Маленький юбилей! История этой книги началась тридцать лет назад с перво-
го немецкого издания. Никто тогда и не думал о том, что это будет успешная
история. Содержание книги омолаживается с каждым последующим изданием,
чего, увы, нельзя сказать об авторе. На самом деле, последнее — не пожелание,
а всего лишь шутка. Без сомнения, десятилетия общения с читателями пошли
книге на пользу.
Включена новая тема: глава 20 рассказывает о контроле качества. Кое-что
об этом можно прочесть в главе 19, но в настоящем издании тема освещена мак-
симально широко и независимо от главы «Аналитическая ВЭЖХ». Два раздела
в приложениях были обновлены и расширены Бруно И. Ленди, а именно раз-
дел о тестировании хроматографической системы (в нынешнем издании это
глава 25) и раздел о выявление и устранении неисправностей (теперь глава 26).
Были написаны некоторые новые разделы. В разделе 1.7 проводится сравнение
ВЭЖХ с капиллярным электрофорезом; раздел 2.11 посвящен определению пи-
ковой емкости. В разделе 8.7 рассмотрены кривые Ван-Деемтера и другие за-
висимости; в разделе 11.3 — хроматография гидрофильных взаимодействий.
В разделе 17.2 приводятся рекомендации по передаче методики; раздел 18.4 по-
священ комплексной двумерной ВЭЖХ, а раздел 23.3 — быстрым разделениям
при давлении 1000 бар. В разделе 23.5 рассмотрена ВЭЖХ с перегретой водой.
Кроме того, многое доработано и добавлено большое количество ссылок.
Рискните отправиться в полную приключений страну ВЭЖХ! Вы получите
удовлетворение, когда освоите и профессию, и ее теоретические основы.
Санкт-Галлен, июль 2009 г., Вероника Майер
Предисловие редактора перевода
Если книга выдержала пять изданий, то ее непременно нужно перевести. Так мы
и поступили с книгой Вероники Майер «Практическая высокоэффективная
жидкостная хроматография». Надо сказать, что руководств для начинающих
изучать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) издано
к сегодняшнему дню не просто много, а очень много, но книга Вероники Май-
ер подкупила нас простотой изложения и, что не менее важно, такими же про-
стыми и понятными иллюстрациями, значительно облегчающими понимание
излагаемого материала. Несомненное достоинство книги — множество практи-
ческих задач, которые автор предлагает решить начинающему хроматографисту
в ходе обучения. Безусловно, пятое издание книги отличается от первого тем,
что оно расширено за счет современных методов и оборудования. Те места в тек-
сте, где, по нашему мнению, не хватало информации о современном положении
дел в ВЭЖХ или нужны были дополнительные разъяснения, мы снабдили при-
мечаниями переводчиков и добавили ссылки на соответствующую литературу.
Пользуясь случаем, переводчики хотели бы поблагодарить И. В. Важенину
за ценные замечания и помощь при подготовке рукописи перевода к печати.
К. т. н. М. Б. Бару
Важные и полезные формулы в ВЭЖХ
(см. формулы в книге)
Это краткое изложение. Подробно уравнения обсуждаются в 2 и 8 главах.
Коэффициент удерживания:
Коэффициент селективности :
Разрешение:
Число теоретических тарелок:
Высота теоретической тарелки:
Асимметрия, уширение заднего фронта пика:
Линейная скорость подвижной фазы:
Общая пористость колонки:
Линейная скорость подвижной фазы в случае, если ɛ = 0,65 (химически при-
витая неподвижная фаза):
Время проскока в случае, если ɛ = 0,65:
Приведенная высота теоретической тарелки:
Приведенная скорость подвижной фазы:
Приведенная скорость потока в нормальной фазе (гексан, образец с малой
молекулярной массой, т. е. Dm 2,5 ∙ 103 см2/мин) в случае, если ɛ = 0,8:
Приведенная скорость потока в обращенной фазе (вода/ацетонитрил, об-
разец с малой молекулярной массой, т. е. Dm 6 ・ 104 см2/мин) в случае, если
Примечание: Оптимум скорости находится приблизительно при = 3; таким
образом, h = 3, что свидетельствует о хорошем качестве упаковки (для образца
с малой молекулярной массой и хорошими массообменными свойствами).
Приведенное сопротивление потоку:
.
Примечание: Ф = 1000 для должным образом упакованных колонок с незасо-
ренными фильтрами.
Общее время анализа:
Общий расход растворителей:
Ap — площадь пика
a0,1 — ширина передней части пика на высоте 10 % от общей высоты
b0,1 — ширина задней части пика на высоте 10 % от общей высоты
dc — внутренний диаметр колонки
Dm — коэффициент диффузии образца в подвижной фазе
dp — диаметр частиц неподвижной фазы
F — объемная скорость потока подвижной фазы
f — расстояние между фронтом пика и его максимумом на высоте 0,05h
hp — высота пика
kпос — коэффициент емкости для последнего пика
tR — время удерживания
t0 — время проскока
V — объем
w — ширина пика
w1/2 — ширина пика на его полувысоте
w0,05 — ширина пика на высоте 0,05h
η — вязкость подвижной фазы
p — перепад давления
Lc — длина колонки
ГЛАВА 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1.ВЭЖХ: Эффективный метод разделения
Эффективный метод разделения должен быть в состоянии справиться со сме-
сью, содержащей большое число похожих растворенных веществ. На рис. 1.1
приведен пример такого разделения. Восемь бензодиазепинов могут быть раз-
делены за 70 с.
Такая хроматограмма предоставляет непосредственно и качественную,
и количественную информацию: у каждого соединения в смеси свое время элю-
ции (момент, когда сигнал появляется на экране) при заданном наборе условий;
площадь и высота каждого сигнала пропорциональны количеству соответству-
ющего вещества.
Этот пример показывает, что высокоэффективная жидкостная хроматогра-
фия (ВЭЖХ) и в самом деле очень эффективна, т. е. дает превосходное разделе-
ние за короткое время. «Изобретателям» современной хроматографии, Martin
и Synge1, еще в 1941 году было известно, что теоретически неподвижная фаза
должна состоять из очень мелких частиц, и, следовательно, необходимо высо-
кое давление для прокачивания подвижной фазы через колонку. Поэтому ан-
глийское сокращение HPLC (high-performance liquid chromatography) — ВЭЖХ
(высокоэффективная жидкостная хроматография) иногда расшифровывают
как «high-pressure liquid chromatography» — ЖХВД (жидкостная хроматография
высокого давления)2.
1.2. Первый эксперимент с ВЭЖХ
Несмотря на то что описанный здесь эксперимент прост, новичкам все же луч-
ше было бы попросить помощи у опытного хроматографиста.
Удобнее всего было бы использовать систему для ВЭЖХ с двумя емкостями
для растворителей. Используйте воду и ацетонитрил. Оба растворителя надо про-
фильтровать3 (через фильтр с порами <1 мкм) и дегазировать. Промойте систему
чистым ацетонитрилом. После этого присоедините так называемую обращенно-
фазовую колонку (октадецил, ODS или С18, но можно также использовать
и октильную или С8 колонку), обращая при этом внимание на направление по-
тока (обозначено на колонке стрелкой), и промывайте ее ацетонитрилом в те-
чение примерно 10 мин. Расход растворителя зависит от диаметра колонки:
1–2 мл/мин для колонок с внутренним диаметром 4,6 мм, 0,5–1 мл/мин для 3-мм
и 0,3–0,5 мм для 2-мм колонок. Затем перейдите на смесь вода-ацетонитрилв со-
отношении 8:2 и снова промойте в течение 10–20 мин. Ультрафиолетовый де-
тектор установите на 272 нм (впрочем, 254 нм тоже подойдет). Приготовьте кофе
(только настоящий, а не без кофеина), возьмите небольшую порцию до того,
как вы добавите молоко, сахар или подсластитель, и профильтруйте (<1 мкм).
Как вариант можно использовать чай (тоже без добавок) или какой-нибудь про-
хладительный напиток с кофеином (лучше без сахара); эти напитки также надо
профильтровать. Введите 10 мкл образца. Появится хроматограмма, сходная
с изображенной на рис. 1.2. Обычно последний большой пик и есть сигнал кофе-
ина. Если он слишком высок, вводите меньше образца, и наоборот. Кроме того,
можно настроить чувствительность детектора.
Рекомендуется выбирать объем образца, который дает величину пика кофеина не больше
одной единицы поглощения (1 AU) по показаниям детектора. Если пик элюируется поздно,
скажем, позднее, чем через 10 мин, следует увеличить содержание ацетонитрила в подвижной фазе (попробуйте смесь вода-ацетонитрил в соотношении 6:4). Если же пик кофеина элюируется слишком рано и плохо разрешается с другими пиками в самом начале хроматограммы, следует уменьшить содержание ацетонитрила (например, 9:1).
Пик кофеина можно проинтегрировать и, таким образом, количественно определить
его содержание в вашем напитке. Приготовьте несколько калибровочных растворов кофеина в подвижной фазе, например в диапазоне 0,1–1,0 мг/мл, и проанализируйте их. Для количественного анализа можно использовать площади пиков или их высоты. Калибровочный график должен быть линейным и проходить через начало координат. Содержание кофеина в напитках может изменяться в широких пределах, и величина 0,53 мг/мл, показанная на рис. 1.2, всего лишь отражает вкусы автора.
После завершения работы снова промойте колонку чистым ацетонитрилом.
1.3. Виды разделений в жидкостной хроматографии
Адсорбционная хроматография
Принцип адсорбционной хроматографии (нормально-фазовой хроматографии)
известен из классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Относи-
тельно полярный материал с высокой удельной площадью поверхности исполь-
зуется как неподвижная фаза. Наиболее популярен силикагель, также часто
используются оксиды алюминия и магния. Подвижная фаза относительно не-
полярна (от гептана к тетрагидрофурану). Разная степень, с которой молекулы
различных типов, содержащиеся в смеси, адсорбируются на неподвижной фазе,
дает эффект разделения. Неполярный растворитель, такой как гексан, элюиру-
ет медленнее, чем растворитель средней полярности, например эфир.
Общее правило: полярные соединения элюируются позже, чем неполярные.
Примечание. Полярные означает водорастворимые, гидрофильные; непо-
лярные — синоним жирорастворимых, липофильных.
Обращенно-фазовая хроматография
В противоположность сказанному выше для нормально-фазовой хроматогра-
фии:
а) неподвижная фаза очень неполярная;
б) подвижная фаза относительно полярная (от воды до тетрагидрофурана);
в) полярный растворитель, такой как вода, элюирует медленнее, чем менее
полярный растворитель, такой как ацетонитрил.
Общее правило: неполярные соединения элюируются позже, чем полярные.
Хроматография на химически связанных фазах
Неподвижная (стационарная) фаза ковалентно связана со своей подложкой
с помощью химической реакции. Тщательно подбирая реагенты, можно полу-
чить огромное число стационарных фаз. Описанная выше обращенно-фазовая
хроматография представляет собой наиболее важный случай хроматографии
на химически привитой фазе.
Ионообменная хроматография
Стационарная фаза содержит ионные группы (например, NR3
+ или SO3
), кото-
рые взаимодействуют с ионными группами молекул образца. Этот метод под-
ходит для разделения аминокислот, ионных продуктов метаболизма и органи-
ческих ионов.
Ион-парная хроматография
Ион-парная хроматография также может быть использована для разделения
ионных соединений. Кроме того, она устраняет некоторые трудности, прису-
щие ионообменной хроматографии. Ионные молекулы образца «маскируются»
подходящим противоионом. Основные преимущества метода — возможность
использовать широко доступные обращенно-фазовые системы (при этом мож-
но обойтись без ионообменников) и возможен одновременный анализ кислот,
оснований и нейтральных веществ.
Ионная хроматография
Ионная хроматография была разработана как средство разделения ионов силь-
ных кислот и оснований (например, Cl, NO3
, Na+, K+). Это особый случай ионо-
обменной хроматографии, требующий, однако, другого оборудования.
Эксклюзионная хроматография
Этот вид можно подразделить на гель-проникающую хроматографию (с орга-
ническими растворителями) и гель-фильтрацию (с водными растворами).
Эксклюзионная хроматография разделяет молекулы по размеру, т. е., в со-
ответствии с молекулярной массой. Самые большие молекулы элюируются
первыми, а самые маленькие — последними. Этот метод стоит выбирать, ког-
да смесь содержит соединения с разницей молекулярных масс по крайней мере
в 10 %1.
Аффинная хроматография
В этом случае разделение обеспечивается за счет высокоспецифических биохи-
мических взаимодействий. Неподвижная фаза содержит специфические груп-
пы молекул, которые могут адсорбировать только образцы, удовлетворяющие
определенным пространственным условиям и распределению заряженных
групп (сравните с взаимодействием между антигенами и антителами). Аффин-
ная хроматография может быть использована для выделения белков (как фер-
ментов, так и структурных белков), липидов и т. д. из сложных смесей без при-
влечения больших затрат.
1.4. хроматографическая система для ВЭЖХ
Система для ВЭЖХ может представлять собой набор индивидуальных модулей
или элементов либо быть сконструированна как единый моноблок. Модуль-
ный подход более гибок в случае отказа одного из компонентов. Более того,
индивидуальные составляющие не обязательно должны быть от одного и того
же производителя. Если же вам не нравится выполнять мелкий ремонт само-
стоятельно, то вам подойдет моноблок. На рабочем столе, однако, он занимает
столько же места, как и модульная установка.
На рис. 1.3 показаны части, из которых состоит простейшая система для
ВЭЖХ: резервуар для растворителя, линия подачи элюента с входным филь-
тром, насос высокого давления, устройство ввода образца (инжектор), колонка,
детектор и устройство сбора и обработки данных. Хотя колонка является са-
мой важной частью системы, обычно она и самая маленькая ее часть. Для про-
ведения разделений при определенной температуре ее помещают в термостат.
Обычно работают более чем с одним растворителем, а значит, нужны смеси-
тель и блок управления. Если сбор данных выполняется компьютером, то его же
можно использовать и для управления всей системой.
1.5. Áåçîïàñíîñòü â õðîìàòîãðàôè÷åñêîé
ëàáîðàòîðèè
ВЭЖХ присущи три фактора, вредные для здоровья:
а) токсичные растворители;
б) раздражение дыхательных путей вследствие вдыхания неподвижной
фазы;
в) опасности, вызванные высоким давлением.
Краткосрочные и долгосрочные риски воздействия растворителей и паров
в основном известны, но им уделяют слишком мало внимания. Следует делать
во всех пластиковых крышках питающих и сливных емкостей отверстия мини-
мального размера, достаточные лишь для того, чтобы в них проходили тефлоно-
вые капилляры для заполнения или опорожнения этих емкостей. При этом ток-
сичные пары не проникают в атмосферу лаборатории и никакие загрязнения
не попадают в высокоочищенный растворитель. Всю работу с растворителями
следует выполнять только в условиях хорошей вентиляции.
То обстоятельство, что частицы размером 5 мкм и менее, используемые
в ВЭЖХ, могут попасть в легкие (они не задерживаются в бронхах и пролета-
ют насквозь), менее известно, и потенциальная долгосрочная опасность еще
должным образом не изучена. Аморфный силикагель, используемый в качестве
неподвижных фаз, сам по себе не опасен1, но тем не менее вдыхания его следу-
ет избегать. В качестве меры предосторожности любые операции, при которых
возможно распространение пыли неподвижной фазы (открывание пузырьков,
взвешивание и т. д.), следует выполнять в вытяжном шкафу.
Насос высокого давления не так уж и опасен. В противоположность газам,
жидкости почти несжимаемы (примерно 1 % объема на 100 бар). Таким обра-
зом, жидкость содержит очень мало энергии, даже в условиях высокого давле-
ния. Струя жидкости может вытечь через неисправное соединение, но при этом
отсутствует опасность взрыва. Однако эта жидкость может причинить телу
серьезный физический вред. Колонна под давлением, открытая снизу с целью
опорожнения, не должна ничем перекрываться. Настоятельно рекомендуется
к прочтению описание несчастного случая, вызванного подобного рода дей-
ствиями.
1.6. Сравнение высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии
Подобно ВЭЖХ, газовая хроматография2 (ГХ) также является высокоэффек-
тивным методом. Наиболее важное различие между этими двумя методами
состоит в том, что с помощью ГХ можно анализировать только либо летучие
соединения, либо соединения, которые устойчивы при испарении при повы-
шенной температуре, либо соединения, из которых можно надежно получать
летучие производные. Только около 20 % известных органических соединений
можно проанализировать с помощью газовой хроматографии без предваритель-
ной обработки. Для жидкостной хроматографии образец должен быть растворен
в растворителе, и, за исключением поперечно сшитых высокомолекулярных со-
единений, все органические и ионные неорганические вещества удовлетворяют
этому условию.
Сопоставление характеристик этих двух методов представлено в табл. 1.1.
По сравнению с газовой хроматографией имеются три важных отличия:
а) коэффициент диффузии образца в подвижной фазе в условиях ВЭЖХ
значительно меньше, чем в условиях ГХ (это является недостатком, поскольку
коэффициент диффузии является важнейшим фактором, определяющим ско-
рость хроматографического анализа);
б) вязкость подвижной фазы в случае ВЭЖХ выше, чем в случае ГХ (это тоже
недостаток, поскольку высокая вязкость приводит к малым коэффициентам
диффузии и высокому сопротивлению потоку подвижной фазы);
в) сжимаемость подвижной фазы под действием давления пренебрежимо
мала в случае ВЭЖХ, чего нельзя сказать о ГХ (это является преимуществом
ВЭЖХ, потому что вследствие этого скорость потока подвижной фазы постоян-
на по всей длине колонки. Следовательно, если скорость потока выбрана верно,
то оптимальные условия для хроматографического разделения наблюдаются
по всей длине колонки. Более того, ввиду несжимаемости жидкость под высо-
ким давлением не опасна).
1.7.Сравнение высокоэффективной жидкостной хроматографии
и капиллярного электрофореза
Капиллярный электрофорез1 (также называемый капиллярным зонным элек-
трофорезом, КЗЭ) подходит для электрически заряженных анализируемых ве-
ществ и разделяет их, попросту говоря, в соответствии с отношением их заряда
к размеру. К тому же форма молекулы является еще одним фактором, влияю-
щим на скорость миграции, что делает возможным разделение изомеров, а так-
же анализируемых веществ с одинаковым удельным зарядом. Катионы (поло-
жительно заряженные молекулы) движутся быстрее, чем анионы (отрицательно
заряженные молекулы), и появляются в детекторе раньше. Маленькие много-
зарядные катионы являются самыми быстрыми частицами, в то время как ма-
ленькие многозарядные анионы — самыми медленными.
Разделение происходит под действием высокого напряжения. Между конца-
ми разделяющего капилляра прикладывают электрическое поле напряжением
до 30 кВ. Как следствие, буферный раствор в капилляре движется в сторону от-
рицательно заряженного катода. Капилляры имеют длину 20–100 см и внутрен-
ний диаметр 50–250 мкм. В противоположность ВЭЖХ-колонкам они не упако-
ваны неподвижной фазой в «хроматографическом» понимании этого процесса,
но в некоторых случаях заполнены гелем, который делает возможным разделе-
ние веществ по размеру их молекул (как и в эксклюзионной хроматографии).
Эффективность разделения может быть на несколько порядков выше, чем
в ВЭЖХ (до 107 теоретических тарелок), делая капиллярный электрофорез ис-
ключительно ценным методом для пептидного картирования или секвенирова-
ния ДНК. Впрочем, можно разделять и малые молекулы, такие как аминокислоты
или неорганические ионы. Из-за малого объема капилляра можно ввести лишь
небольшое абсолютное количество образца. Главным недостатком, по сравнению
с количественной ВЭЖХ, является более низкая воспроизводимость (точность).
Кроме того, невозможно выполнение препаративных разделений.
Электрохроматография (см. раздел 23.6) является гибридом ВЭЖХ и КЭ.
Для этого метода капилляры упаковывают неподвижной фазой, а разделение
основывается на явлении распределения. Подвижная фаза действует как при
капиллярном электрофорезе; она состоит из буферного раствора и движется
благодаря приложенному электрическому полю.
1.8. Единицы измерения давления, длины и вязкости
Единицы измерения давления
Обычной единицей измерения давления в ВЭЖХ является бар, но в единицах
СИ — паскаль (Па). 1 Па = 1 Н/м2. Атмосферы (Атм или ат) использовать более
не следует. Американская единица psi (фунт на квадратный дюйм) использует-
ся по-прежнему. Обратите внимание на разницу между psia = psi (абсолютное)
и psig = psi gauge (по манометру). Последняя величина означает избыточное дав-
ление по сравнению с атмосферным.
1 бар = 105 Па = 105 кг · м1 · с2 = 0,987 атм = 1,02 ат = 14,5 psi
Пересчет:
1 МПа = 10 бар (мегапаскаль)
1 бар = 1,013 бар (физическая атмосфера)
1 ат = 0,981 бар (техническая атмосфера, 1 кгс/см2)
1 psi = 0,0689 бар
Общее правило:
1000 psi 70 бар, 100 бар = 1450 psi.
Единицы длины
Для обозначения диаметров трубопроводов или капилляров в ВЭЖХ исполь-
зуется английская мера длины дюйм (in или "). Меньшие единицы выражают
не десятыми долями, а 1/2, 1/4, 1/8 или 1/16 либо кратными им величинами.
Внешние диаметры:
1" = 25,40 мм 1/2" = 12,70 мм 3/8" = 9,525 мм 1/4" = 6,35 мм
3/16" = 4,76 мм 1/8" = 3,175 мм 1/16" = 1,59 мм
Внутренние диаметры капилляров:
0,04" = 1,0 мм 0,02" = 0,51 мм 0,01" = 0,25 мм 0,007" = 0,18 мм
Единицы вязкости
Единица СИ для динамической вязкости — паскаль на секунду:
1 Па · с = 1 кг · м1 · с1.
Вязкости растворителей составляют около 1 ∙ 103 Па · с = 1 мПа · с. Ранее ис-
пользовалась единица сантипуаз: 1 мПа · с = 1 сП.
1.9. Научные журналы
Journal of Chromatography A (все вопросы хроматографии) ISSN 0021-9673.
Journal of Chromatography B (биомедицинские науки и приложения) ISSN 1570-0232.
До тома 651 (1993) это был один журнал, в котором некоторые тома были
посвящены биомедицинским приложениям. После 1993 г. журнал был разделен
и продолжал выпускаться в виде раздельных томов, имеющих одинаковые но-
мера, но разные буквы (например, 652A и 652B). Elsevier Science, P.O. Box211, NL-
1000AE Amsterdam, The Netherlands.
Journal of Chromatographic Science, ISSN 0021-9665, Preston Publications, 6600 W.
Touhy Avenue, Niles, IL 60714-4588, USA.
Chromatographia, ISSN 0009-5893, Vieweg Publishing, P.O. Box 5829, D-65048, Wiesbaden,
Germany.
Journal of Separation Science (до 2001 г. Journal of High Resolution Chromatography),
ISSN 1615-9306, Wiley-VCH, P.O. Box 10 11 61, D-69451 Weinheim, Germany.
Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, ISSN 1082-6076, Marcel
Dekker, 270 Madison Avenue, New York, NY 10016-0602, USA.
LC GC Europe (бесплатно в Европе, ранее назывался LC GC International), ISSN
1471-6577, Advanstar Communications, Advanstar House, ParkWest, Sealand Road,
Chester CH1 4RN, UK.
LC GC North America (бесплатно в США, ранее назывался LC GC Magazine), ISSN
0888-9090, Advanstar Communications, 859 Willamette Street, Eugene, OR, 97401,
USA.
LC GC Asia Pacifi c (бесплатно в Азиатско-Тихоокеанском регионе), Advanstar
Communications, 101 Pacifi c Plaza, 1/F, 410 Des Voeux Road West, Hong Kong,
People’s Republic of China.
Biomedical Chromatography, ISSN 0269-3879, John Wiley & Sons, Ltd, 1 Oldlands Way,
Bognor Regis PO22 9SA, UK.
International Journal of Bio-Chromatography, ISSN 1068-0659, Gordon and Breach, P.O.
Box 32160, Newark, NJ 07102, USA.
Separation Science and Technology, ISSN 0149-6395, Taylor & Francis, Mortimer House,
37–41 Mortimer Street, London, W1T 3JH, UK.
Chromatography Abstracts, ISSN 0268-6287, Royal Society of Chemistry, Thomas Graham
House, Cambridge CB4 0WF, UK.
The Journal of Microcolumn Separations (John Wiley & Sons, Ltd, ISSN 1040-7865) был
объединен с Тhe Journal of Separation Science после номера 8 том 13 (2001).
1.10. Рекомендованные книги
J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Aster, Chester, 1989.
M. W. Dong, Modern HPLC for Practicing Scientists, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester,
2006.
N. Dyson, Chromatographic Integration Methods, Royal Society of Chemistry, London,
2nd ed., 1998.
S. Kromidas, ed., HPLC Made to Measure, Wiley-VCH, Weinheim, 2006.
H. J. Kuss and S. Kromidas, Quantifi cation in LC and GC, Wiley-VCH, Weinheim,
2009.
V. R. Meyer, Pitfalls and Errors of HPLC in Pictures, Wiley-VCH, Weinheim, 2nd ed.,
2006.
S. C. Moldoveanu and V. David, Sample Preparation in Chromatography, Elsevier, Amsterdam,
2002.
U. D. Neue, HPLC Columns — Theory, Technology, and Practice, John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1997.
H. Posch and B. Trathnigg, HPLC of Polymers, Springer, Berlin, Heidelberg, 1998.
P. C. Sadek, Troubleshooting LC Systems, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
L. R. Snyder, J. J. Kirkland, and J. W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography,
John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 3rd ed., 2010.
L. R. Snyder and J. W. Dolan, High-Performance Gradient Elution, Wiley-Interscience,
Hoboken, 2007.
L. R. Snyder, J. J. Kirkland and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, Wiley-
Interscience, New York, 2nd ed., 1997.
Основные учебники по хроматографии
E. Heftmann, ed., Chromatography, Part A: Fundamentals and Techniques, Part B:
Applications, Elsevier, Amsterdam, 6th ed., 2004.
J. M. Miller, Chromatography — Concepts and Contrasts, John Wiley & Sons, Ltd,
Chichester, 2nd ed., 2009.
C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2002.
K. Robards, P. E. Jackson and P. R. Haddad, Principles and Practice of Modern
Chromatographic Methods, Academic, London, San Diego, 1995.
ГЛАВА 2
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ
2.1. Хроматографический процесс
Определение
Хроматография — это процесс разделения, в ходе которого смесь образца рас-
пределяется между двумя фазами в хроматографическом слое (колонке или
на пластине). Одна из фаз является неподвижной, в то время как другая про-
текает сквозь этот хроматографический слой. В качестве неподвижной фазы
используют твердые, пористые, поверхностно-активные частицы либо тон-
кую пленку жидкости, нанесенную на твердую подложку или стенку колонки.
Подвижной фазой может быть газ или жидкость. Если в разделении применяют
газ, то процесс называется газовой хроматографией. Во всех остальных видах
хроматографии, включая тонкослойную хроматографию, всегда используется
жидкость.
Эксперимент: разделение тестовых красителей
«Классическую» хроматографическую колонку длиной 20 см с краном (или сте-
клянную трубку диаметром 2 см с сужающимся нижним концом, снабженным
капилляром с зажимом) наполняют суспензией силикагеля в толуоле. После
оседания силикагеля в колонке с помощью шприца наносят на сорбент пример-
но 50–100 мкл раствора красителя (например, тестовая смесь красителей II N,
произведенная фирмой Camag, Муттенц, Швейцария) и элюируют толуолом.
Наблюдения
Разные красители перемещаются по колонке с разной скоростью. Различают
шесть зон: жирный красный 7В, желтый судан, черный судан (два компонента),
жирный оранжевый и артизил синий 2RP. Вещества, проявляющие сродство
к элюенту, перемещаются по колонке быстрее по сравнению с веществами, род-
ственными сорбенту.
Преимущественное нахождение вещества в одной из фаз можно выразить
коэффициентом распределения K:
Kх =Снепод/Спод,
молей X в элюенте. Очевидно, что сорбент и элюент должны находиться в тес-
ном контакте друг с другом, чтобы обеспечить равномерное распределение.
Вещества, которые должны быть разделены, должны иметь разные коэффи-
циенты распределения и, следовательно, различные коэффициенты удержива-
ния в хроматографической системе.
Графическое изображение процесса разделения
а) На колонке разделяют смесь двух веществ, ▲ и (рис. 2.1а).
б) Вещество ▲ проявляет большее сродство к сорбенту, а вещество —
к подвижной фазе (рис. 2.1б). Здесь k▲ = 5/2 = 2,5 и k = 2/5 = 0,4.
в) Новое равновесие наступает по мере поступления свежего элюента:
молекулы образца в подвижной фазе частично адсорбируются в соот-
ветствии с их коэффициентами распределения на поверхности непод-
вижной фазы. Между тем, как молекулы, которые до этого были адсор-
бированы, вновь возвращаются в поток элюента (рис. 2.1в)
г) В результате многократного повторения процесса адсорбции-десорбции
происходит разделение двух веществ. Вещество ●, проявляющее срод-
ство к элюенту, перемещается по колонке быстрее по сравнению с веще-
ством ▲, которое склонно «застревать» на сорбенте (рис. 2.1г).
На рис. 2.1 видно, что вдоль зоны, соответствующей 3½ диаметра частиц
сорбента, установилось новое равновесное состояние. Это расстояние называ-
ется теоретической тарелкой. Чем больше слой сорбента в колонке, тем больше
теоретических тарелок в ней содержится, а значит, выше степень разделения
смеси. Этот эффект частично нивелируется размыванием зоны. Эксперименты
показали: чем больше пройденное расстояние в колонке и длительнее время
удерживания, тем сильнее размывается зона вещества.
2.2. Размывание зоны
Существует множество причин размывания зон. Важно их понимать, чтобы
само явление свести к минимуму и в результате колонка сохранила бы как мож-
но большее число теоретических тарелок.
Первая причина: турбулентная диффузия
Колонки упаковывают мелкозернистым сорбентом. Когда элюент проходит
между частицами сорбента, он переносит молекулы образца (рис. 2.2). Некото-
рые из них «счастливчики» — они покидают колонку быстрее всех, так как тра-
ектория их движения в ней в первом приближении напоминает прямую линию.
Другие молекулы элюируются позднее, поскольку
Вторая причина: распределение потока
Поток элюента, проходящий между частицами сорбента, ламинарный (рис. 2.3).
Скорость потока в каналах между частицами сорбента в середине выше, чем
в приповерхностной области. На рис. 2.3 стрелками указана скорость подвиж-
ной фазы (чем длиннее стрелка, тем выше скорость потока). Турбулентную
диффузию и распределение потока можно снизить, упаковав колонку сорбен-
том с одинаковым размером частиц.
Первое правило эффективной колонки основывается на том, что колонка
должна быть упакована сорбентом узкого фракционного состава. Соотношение
диаметров самых крупных и самых мелких частиц не должно превышать 2,0,
а еще лучше 1,5 (например, диаметр самых маленьких частиц 5,0 мкм, а самых
больших — 7,5 мкм).
Размывание, вызванное турбулентной диффузией и распределением пото-
ка, мало зависит, если вообще зависит, от скорости подвижной фазы.
Третья причина: диффузия молекул образца в подвижной фазе
Молекулы образца распространяются в растворителе без внешнего воздействия
(так же как кусок сахара растворяется в воде даже без перемешивания). Это про-
исходит из-за продольной диффузии (рис. 2.4), которая отрицательно влияет
на высоту теоретической тарелки в случае, если:
а) размер частиц сорбента мал;
б) слишком низкая скорость элюента по отношению к диаметру частиц;
в) относительно большой коэффициент диффузии образца,
и все это одновременно имеет место в хроматографической системе.
Второе правило — скорость элюента рекомендуется выбирать таким об-
разом, чтобы продольная диффузия не оказывала отрицательного влияния.
Это происходит, когда u > 2Dm/dp, где u — линейная скорость потока элюента,
Dm — коэффициент диффузии образца в подвижной фазе, dp — диаметр частиц
сорбента. Более подробно этот материал изложен в разделе 8.5.
Четвертая причина: массоперенос между подвижной,
«застойной» и неподвижной фазами
На рис. 2.5 изображена структура частицы неподвижной фазы, в которой встре-
чаются узкие и широкие каналы. Некоторые из них проходят сквозь всю части-
цу, а некоторые не имеют выхода.
Поры заполнены элюентом, который не двигается в них (застаивается). Мо-
лекула образца, попадая в пору1, не переносится потоком растворителя, и из-
менить свое положение она может только благодаря диффузии. При этом суще-
ствует два варианта событий.
а) Обратная диффузия молекулы в поток подвижной фазы. Этот про-
цесс требует времени, в течение которого молекулы, не удерживаемые
в порах, передвигаются чуть дальше. Чем короче поры (т. е. меньше ча-
стицы сорбента), тем ýже полоса вещества на выходе из колонки. Кроме
того, скорость диффузии молекул вещества в растворитель обратно про-
порциональна вязкости среды, т. е. в менее вязком растворителе молеку-
лы быстрее диффундируют внутрь пор и из них.
б) Молекула взаимодействует непосредственно с самой неподвижной фа-
зой (адсорбентом или жидкой пленкой) и адсорбируется. Она на неко-
торое время «залипает» на неподвижной фазе, а затем снова проникает
внутрь «застойной» фазы. В этом случае процесс массообмена отличает-
ся длительностью (рис. 2.6).
В обоих случаях размывание зоны вещества увеличивается с ростом скоро-
сти элюента: молекулы образца, не адсорбировавшиеся на неподвижной фазе,
смещаются дальше от молекул, попавших в поры. Чем выше скорость потока,
тем сильнее происходит размывание зоны, но затрачиваемое время на элюцию
вещества уменьшается.
Третье правило: в качестве неподвижной фазы рекомендуется использовать
мелкие частицы или частицы с тонким пористым поверхностным слоем.
Четвертое правило: рекомендуется работать с менее вязкими растворите-
лями.
Пятое правило: чем выше скорость анализа, тем хуже разрешение, и наоборот.
Однако это правило применимо для крупных, а не для мелкозернистых сор-
бентов.
Высота теоретической тарелки H зависит от скорости потока подвижной
фазы u (рис. 2.7)1. При этом кривую H/u называют кривой Ван-Деемтера. Зна-
чение оптимальной скорости потока uopt зависит от свойств анализируемого ве-
щества.
2.3. Хроматограмма и ее суть
Вещества, перемещаясь по колонке с потоком элюента, попадают в детектор,
который регистрирует их в виде Гауссовой (в форме колокола) кривой1. Сигналы
называют пиками (рис. 2.8), а совокупность всех пиков образца представляет
собой хроматограмму.
Из хроматограммы можно получить качественную и количественную ин-
формацию о пробе.
а) Качественная информация. В одних и тех же хроматографических усло-
виях время удерживания вещества постоянно. Время удерживания —
это промежуток времени между вводом образца и регистрацией макси-
мального значения сигнала. Такие параметры, как геометрия колонки,
тип сорбента, состав подвижной фазы, скорость потока, масса пробы
и температура, составляют хроматографические условия. Следователь-
но, идентифицировать тот или иной пик можно, проанализировав соот-
ветствующий образец и сравнив времена удерживания.
б) Количественная информация. Площадь, так же как и высота пика, про-
порциональна массе анализируемого вещества. Для построения кали-
бровочного графика необходимы площади и высота пиков, полученных
во время анализа разных растворов с точно известной концентрацией.
По этому графику можно определить концентрацию вещества в раство-
ре, сравнив размеры пиков.
По хроматограмме можно оценить эффективность разделения (рис. 2.9).
Здесь w — ширина пика на уровне базовой линии1, t0 — мертвое время, или
время выхода неудерживаемых веществ, т. е. время, за которое элюент проходит
весь объем колонки (также называемое время проскока). Значит, линейную ско-
рость потока u можно определить по уравнению:
u=L/т0,
где L — длина колонки. Неудерживаемые вещества, т. е. те, которые не удержива-
лись на стационарной фазе, регистрируются на хроматограмме при t0. tR — время
удерживания2 — промежуток времени между вводом образца и значением мак-
симальной интенсивности пика. Два вещества можно разделить в том случае,
если у них разные времена удерживания. tR — фактическое время удерживания,
или приведенное время удерживания. На рис. 2.9 показано, что tR = t0 + tR. Значе-
ние t0 одинаково для всех элюируемых веществ. Оно говорит лишь о времени
пребывания подвижной фазы в колонке. tR — это время удерживания вещества
неподвижной фазой, у каждого анализируемого соединения эта величина своя
Чем дольше вещество задерживается на неподвижной фазе, тем позже оно элю-
ируется.
Время удерживания зависит от скорости потока и длины колонки. Если ско-
рость подвижной фазы низкая или колонка слишком длинная, то t0, а следова-
тельно, и tR будет большим. Для описания характеристик вещества параметр tR
не годится.
Поэтому предпочитают использовать коэффициент удерживания, или зна-
чение k (ранее известный как коэффициент емкости k):
см. уравнение в тексте