eng
Содержание
Содержание
Авторы 5
Введение 7
Глава 1. Сравнительный анализ сканирующей зондовой микроскопии
с другими существующими методами исследования 8
Глава 2. Идея возникновения сканирующей зондовой нанотомографии 14
2.1.
Техническое описание СЗНТ (ИНТЕГРА Томо) 15
2.2.
Исследование структуры смеси полимеров ABS/ПА6
(акрилонитрил-бутадиен-стирол/полиамид 6) 24
2.3.
Исследование хитиновой структуры антенных сенсилл
Placodea и Coeloconica паразитической осы Cotesia glomerata 26
2.4.
Исследование структуры цианобактерии Synechococcus 27
2.5.
Исследование трехмерной структуры биодеградируемого
клеточного матрикса из поли--оксибутирата 29
2.6.
Сравнительный анализ трехмерной наноструктуры
пористых биодеградируемых матриксов из рекомбинантного
спидроина и фиброина шелка при комнатной температуре 30
2.7.
Исследования изолированных эукариотических клеток
(кардиомиоцитов и фибробластов) с помощью методики СЗНТ 38
Глава 3. Расширение модификации СЗНТ — криоСЗНТ 45
3.1.
Техническое описание и работа криоСЗНТ 45
3.1.1.
Система проведения ультрасрезов при СЗНТ
в криогенных условиях 48
3.1.2.
Система сканирования 49
3.1.3.
Измерительный модуль СЗМ 52
3.1.4.
Блок микропроцессорного управления 54
3.1.5.
Последовательные этапы работы аппаратного комплекса
при выполнении криоСЗНТ 55
3.2.
Особенности проведения сканирующей зондовой
микроскопии для гидратированных сред 59
3.3.
Исследование микро- и наноструктуры тканеспецифического
мелкодисперсного альгинатного матрикса с помощью
сканирующей зондовой крионанотомографии 61
3.4.
Исследования макроносителя из фиброина шелка
с добавлением гидроксиапатита 80
Содержание
3.5.
Исследования пористых макроносителей на основе
регенерированного шелка, модифицированных
микрочастицами децеллюляризованного внеклеточного
матрикса печени крысы 85
3.6.
Исследования пористых макроносителей на основе
регенерированного шелка, витализированных клетками
гепатомы HepG2 человека 86
Глава 4. Особенности патентования составных высокотехнологичных
комплексов в составе микротом — сканирующий зондовый микроскоп 93
4.1.
Выявление отличительных признаков и технических
эффектов сопряженных устройств 99
4.2.
Особенности патентования комплектующих для составных
высокотехнологичных комплексов 106
4.3.
Развитие стратегии доминирующего патента 121
Заключение 125
Список сокращений 127
Список литературы 128
Приложение 1 136
Приложение 2 147
Приложение 3 161
Приложение 4 168
Авторы
Ольга Игоревна Агапова — кандидат биологических наук, научный
сотрудник лаборатории бионанотехнологий ФГБУ «ФНЦ транс-
плантологии и искусственных органов имени акад. В. И. Шумакова»
Минздрава России, специалист по трехмерному структурному ана-
лизу биополимеров, клеток и тканей.
Антон Евгеньевич Ефимов — кандидат физико-математических
наук, ведущий научный сотрудник лаборатории бионанотехноло-
гий ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов име-
ни акад. В. И. Шумакова» Минздрава России, генеральный директор
ООО «СНОТРА», специалист в области разработок приборных ком-
плексов для сканирующей зондовой нанотомографии и методик ис-
следований наноструктуры различных материалов, автор более 30
изобретений и научных работ.
Дмитрий Юрьевич Соколов — главный конструктор ООО «СНОТРА»,
специалист по разработкам криогенных и вакуумных СЗМ систем,
а также по патентованию разработок в области высоких и нанотехно-
логий, автор более 70 изобретений, монографий и научных работ.
Игорь Иванович Агапов — доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией бионанотехнологий ФГБУ «ФНЦ транс-
плантологии и искусственных органов имени акад. В. И. Шумакова»
Минздрава России, специалист по молекулярной биологии, регене-
ративной медицине, автор более 150 научных работ и изобретений.
Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных ор-
ганов им. академика В. И. Шумакова — крупнейшее научно-практи-
ческое учреждение, выполняющее фундаментальные и прикладные
исследования в области трансплантологии и искусственных органов.
ООО «СНОТРА» — малое инновационное предприятие, резидент Фон-
да «Сколково» в кластере Ядерных технологий, специализирующееся
в области разработок и коммерциализации аппаратно-методических
комплексов для сканирующей зондовой нанотомографии.
Agapova O.I., Efimov A.E., Sokolov D.Yu., Agapov I.I.
Scanning Probe Nanotomography
Annotation: The book is dedicated to the modern method of investigation
of three-dimensional micro- and nanostructures — scanning probe nanotomography
(SPNT), which is based on the combination of scanning probe
microscopy and ultramicrotomy. This method was developed in Academician
V. I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artifi -
cial Organs of Ministry of Healthcare of Russian Federation and SNOTRA
LLC. innovation company (Skolkovo Foundation resident in Cluster of Nuclear
Technologies). In this book authors analyze advantages and disadvantages
of SPNT technique in comparison with other methods of ultrastructure
analysis, present results of studies of three-dimensional structure of various
biomaterials and biological objects. Key technical solutions and patenting
specifi cities of developed integrated devices for SPNT and cryoSPNT are
discussed. The book is intended for specialists in the fi elds of nanotechnology,
high-resolution microscopy, structural biology, polymer chemistry, material
science and other specialities.
Authors
Agapova Olga Igorevna — PhD in Biology, researcher of Laboratory of Bionanotechnology,
Academician V. I. Shumakov Federal Research Center of
Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry of Healthcare of Russian
Federation.
Efimov Anton Evgenievich — PhD in Physics and Mathematics, leading scientist
of Laboratory of Bionanotechnology, Academician V. I. Shumakov
Federal Research Center of Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry
of Healthcare of Russian Federation, general director of SNOTRA LLC.
Sokolov Dmitry Yurievich — Chief designer of SNOTRA LLC.
Agapov Igor Ivanovich — Doctor of Science in Biology, professor, head of
Laboratory of Bionanotechnology, Academician V. I. Shumakov Federal Research
Center of Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry of Healthcare
of Russian Federation
Введение
В современном мире мультипараметрический наномасштабный
анализ трехмерной структуры объектов как природного, так и ис-
кусственного происхождения является весьма актуальным. В самых
различных областях, будь то биология, медицина, фармацевтика или
химия, изучение материалов, веществ и комплексных конструкций
на наномолекулярном уровне имеет важное значение.
В биологии исследование объектов живой природы на молеку-
лярном и наноуровне позволяет значительно лучше понять природу
и механизмы процессов, протекающих в организмах, дает возмож-
ность увидеть наномасштабное строение отдельных частей объектов
и их структуру. Приоритетным является изучение биологических
объектов в их нативной форме, т. е. максимально приближенной
к тому состоянию, в котором они находятся в природе. В связи с этим
важны разработка и поиск технологий, позволяющих проводить ис-
следования с минимальными изменениями природной структуры,
в любом ее состоянии, будь то твердое, жидкое или гелеобразное.
В медицине приборы и методики с такими характеристиками делают
возможным создание новых биологических материалов и биоинже-
нерных конструкций для заместительной и регенеративной медици-
ны. Благодаря таким разработкам могут создаваться максимально
эффективные лекарственные препараты, обладающие четко направ-
ленным действием и вводимые в организм безоперационными, инъ-
екционными путями, с минимальными повреждениями целостно-
сти тканей. В области химии, смежных и связанных с ней областей
понимание строения наноструктуры веществ помогает в разработке
уникальных материалов, которым можно задавать необходимые фи-
зические, механические и химические свойства для различного рода
и вида изделий.
ГЛАВА 1
Сравнительный анализ сканирующей зондовой микроскопии
с другими существующими методами исследования
Для микроскопических исследований конструкций из полимерных
материалов с витализированными клетками, биодеградируемых
клеточных носителей, гидратированных гелевых биоматериалов не-
обходимо сохранять их нативную структуру на уровне отдельных
макромолекул как во время измерений, так и в процессе подготовки
объекта.
Методы просвечивающей электронной микроскопии и электрон-
ной томографии [1], [2], [3], [4], [5] и их сочетание с корреляционны-
ми оптическими методиками [6], [7], [8] имеют как свои достоинства
и преимущества, так и недостатки, например высокая стоимость
оборудования, трудоемкость работы [9], [10], а также ограничения,
связанные с физическими принципами измерений и формировани-
ем контраста в этих методах. Кроме того, электронная микроскопия
дает возможность восстанавливать трехмерную структуру объекта
при срезах не более 300 нм, что ограничивает возможности исследо-
вания, например, клеточных носителей.
Объединение техники сканирующей электронной микроскопии
(СЭМ) и травления поверхности фокусированным ионным пуч-
ком (ФИП) является одним из наиболее перспективных методов.
Восстановление трехмерной структуры осуществляется с помощью
последовательных СЭМ-изображений поверхности, которые полу-
чаются после стравливания слоев материала ионным потоком с по-
верхности объекта. Метод эффективен при работе с большим коли-
чеством материалов и объектов [11], [12], но воздействие электронных
и ионных пучков, а также вакуумные условия могут оказывать струк-
турные изменения, например, в биологических образцах, что являет-
ся недостатком при исследовании [13].
Для изучения полимеров, клеточных носителей, биоматериалов
на микроуровне [14], [15], [16] широко применяется рентгеновская то-
мография, однако она не позволяет получать на такого рода объектах
разрешение в десятки нм; кроме того, для получения максимального
разрешения с использованием данного метода размер образца не дол-
жен превосходить 1 мкм [17], [18].
Такие ограничения рентгеновской и электронной томографии
весьма неудобны при анализе биологических и полимерных мате-
риалов из легких химических элементов. Избежать подобных огра-
ничений возможно с помощью методов сканирующей зондовой
микроскопии (СЗМ). Такой анализ структуры поверхности позво-
ляет осуществлять исследование с наноразрешением [19], [20], при
этом не разрушая образец химической фиксацией и не нанося по-
вреждения электронным пучком, а также помогает избежать слабо-
го электронно-микроскопического контраста [21], [22]. Кроме того,
СЗМ позволяет анализировать поверхность несколькими методика-
ми: изображение фазы, распределение электрической проводимости
[23], [24], метод измерения силовых кривых, магнитная [25] или элек-
тростатическая силовая микроскопия, химическая силовая микро-
скопия [26], [27].
Принцип сканирующей зондовой нанотомографии заключает-
ся в серии последовательных измерений поверхности образца после
удаления сверхтонких поверхностных слоев материала, после кото-
рых выполняется воссоздание трехмерного томографического изо-
бражения путем объединения серий двухмерных СЗМ-изображений.
Существует несколько способов удаления верхних слоев образца:
плазменное или химическое травление, механическое удаление с ис-
пользованием жесткого зонда СЗМ, срез ультрамикротомом.
Впервые томографическая трехмерная реконструкция на осно-
ве последовательных измерений СЗМ была сделана при помощи
плазменного травления [28], а также защищена патентами [29], [30].
Плазменное травление производилось ex situ, что предполагало пере-
мещение образца из СЗМ в установку для травления и обратно с даль-
нейшей локализацией области исследования с точностью до десятков
нм, что является недостатком данной методики. Спустя некоторое
время, благодаря усовершенствованию методики и установки, стало
возможно осуществить химическое [31] или плазменное травление
поверхности образца, оставляя его в установке СЗМ. Такая методи-
ка использовалась при изучении трехмерных структур полимерных
композитов, а также кости человека [32], [33].
На рис. 1.1 показан пример трехмерной реконструкции микро-
доменной структуры три-блок-сополимера поли-(стирен-блок-
бутадиен-блок-стирена), полученной при помощи последовательных
СЗМ-измерений и плазменного травления поверхности [28].
толщиной 7,5 нм 13 раз стравливались с поверхности. Комби-
нация информации о топографии и фазовом контрасте поверхности
из серии полученных 14 СЗМ-изображений позволила реконструи-
ровать домены в объеме 200 Х 160 Х 45 нм3. Трехмерная реконструкция
изображений фазового контраста может быть интерпретирована как
трехмерная организация цилиндрических полистреновых доменов
в стирен-бутадиен-стиреновой матрице. Недостатком этого метода
является то, что плазменное травление производилось ex situ, что,
в свою очередь, требовало перемещения образца из СЗМ в установку
для травления и обратно и последующей локализации области изме-
рений с точностью до десятков нм.
Недостатком удаления верхних слоев образца плазменным трав-
лением при низком давлении является отличие скорости травления
различных компонентов или фаз в сложных гетерогенных, гибрид-
ных полимерных системах, что ведет к ошибке определения верти-
кального положения зон поверхности при реконструкции. В связи
с этим такая методика не подходит для исследования микро- и на-
нопористых биоматериалов.
Другая методика предполагает последовательное удаление тон-
ких слоев поверхности образца зондом СЗМ и дальнейшими изме-
рениями поверхности. В работе проводящий алмазный зонд, леги-
рованный бором, использовался как для удаления слоев, так и для
измерений структуры из многостенных углеродных нанотрубок в ма-
трице из оксида кремния [34]. Результат трехмерной реконструкции
локальной проводимости нанотрубок представлен на рис. 1.2.
Такой подход осуществим на стандартной установке СЗМ, но не
подходит для мягких полимерных и биополимерных материалов,
а также для микро- и нанопористых материалов.
На данный момент существуют и другие устройства и методики,
позволяющие изучать микроструктуру объектов, измеряя и визуа-
лизируя полученные данные о внутренней морфологии образца как
в двухмерных, так и трехмерных изображениях, например микро-
компьютерная томография (МКТ) [35], предназначенная для того,
чтобы дополнить сканирующую электронную микроскопию благо-
даря трехмерной микроскопии. МКТ позволяет получать информа-
цию о внутренней микроструктуре объекта, при этом не разрушая
структуру и не требуя дополнительной подготовки образца, внутрен-
няя морфология исследуется в двухмерном и трехмерных режимах,
а получаемые реалистичные модели могут использоваться для вирту-
ального изучения объекта. Визуализация при МКТ может осущест-
вляться в виде трех ортогональных сечений, а также срез за срезом,
что делает данное устройство схожим по качеству получаемых ре-
зультатов с ультрамикротомом. Однако МКТ не позволяет исследо-
вать объекты в жидком состоянии или состоянии геля, что возможно
при использовании криоультрамикротомии, а также не дает воз-
можности оценить взаимосвязанность нанопор, что играет важную
роль при использовании исследуемых материалов в регенеративной
медицине.
Также одной из методик, используемых для локального анали-
за материалов, является ФИП (фокусируемый ионный пучок) [12].
Принцип его работы схож с электронным микроскопом, разница
в том, что в ФИП используется ионный пучок. Еще одно отличие со-
стоит в том, что метод ФИП разрушает образец путем вырывания ато-
мов объекта при ударе ионов галлия о его поверхность. А за счет того,
что в процессе обработки происходит проникновение атомов гелия
в толщу образца на несколько нанометров, поверхность образца при-
обретает аморфное состояние. Одним из преимуществ этого метода
является очень тонкая обработка поверхности образца, т. е. толщина
удаленного верхнего слоя может равняться размеру атома, при этом
следующий слой не затрагивается. ФИП можно использовать для
контролируемого травления, так как положение ионного пучка, раз-
мер и время воздействия хорошо регулируются. При использовании
данной методики возможно травление до нанометрового масштаба.
В этом ФИП имеет преимущество перед нашим методом, так как тол-
щина слоя, подвергающегося травлению, составляет не менее 2 нм,
в то время как толщина среза криоультрамикротомом больше 10 нм.
Кроме того, при СЗНТ можно исследовать лишь те виды материа-
лов, которые пригодны для резки алмазным ножом, в то время как
ФИП можно использовать практически для любого вида материалов,
пригодного для ионного фрезерования. Однако при исследовании
криоСЗНТ не происходит радиационного повреждения образца, от-
сутствует поверхностная молекулярная модификация образца, а так-
же не происходит изменений его химического состава, что являет-
ся важным фактором при исследовании биологических образцов,
так как важно сохранить при исследовании их нативную структуру
и свойства. Кроме того, наша методика позволяет исследовать боль-
шую площадь поверхности блока и не требует долгой предваритель-
ной подготовки образца, в отличие от ФИП, где пробоподготовка за-
нимает несколько часов с использованием специальных методов.
Ольга Игоревна Агапова — кандидат биологических наук, научный
сотрудник лаборатории бионанотехнологий ФГБУ «ФНЦ транс-
плантологии и искусственных органов имени акад. В. И. Шумакова»
Минздрава России, специалист по трехмерному структурному ана-
лизу биополимеров, клеток и тканей.
Антон Евгеньевич Ефимов — кандидат физико-математических
наук, ведущий научный сотрудник лаборатории бионанотехноло-
гий ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов име-
ни акад. В. И. Шумакова» Минздрава России, генеральный директор
ООО «СНОТРА», специалист в области разработок приборных ком-
плексов для сканирующей зондовой нанотомографии и методик ис-
следований наноструктуры различных материалов, автор более 30
изобретений и научных работ.
Дмитрий Юрьевич Соколов — главный конструктор ООО «СНОТРА»,
специалист по разработкам криогенных и вакуумных СЗМ систем,
а также по патентованию разработок в области высоких и нанотехно-
логий, автор более 70 изобретений, монографий и научных работ.
Игорь Иванович Агапов — доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией бионанотехнологий ФГБУ «ФНЦ транс-
плантологии и искусственных органов имени акад. В. И. Шумакова»
Минздрава России, специалист по молекулярной биологии, регене-
ративной медицине, автор более 150 научных работ и изобретений.
Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных ор-
ганов им. академика В. И. Шумакова — крупнейшее научно-практи-
ческое учреждение, выполняющее фундаментальные и прикладные
исследования в области трансплантологии и искусственных органов.
ООО «СНОТРА» — малое инновационное предприятие, резидент Фон-
да «Сколково» в кластере Ядерных технологий, специализирующееся
в области разработок и коммерциализации аппаратно-методических
комплексов для сканирующей зондовой нанотомографии.
Agapova O.I., Efimov A.E., Sokolov D.Yu., Agapov I.I.
Scanning Probe Nanotomography
Annotation: The book is dedicated to the modern method of investigation
of three-dimensional micro- and nanostructures — scanning probe nanotomography
(SPNT), which is based on the combination of scanning probe
microscopy and ultramicrotomy. This method was developed in Academician
V. I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artifi -
cial Organs of Ministry of Healthcare of Russian Federation and SNOTRA
LLC. innovation company (Skolkovo Foundation resident in Cluster of Nuclear
Technologies). In this book authors analyze advantages and disadvantages
of SPNT technique in comparison with other methods of ultrastructure
analysis, present results of studies of three-dimensional structure of various
biomaterials and biological objects. Key technical solutions and patenting
specifi cities of developed integrated devices for SPNT and cryoSPNT are
discussed. The book is intended for specialists in the fi elds of nanotechnology,
high-resolution microscopy, structural biology, polymer chemistry, material
science and other specialities.
Authors
Agapova Olga Igorevna — PhD in Biology, researcher of Laboratory of Bionanotechnology,
Academician V. I. Shumakov Federal Research Center of
Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry of Healthcare of Russian
Federation.
Efimov Anton Evgenievich — PhD in Physics and Mathematics, leading scientist
of Laboratory of Bionanotechnology, Academician V. I. Shumakov
Federal Research Center of Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry
of Healthcare of Russian Federation, general director of SNOTRA LLC.
Sokolov Dmitry Yurievich — Chief designer of SNOTRA LLC.
Agapov Igor Ivanovich — Doctor of Science in Biology, professor, head of
Laboratory of Bionanotechnology, Academician V. I. Shumakov Federal Research
Center of Transplantology and Artifi cial Organs, Ministry of Healthcare
of Russian Federation
Введение
В современном мире мультипараметрический наномасштабный
анализ трехмерной структуры объектов как природного, так и ис-
кусственного происхождения является весьма актуальным. В самых
различных областях, будь то биология, медицина, фармацевтика или
химия, изучение материалов, веществ и комплексных конструкций
на наномолекулярном уровне имеет важное значение.
В биологии исследование объектов живой природы на молеку-
лярном и наноуровне позволяет значительно лучше понять природу
и механизмы процессов, протекающих в организмах, дает возмож-
ность увидеть наномасштабное строение отдельных частей объектов
и их структуру. Приоритетным является изучение биологических
объектов в их нативной форме, т. е. максимально приближенной
к тому состоянию, в котором они находятся в природе. В связи с этим
важны разработка и поиск технологий, позволяющих проводить ис-
следования с минимальными изменениями природной структуры,
в любом ее состоянии, будь то твердое, жидкое или гелеобразное.
В медицине приборы и методики с такими характеристиками делают
возможным создание новых биологических материалов и биоинже-
нерных конструкций для заместительной и регенеративной медици-
ны. Благодаря таким разработкам могут создаваться максимально
эффективные лекарственные препараты, обладающие четко направ-
ленным действием и вводимые в организм безоперационными, инъ-
екционными путями, с минимальными повреждениями целостно-
сти тканей. В области химии, смежных и связанных с ней областей
понимание строения наноструктуры веществ помогает в разработке
уникальных материалов, которым можно задавать необходимые фи-
зические, механические и химические свойства для различного рода
и вида изделий.
ГЛАВА 1
Сравнительный анализ сканирующей зондовой микроскопии
с другими существующими методами исследования
Для микроскопических исследований конструкций из полимерных
материалов с витализированными клетками, биодеградируемых
клеточных носителей, гидратированных гелевых биоматериалов не-
обходимо сохранять их нативную структуру на уровне отдельных
макромолекул как во время измерений, так и в процессе подготовки
объекта.
Методы просвечивающей электронной микроскопии и электрон-
ной томографии [1], [2], [3], [4], [5] и их сочетание с корреляционны-
ми оптическими методиками [6], [7], [8] имеют как свои достоинства
и преимущества, так и недостатки, например высокая стоимость
оборудования, трудоемкость работы [9], [10], а также ограничения,
связанные с физическими принципами измерений и формировани-
ем контраста в этих методах. Кроме того, электронная микроскопия
дает возможность восстанавливать трехмерную структуру объекта
при срезах не более 300 нм, что ограничивает возможности исследо-
вания, например, клеточных носителей.
Объединение техники сканирующей электронной микроскопии
(СЭМ) и травления поверхности фокусированным ионным пуч-
ком (ФИП) является одним из наиболее перспективных методов.
Восстановление трехмерной структуры осуществляется с помощью
последовательных СЭМ-изображений поверхности, которые полу-
чаются после стравливания слоев материала ионным потоком с по-
верхности объекта. Метод эффективен при работе с большим коли-
чеством материалов и объектов [11], [12], но воздействие электронных
и ионных пучков, а также вакуумные условия могут оказывать струк-
турные изменения, например, в биологических образцах, что являет-
ся недостатком при исследовании [13].
Для изучения полимеров, клеточных носителей, биоматериалов
на микроуровне [14], [15], [16] широко применяется рентгеновская то-
мография, однако она не позволяет получать на такого рода объектах
разрешение в десятки нм; кроме того, для получения максимального
разрешения с использованием данного метода размер образца не дол-
жен превосходить 1 мкм [17], [18].
Такие ограничения рентгеновской и электронной томографии
весьма неудобны при анализе биологических и полимерных мате-
риалов из легких химических элементов. Избежать подобных огра-
ничений возможно с помощью методов сканирующей зондовой
микроскопии (СЗМ). Такой анализ структуры поверхности позво-
ляет осуществлять исследование с наноразрешением [19], [20], при
этом не разрушая образец химической фиксацией и не нанося по-
вреждения электронным пучком, а также помогает избежать слабо-
го электронно-микроскопического контраста [21], [22]. Кроме того,
СЗМ позволяет анализировать поверхность несколькими методика-
ми: изображение фазы, распределение электрической проводимости
[23], [24], метод измерения силовых кривых, магнитная [25] или элек-
тростатическая силовая микроскопия, химическая силовая микро-
скопия [26], [27].
Принцип сканирующей зондовой нанотомографии заключает-
ся в серии последовательных измерений поверхности образца после
удаления сверхтонких поверхностных слоев материала, после кото-
рых выполняется воссоздание трехмерного томографического изо-
бражения путем объединения серий двухмерных СЗМ-изображений.
Существует несколько способов удаления верхних слоев образца:
плазменное или химическое травление, механическое удаление с ис-
пользованием жесткого зонда СЗМ, срез ультрамикротомом.
Впервые томографическая трехмерная реконструкция на осно-
ве последовательных измерений СЗМ была сделана при помощи
плазменного травления [28], а также защищена патентами [29], [30].
Плазменное травление производилось ex situ, что предполагало пере-
мещение образца из СЗМ в установку для травления и обратно с даль-
нейшей локализацией области исследования с точностью до десятков
нм, что является недостатком данной методики. Спустя некоторое
время, благодаря усовершенствованию методики и установки, стало
возможно осуществить химическое [31] или плазменное травление
поверхности образца, оставляя его в установке СЗМ. Такая методи-
ка использовалась при изучении трехмерных структур полимерных
композитов, а также кости человека [32], [33].
На рис. 1.1 показан пример трехмерной реконструкции микро-
доменной структуры три-блок-сополимера поли-(стирен-блок-
бутадиен-блок-стирена), полученной при помощи последовательных
СЗМ-измерений и плазменного травления поверхности [28].
толщиной 7,5 нм 13 раз стравливались с поверхности. Комби-
нация информации о топографии и фазовом контрасте поверхности
из серии полученных 14 СЗМ-изображений позволила реконструи-
ровать домены в объеме 200 Х 160 Х 45 нм3. Трехмерная реконструкция
изображений фазового контраста может быть интерпретирована как
трехмерная организация цилиндрических полистреновых доменов
в стирен-бутадиен-стиреновой матрице. Недостатком этого метода
является то, что плазменное травление производилось ex situ, что,
в свою очередь, требовало перемещения образца из СЗМ в установку
для травления и обратно и последующей локализации области изме-
рений с точностью до десятков нм.
Недостатком удаления верхних слоев образца плазменным трав-
лением при низком давлении является отличие скорости травления
различных компонентов или фаз в сложных гетерогенных, гибрид-
ных полимерных системах, что ведет к ошибке определения верти-
кального положения зон поверхности при реконструкции. В связи
с этим такая методика не подходит для исследования микро- и на-
нопористых биоматериалов.
Другая методика предполагает последовательное удаление тон-
ких слоев поверхности образца зондом СЗМ и дальнейшими изме-
рениями поверхности. В работе проводящий алмазный зонд, леги-
рованный бором, использовался как для удаления слоев, так и для
измерений структуры из многостенных углеродных нанотрубок в ма-
трице из оксида кремния [34]. Результат трехмерной реконструкции
локальной проводимости нанотрубок представлен на рис. 1.2.
Такой подход осуществим на стандартной установке СЗМ, но не
подходит для мягких полимерных и биополимерных материалов,
а также для микро- и нанопористых материалов.
На данный момент существуют и другие устройства и методики,
позволяющие изучать микроструктуру объектов, измеряя и визуа-
лизируя полученные данные о внутренней морфологии образца как
в двухмерных, так и трехмерных изображениях, например микро-
компьютерная томография (МКТ) [35], предназначенная для того,
чтобы дополнить сканирующую электронную микроскопию благо-
даря трехмерной микроскопии. МКТ позволяет получать информа-
цию о внутренней микроструктуре объекта, при этом не разрушая
структуру и не требуя дополнительной подготовки образца, внутрен-
няя морфология исследуется в двухмерном и трехмерных режимах,
а получаемые реалистичные модели могут использоваться для вирту-
ального изучения объекта. Визуализация при МКТ может осущест-
вляться в виде трех ортогональных сечений, а также срез за срезом,
что делает данное устройство схожим по качеству получаемых ре-
зультатов с ультрамикротомом. Однако МКТ не позволяет исследо-
вать объекты в жидком состоянии или состоянии геля, что возможно
при использовании криоультрамикротомии, а также не дает воз-
можности оценить взаимосвязанность нанопор, что играет важную
роль при использовании исследуемых материалов в регенеративной
медицине.
Также одной из методик, используемых для локального анали-
за материалов, является ФИП (фокусируемый ионный пучок) [12].
Принцип его работы схож с электронным микроскопом, разница
в том, что в ФИП используется ионный пучок. Еще одно отличие со-
стоит в том, что метод ФИП разрушает образец путем вырывания ато-
мов объекта при ударе ионов галлия о его поверхность. А за счет того,
что в процессе обработки происходит проникновение атомов гелия
в толщу образца на несколько нанометров, поверхность образца при-
обретает аморфное состояние. Одним из преимуществ этого метода
является очень тонкая обработка поверхности образца, т. е. толщина
удаленного верхнего слоя может равняться размеру атома, при этом
следующий слой не затрагивается. ФИП можно использовать для
контролируемого травления, так как положение ионного пучка, раз-
мер и время воздействия хорошо регулируются. При использовании
данной методики возможно травление до нанометрового масштаба.
В этом ФИП имеет преимущество перед нашим методом, так как тол-
щина слоя, подвергающегося травлению, составляет не менее 2 нм,
в то время как толщина среза криоультрамикротомом больше 10 нм.
Кроме того, при СЗНТ можно исследовать лишь те виды материа-
лов, которые пригодны для резки алмазным ножом, в то время как
ФИП можно использовать практически для любого вида материалов,
пригодного для ионного фрезерования. Однако при исследовании
криоСЗНТ не происходит радиационного повреждения образца, от-
сутствует поверхностная молекулярная модификация образца, а так-
же не происходит изменений его химического состава, что являет-
ся важным фактором при исследовании биологических образцов,
так как важно сохранить при исследовании их нативную структуру
и свойства. Кроме того, наша методика позволяет исследовать боль-
шую площадь поверхности блока и не требует долгой предваритель-
ной подготовки образца, в отличие от ФИП, где пробоподготовка за-
нимает несколько часов с использованием специальных методов.