eng
Содержание
Оглавление
Предисловие . . 7
Использованные сокращения . . . 9
Введение . . 11
Глава 1. Методы ионизации молекул пептидов и белков . 14
1.1.
Бомбардировка быстрыми атомами, ББА (Fast Аtom
Bombardment, FAB) . . . . . . 14
1.2.
Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация,
МАЛДИ (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16
1.3.
Ионизация электрораспылением, ИЭР (Electrospray
Ionization, ESI) . . 19
Глава 2. Измерение молекулярной массы пептидов и белков . 25
Глава 3. Установление первичной структуры пептидов . 34
3.1.
Деградация по Эдману . . 34
3.2.
Идентификация пептидов по сиквенсу кДНК . 36
3.3.
Леддерное секвенирование . . 37
Глава 4. Масс-спектрометрическое секвенирование . 39
4.1.
Номенклатура фрагментных ионов пептидов . 39
4.2.
Масс-спектры отрицательных ионов . 45
4.3.
Методы инициирования фрагментации молекулярных ионов 46
4.3.1.
Диссоциация, активированная соударениями, ДАС
(Collisionally Activated Dissociation, CAD) . 47
4.3.2.
Диссоциация индуцированная столкновениями
с поверхностью, ДИП (Surface Induced Dissociation
(SID) . . 56
4.3.3.
Диссоциация при захвате электрона, ДЗЭ
(Electron Capture Dissociation, ECD) . 59
4.3.4.
Диссоциация при переносе электрона, ДПЭ
(Electron Transfer Dissociation, ETD) . 64
4.3.5.
Фотоактивация диссоциации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.3.6.
Диссоциация, активированная электронами . 69
4.3.7.
Диссоциация отрицательных ионов при отрыве
электрона . . . . . . 70
4.4.
Методы секвенирования пептидов на приборах с матрично-
активированной лазерной десорбцией/ионизацией . 71
4.4.1.
Метод задержанной экстракции. Распад в источнике,
РВИ (In Source Decay, ISD) . 71
4.4.2.
Распад за пределами источника, РПИ (Post Source
Decay, PSD) . . 72
Глава 5. Идентификация белков и пептидов . 7 6
5.1.
Идентификация с использованием баз данных . 76
5.1.1.
Метод идентификации белков «снизу вверх»
(«Bottom-up») . . 76
5.1.2.
Метод идентификации белков «сверху вниз»
(«Top-down») . . 91
5.2.
Ручная идентификация пептидов . 94
Глава 6. Основные сложности масс-спектрометрического
секвенирования пептидов и пути их преодоления . 97
6.1.
Покрытие сиквенса . . 98
6.2.
Аминокислоты с одинаковой целочисленной массой . 102
6.2.1.
Лизин и глутамин . . 102
6.2.2.
Фенилаланин и окисленный метионин . 104
6.3.
Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин . 106
6.4.
Циклизация коротких пептидов . 108
6.5.
Пептиды, содержащие дисульфидную связь . 116
Глава 7. Использование для секвенирования масс-спектров
отрицательных ионов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Глава 8. Количественный анализ белков с использованием
высокоэффективной жидкостной хроматографии–
масс-спектрометрии. Количественная протеомика . 126
8.1.
Сравнительная (количественная) протеомика . 129
8.1.1.
Безизотопный метод . 129
8.1.2.
Изотопные методы . . . . 132
8.2.
Установление абсолютных количеств . 145
Список литературы . . . . . . 149
Приложение. Bruker: Многомерный путь к разгадке протеома . 163
Предисловие
Важнейшие достижения масс-спектрометрии за последние 20 лет связаны
с исследованиями природных соединений, включая биополимеры. С появле-
нием методов ионизации электрораспылением и матрично-активированной
лазерной десорбции/ионизации для масс-спектрометрии стали доступны са-
хара, нуклеиновые кислоты, белки, липиды и прочие биоорганические макро-
молекулы. Безусловно, наибольших успехов удалось достичь в исследовании
белков. Благодаря чувствительности, информативности, экспрессности, воз-
можности работать со смесями, масс-спектрометрия сегодня — основной ме-
тод анализа этих сложных для изучения объектов.
Пожалуй, можно признать, что современная масс-спектрометрия выигра-
ла конкурентную борьбу с классическим методом установления первичной
последовательности аминокислот в пептидах по Эдману, поскольку масс-
спектрометрическое секвенирование оказалась существенно быстрее, чувстви-
тельнее, информативнее и даже дешевле. Быстрое и надежное определе-
ние первичной структуры белков, т.е. последовательности аминокислотных
звеньев, само по себе уже превосходный результат. Однако масс-спектрометрия
способна изучать структуры более сложных порядков (от 2 до 4), включая
нековалентные взаимодействия белков с появлением надбелковых образова-
ний, устанавливать тип и место посттрансляционных модификаций, рабо-
тать с гликопротеинами, липопротеинами, фосфопротеинами и т.д. Масс-
спектрометрия стала незаменимой в медицине, поскольку способна быстро
и надежно диагностировать сердечно-сосудистые, генетические и онкологи-
ческие заболевания. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формиро-
ванию в конце прошлого века нового научного направления — протеомики.
Огромна роль метода и в метаболомике.
К сожалению, в русскоязычной литературе до сих пор не существовало
учебных пособий или монографий по этой важнейшей и многогранной по
своему применению тематике. Россия кардинально отстает от развитых
стран и по изучению этой дисциплины, и по использованию ее достижений.
Масс-спектрометристам, работающим в России, приходится ориентироваться
на англоязычные издания книг, оригинальные статьи и обзоры. В 2012 г. на
русском языке была издана книга «Принципы масс-спектрометрии в прило-
жении к биомолекулам» под редакцией Дж. Ласкин и Х. Лифшиц (перевод
с английского, изд-во «Техносфера»), представляющая собой сборник статей
ведущих специалистов в области масс-спектрометрии в приложении к биологии.
Книга рассчитана на подготовленных читателей. Она предоставляет
хорошую, во многом, заочную возможность познакомиться с современными
достижениями в области масс-спектрометрии биомолекул, поскольку боль-
шинство описываемых в ней методов пока не используется в нашей стране.
Предлагаемая читателям книга «Основы масс-спектрометрии белков
и пептидов» является первым учебным пособием на русском языке, излагаю-
щим основы масс-спектрометрии белков и пептидов. Книга написана в фор-
мате лекций для начинающих, иллюстрирована большим количеством ри-
сунков, спектров, схем и сопровождается представительным списком цитиро-
ванной литературы. Она рассчитана на студентов и аспирантов химических,
физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет
полезна научным сотрудникам, уже работающим в области исследований
белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.
Цель издания такой книги — заинтересовать молодых исследователей
информативной, очень красивой и востребованной во всем мире дисципли-
ной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для
решения своих собственных фундаментальных и прикладных научных задач.
Основное внимание в учебном пособии уделено методам ионизации бел-
ков и пептидов, процессам фрагментации этих соединений в газовой фазе.
Достаточно подробно рассматриваются вопросы тандемной масс-спектрометрии,
существующие методы инициирования фрагментации. Этот раздел
очень важен в современной масс-спектрометрии. Он полезен для исследова-
телей, работающих с любыми химическими соединениями и биополимерами.
Несколько глав посвящены идентификации белков и пептидов. Сюда входят
варианты автоматизированной идентификации, расшифровка спектров вруч-
ную, описание определенных сложностей масс-спектрометрического секве-
нирования и вариантов их преодоления. Рассмотрены достоинства и недо-
статки двух основных подходов установления химической структуры белков:
масс-спектрометрии «сверху-вниз» и «снизу-вверх». Отдельная глава посвя-
щена вопросам количественного анализа.
Книга посвящена Александру Леонидовичу Курцу и Киму Петровичу
Бутину, двум друзьям, замечательным профессорам химического факульте-
та Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, очень
близких нам в человеческом отношении, непосредственно участвовавшим в
нашем химическом и гуманитарном образовании. Мы всегда высоко оценива-
ли химическую эрудицию и потрясающие личностные качества этих ученых.
Именно общение с этими людьми вдохновило нас в самом начале XXI века
начать исследования в области масс-спектрометрии пептидов.
Использованные сокращения
ББА — бомбардировка быстрыми атомами (Fast Atom Bombardment,
FAB)
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХ/МС — газовая хроматография / масс-спектрометрия
ДИП — диссоциация, индуцированная столкновениями с поверхно-
стью (Surface Induced Decomposition, SID)
ДАС — диссоциация, активированная соударениями (Collisionally
Activated Decomposition, CAD)
ДАСПЭ — ДАС при повышенной энергии (Higher-Energy C-trap
Dissociation, HCD)
ДИИАЧТ — диссоциация в результате поглощения инфракрасного
излучения абсолютно черного тела (Blackbody Infrared
Radiative Dissociation, BIRD).
ДИС — диссоциация индуцированная соударениями (Collisionally
Induced Decomposition, CID)
ДЗЭ — диссоциация при захвате электрона (Electron Capture
Dissociation, ECD)
ДПЭ — диссоциации при переносе электрона (Electron Transfer
Dissociation, ETD)
ДОЭ — диссоциация при отрыве электрона (Electron Detachment
Dissociation, EDD)
ЖХ/МС — жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
ДИЭ — диссоциация при ионизации электронами (Electron Ionization
Dissociation, EID)
ДИЭ — диссоциация, индуцированная электронами (Electron
Induced Dissociation, EID)
ДЗВЭ — диссоциация при захвате высокоэнергетических электронов
(Hot ECD, HECD)
ИКМФД — инфракрасная мультифотонная диссоциация (Infra Red
Multi Photon Dissociation, IRMPD)
ИФА — иммуноферментный анализ
МАЛДИ — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)
МС/МС — тандемная масс-спектрометрия
— Метод точных масс и времен удерживания (Accurate Mass
and Time tags, AMT)
РВИ — распад в источнике (In-Source Decay, ISD)
РПИ — распад за пределами источника (Post Source Decay, PSD)
ТСХ — тонкослойная хроматография
УФФД — ультрафиолетовая фотодиссоциация при l = 157 нм
(UV Photodissociation at l = 157 nm)
ФСИДИС — фемтосекундная ионизация/диссоциация, индуцированная
лазером (Femtosecond Laser-Induced Ionization/Dissociation,
fs-LID)
ФТГ — фенилтиогидантоиновое производное аминокислоты
ИЭР — ионизация электрораспылением (Electrospray Ionization, ESI).
CIRCA — Combination of Infrared and Collisional Activation
ERPA — Extended Range Proteomic Analysis — протеомный анализ
в расширенном диапазоне
HECD — Hot ECD диссоциация при захвате высокоэнергетических
электронов
ICAT — Isotope-Coded Affinity Tag
iTRAQ — Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation
NETD — Negative Electron Transfer Dissociation
PSAQ — Protein Standard for Absolute Quantitation
SILAC — Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture
SISCAPA — Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide
Antibodies
TMPP-Ac — N-концевые трис(2,4,6-триметоксифенил)фосфониевые
производные
ТМТ — Tandem Mass Tag
Введение
Пептиды (греч. πεπτος — питательный) — семейство веществ, молекулы ко-
торых построены из остатков α-аминокислот, соединенных в цепь пептидны-
ми (амидными) связями –C(O)NH– (рис. 1). Первый синтетический пептид
получил T. Курциус в 1881 г., а термин «пептид» предложен Э. Фишером, ко-
торый к 1905 г. разработал общий метод синтеза этих соединений. Не суще-
ствует строгого различия между пептидами и белками. Считается, что белки
представляют собой пептиды с большой массой и возможной вторичной и
третичной структурой. Обычно природные полипептиды с молекулярной
массой более 5 – 6 тысяч Да (иногда 2 – 3 тысяч Да) называют белками. Эта
граница между белками и пептидами удивительным образом совпадает с со-
временными возможностями масс-спектрометрии. Первичная структура (по-
следовательность аминокислотных звеньев) не изучавшихся ранее пептидов
может быть установлена в результате прямого масс-спектрометрического
анализа исходных молекул. Для новых белков это пока очень сложно (см.
Протеомика «сверху-вниз», «top down», раздел 5.1.2), а положительный ре-
зультат (определение полной последовательности аминокислот) не гаранти-
рован. Часто используется дополнительное расщепление белковых молекул
в результате химических или энзиматических реакций на более мелкие
фрагменты, которые уже изучаются с помощью масс-спектрометрии.
Аминокислотный остаток пептида, несущий свободную аминогруппу, на-
зывается N-концевым, а несущий свободную карбоксильную группу — С-концевым.
Название пептида образуется из названия входящих в его состав
аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно, начиная с N-концевого.
При этом используют тривиальные названия аминокислот, в кото-
рых окончание «ин» заменяется на «ил». Исключением является C-концевой
остаток, название которого совпадает с названием соответствующей амино-
кислоты. Нумерация аминокислотных остатков осуществляется с N-конца.
Для записи первичной структуры пептида (аминокислотной последователь-
ности) используют трехбуквенные и однобуквенные обозначения аминокис-
H2N
H
N
O R2
R1
NH
O R3
H
N
O R4
NH
O R5
O
OH
Рис. 1.1. Структурная формула пентапептида.
лотных остатков (например, ASDFG — аланил–серил–аспарагил–фенилаланил–
глицин). Эти обозначения, а также структуры и массы аминокислотных
остатков самых распространенных природных α-аминокислот представлены
в табл. 4.1. Теоретически существует бесконечное количество аминокислот,
поскольку любое органическое соединение с аминной и карбоксильной груп-
пами является аминокислотой.
Помимо аминокислот, выстроенных в цепочку, в структуре пептидов, и тем
более белков, могут присутствовать определенные модификации, называе-
мые посттрансляционными. Это общее название химических модификаций
белка, синтезированного организмом на основе нуклеотидной последова-
тельности, с образованием новой ковалентной связи. Посттрансляционные
модификации существенно увеличивают разнообразие белков. На сегодняш-
ний день известно более двухсот вариантов посттрансляционной модифика-
ции белков, и, по всей видимости, модификациям подвергается подавляю-
щее большинство белков, причем, один и тот же белок может подвергаться
нескольким различным модификациям. Реализация в организме той или
иной посттрансляционной модификации не может быть установлена на осно-
вании расшифрованного генома. Определение типов модификаций, их мест
в молекуле белка и условий возникновения является задачей протеомики.
Среди простейших модификаций можно отметить окисление метионина до
сульфоксида, образование дисульфидной связи между двумя цистеиновыми
остатками, ацилирование аминогруппы N-конца или С-амидирование
(за-
мена гидрокси- на аминогруппу на С-конце).
Одной из наиболее распространенных посттрансляционных модифика-
ций белков является гликозилирование с образованием гликопептидов (гли-
копротеинов). В случае N-связанных гликанов углевод присоединен к атому
азота боковой цепи остатка аспарагина или аргинина; в O-связанных глика-
нах углеводный фрагмент присоединен к гидроксигруппам боковых цепей
остатков серина, треонина, тирозина или гидроксилизина. Под реакцией
фосфорилирования белков понимают присоединение фосфатной группы через
фосфоэфирную связь (О-фосфорилирование) к гидроксигруппе боковой цепи
остатка серина, треонина или тирозина. Фосфорилированный пептид назы-
вается фосфопептидом. Среди других наиболее распространенных посттрансляционно
модифицированных белков можно выделить сульфопротеины, со-
держащие в своем составе сульфатную группу и липопротеины, образующи-
еся при взаимодействии белков с липидами. Образуются также аддукты пеп-
тидов с самыми разнообразными органическими и металлоорганическими
соединениями, в том числе экотоксикантами. Все эти варианты обусловлены
посттрансляционными модификациями в живых организмах или природны-
ми, физико-химическими факторами. Следует подчеркнуть, что подробное
рассмотрение масс-спектрометрического
поведения посттрансляционно моди-
фицированных пептидов и белков не входит в рамки данного пособия. В не-
которых разделах будет упоминаться возможность определения места пост-
трансляционных модификаций с помощью того или иного подхода. Несколь-
ко подробнее будет рассмотрена проблема раскрытия дисульфидных связей
(раздел 6.5). Для интересующихся вопросами применения масс-спектрометрии
для детектирования и установления положения посттрансляционных
модификаций можно порекомендовать книгу В. Заикина и Дж. Халкета
(V. Zaikin and J. Halket, 2009).
Первые масс-спектры аминокислот получил Клаус Биман в 1958 г.
(K. Biemann et al., 1959) методом ионизации электронами. Основной проблемой
Бимана было перевести полярные термолабильные молекулы в газо-
вую фазу и ввести их в ионный источник. С появлением химической ионизации,
полевой десорбции и полевой ионизации удалось добиться опреде-
ленных успехов в анализе простых пептидов. Однако эксперименты были
трудоемки, характеризовались плохой воспроизводимостью и часто требовали
проведения химической дериватизации исходных соединений для по-
вышения их летучести. Достижения масс-спектрометрии в этой области
в 1958–1978 гг. изложены в исчерпывающей монографии Б.В. Розынова
(Б.В. Розынов, 1978), а варианты дериватизации аминокислот, включая со-
временные, можно найти в книге В.Заикина и Дж. Халкета (V. Zaikin and
J. Halket, 2009).
Возможности электронной и химической ионизации резко уменьшаются
при переходе от аминокислот к пептидам в связи с еще меньшей летучестью
и повышенной термолабильностью этих соединений. Для анализа простей-
ших пептидов этими методами используются различные виды дериватиза-
ции, включая алкилирование, ацилирование, триметилсилилирование и т.д.
(Б.В. Розынов, 1978; V. Zaikin and J. Halket, 2009). Тем не менее, по этим
спектрам уже можно устанавливать последовательность аминокислотных
звеньев (A.A. Kiryushkin et al., 1971; Б.В. Розынов, 1978; C.V. Bradley et al.,
1981).
Глава 1 Методы ионизации молекул
пептидов и белков
Реальный прорыв в масс-спектрометрии пептидов связан с созданием метода
бомбардировки быстрыми атомами в середине 70-х годов ХХ века
(Г.Д. Танцырев, Н.А. Клейменов, 1973; A. Benninghoven et al., 1976). Появи-
лась возможность устанавливать молекулярные массы и последовательность
аминокислотных звеньев олигопептидов с массами в тысячу и более Дальтон
(D.F. Hunt et al., 1981; C.V. Bradley et al., 1982). Еще через 15 лет с появлением
метода ионизации электрораспылением (М.Л. Александров и др., 1984;
C.M. Whitehouse et al., 1985) и матрично-активированной лазерной десорб-
ции/ионизации (M. Karas et al., 1987) масс-спектрометрия стала ключевым
методом установления первичной структуры пептидов. Возникает новая
наука — протеомика (D.C. Liebler, 2002; R. Aebersold, M. Mann, 2003).
1.1. Бомбардировка быстрыми атомами
Основоположником метода ионизации бомбардировкой быстрыми атомами
(ББА, Fast Atom Bombardment, FAB) считают Беннингховена благодаря ра-
боте (A. Benninghoven et al., 1976). Тем не менее, Г.Д. Танцырев опубликовал
свои результаты исследований с применением этого метода существенно
раньше — в 1973 г. (Г.Д. Танцырев, Н.А. Клейменов, 1973).
Принципиальная схема ионизации бомбардировкой быстрыми атомами
представлена на рис. 1.1. Для получения пучка атомов используется «атом-
ная пушка», а в качестве ионизирующих частиц — атомы инертных газов.
На выход ионов анализируемого вещества существенно влияет атомная мас-
са разогнанных частиц первичного пучка. Например, пучок атомов ксенона
эффективнее, чем атомов аргона и, тем более, атомов неона.
Пучок ускоренных атомов с энергией 7–9 кэВ направляется на раствор
анализируемого вещества в матрице, нанесенный на металлическую под-
ложку, расположенную на конце штока прямого ввода. Взаимодействуя с
веществом, атомы создают интенсивный локальный разогрев, в результате
которого молекулы поверхностных слоев отрываются в виде плотного газа,
содержащего положительные и отрицательные ионы, а также нейтральные
частицы, которые могут ионизироваться непосредственно над поверхностью
образца.
Если на шток нанесено сухое вещество, то через короткий промежуток
времени наблюдается резкое падение интенсивности пучка генерируемых
ионов, так как разрушается поверхностный слой кристаллической решетки
вещества. Поэтому используют растворенный образец. Важно, чтобы образец
был именно растворен в матрице. Если истинного раствора нет, качество
спектров значительно ухудшается. Помочь может добавление солюбилизаторов.
Диффузия в жидкой матрице протекает достаточно быстро для того,
чтобы обеспечить постоянную концентрацию молекул образца на поверхно-
сти. В этом случае пучки ионов образца достаточной интенсивности могут
генерироваться в течение длительного времени ( > 20 мин). В качестве рас-
творителя (матрицы) используется широкий круг мало летучих соединений;
чаще других — глицерин и м-нитробензиловый
спирт.
Хотя важнейшим достоинством ББА является возможность получать масс-
спектры высокомолекулярных соединений, это не такой мягкий метод иони-
зации, как полевая десорбциия или электрораспыление.
Бомбардировка об-
разца быстрыми атомами обеспечивает передачу молекулам энергии в ши-
роком диапазоне. В результате, наряду с пиками молекулярных ионов в
спектре наблюдаются интенсивные пики осколочных и перегруппировочных
ионов, что позволяет в ряде случаев не прибегать к тандемной масс-спектрометрии
для изучения фрагментации и структуры анализируемых молекул.
Масс-спектры ББА характеризуются четноэлектронными ионами типа
MH+ и [M – H]–, но не М+• и М–•. Отчасти это является результатом ионно-
молекулярных реакций, протекающих в плазме над поверхностью образца,
отчасти перенос протона происходит еще в жидкой матрице. Использование
в качестве растворителя материалов с бóльшей основностью приводит к обра-
зованию ионов [M + матрица]+. Качество спектров можно повышать добавка-
Ar+
Ar0
Атомная
пушка
Шток Анализатор
Образец на
наконечнике
штока
Ионы
Выделение и
фокусировка
Рис. 1.1. Принципиальная схема ионизации бомбардировкой быстрыми атомами.
ми, вызывающими образование ионов непосредственно в жидкой фазе. До-
бавки кислот приводят к увеличению интенсивности пиков в спектрах поло-
жительных ионов соединений с центрами основности, а добавки щелочей ис-
пользуются для увеличения выхода отрицательных ионов в спектрах соеди-
нений с кислотными группами. В частности, полипептиды с избытком
оснóвных аминокислот ( K.L. Busch et al., 1982 ) характеризуются спектрами
положительных ионов с интенсивными пиками МН+. В спектрах полипепти-
дов с избытком кислотных групп интенсивность этого пика мала, тогда как
пики депротонированных молекул, напротив, весьма интенсивны. Иногда
полезно добавлять к образцу неорганические соли. Например, добавка NaCl
к образцам полипептидов или олигосахаридов в глицериновой матрице
(M. Barber et al., 1982 ) приводит к образованию интенсивных пиков ионов
[M + Na]+.
Бомбардировка быстрыми атомами позволяет надежно устанавливать
величины m/z молекулярного и фрагментных ионов. Время анализа невели-
ко. Однако поскольку диапазон регистрируемых масс обычно не превышает
2000 Да, а для анализа необходимо иметь не менее 100 пикомолей чистого
образца, он может применяться только для анализа олигопептидов, причем
предварительно очищенных. м-Нитробензиловый спирт оказался наилуч-
шей матрицей для этой цели. В качестве растворителя образца используют
смесь воды и ацетонитрила с возможными добавками метанола, уксусной и
трифторуксусной
кислот. Хотя ББА не является «мягким» методом иониза-
ции, и в обычном масс-спектре наблюдается представительный ряд пиков
фрагментных ионов, для целей определения последовательности аминокис-
лотных звеньев в пептиде лучше использовать тандемную масс-спектрометрию.
В качестве иона предшественника выбирается протонированная моле-
кула пептида, фрагментация которой иницируется соударениями с атомами
инертного газа (см. далее «Методы инициирования фрагментации молекулярных
ионов», раздел 4.3). С широким внедрением в практику методов
матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации и ионизации элек-
трораспылением бомбардировка быстрыми атомами используется все реже,
а большинство коммерческих масс-спектрометров выпускается уже без соот-
ветствующих опций.
1.2. Матрично-активированная лазерная
десорбция/ионизация
Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ,
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) впервые описан во вто-
рой половине 80-х годов прошлого века ( M. Karas et al., 1985; M. Karas et al.,
1987; K.Tanaka et al., 1988 ). Основные достижения в разработке этого метода
принадлежат Ф. Хилленкампу и М. Карасу. В 1988 г. были опубликованы ре-
зультаты анализа белков с массами до 70 000 Да (M. Karas, F. Hillenkamp,
1988 ), а в 1990 г. — уже до 116 000 Да (B. Spengler, R.S. Cotter., 1990 ). Рекорд-
ные для масс-спектрометрии массы однозарядных ионов в несколько милли-
онов Дальтон (F. Hillinkamp et al., 2002) были зарегистрированы именно с
помощью матрично активированной лазерной десорбции/ионизации. Одно-
му из первооткрывателей метода Коичи Танаке (K. Tanaka) в 2002 г. присуж-
дена Нобелевская премия в области химии.
Метод МАЛДИ обладает высочайшей чувствительностью (уровень атто-
(10–18 ) и зепто- (10–21 ) молей), не требует сложной пробоподготовки и позволяет
работать с гетерогенными образцами. Одной из разновидностей
МАЛДИ, методом десорбционной ионизации с кремния (Desorption/Ionization
on Silicon, DIOS), установлен абсолютный рекорд чувствительности любого
аналитического метода. Пик молекулярного иона дез-Arg9-брадикинина с
изотопным расщеплением зарегистрирован для 800 йоктомолей (480 моле-
кул) этого пептида (S.A. Trauger et al., 2004 ). Повторить этот результат пока
никому
не удалось, но регистрация аналитов в зептомолярных (10–21) коли-
чествах описана многими исследователями.
Метод позволяет установить молекулярную массу пептида или белка в сот-
ни тысяч Дальтон с точностью 0.5 – 0.01 %. Для него характерны протониро-
ванные молекулы МН+ и аддукты с катионами щелочных металлов. В спек-
трах неочищенных от солей образцов пики ионов [M + Na]+ и [M + K]+ часто
имеют более высокую интенсивность, чем МН+. Метод удобен для скрининго-
вого анализа, например, для установления молекулярных масс протеолити-
ческих пептидов в смеси после энзиматического расщепления белка. Особенно-
стью метода является образование, прежде всего, однозарядных ионов. Ин-
тенсивности пиков двух- и трехзарядных ионов существенно ниже (рис. 1.2).
Тем не менее, с увеличением молекулярной массы образца до 105 – 106 Да
наблюдаются и многозарядные ионы (Y. Cai et al., 2002 ). Образованию мно-
гозарядных ионов способствует также использование неметаллических под-
ложек (V. Frankevich et al., 2003) или источников МАЛДИ с высоким давле-
нием (P.B. O’Connor, C.E. Costello, 2001).
Теория МАЛДИ объясняет преимущественное наблюдение однозарядных
ионов реакциями первичных многозарядных ионов с нейтральными молеку-
лами матрицы, электронами и анионами в зоне шлейфа (M. Karas et al.,
2000). Поскольку эти процессы эффективнее, когда в них вовлечены многоза-
рядные ионы, выживают, в основном, именно однозарядные.
Важнейшими варьируемыми параметрами метода являются природа ма-
трицы, количественное соотношение матрица/анализируемое соединение,
длина волны, долгота импульса и мощность лазерного излучения, способ
пробоподготовки и т.д. (F. Hillenkamp and J. Peter-Katalinic, 2007).
Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами об-
разца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения
в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее мо-
лекулы активно поглощали фотоны, эмиттируемые
УФ- или ИК-лазером.
В качестве матриц наиболее часто используют
2,5-дигидроксибензойную и
α-циано-4-гидроксикоричную кислоты, хотя в опубликованных на сегодняш-
ний день работах описаны уже сотни разнообразных
матриц. 2,5-Дигидроксибензойная
кислота, характеризующаяся незначительными фоновыми пика-
ми в области низких масс, особенно эффективна для получения спектров лег-
ких соединений с молекулярной массой до 1000 Да. Молярное соотношение
матрица/анализируемое вещество обычно составляет от 10 :1 до 50000 :1 и
оптимизируется для каждого нового образца. Важно, чтобы во время высу-
шивания нанесенного на подложку образца, произошла сокристаллизация
вещества матрицы и анализируемого соединения.
Короткий световой импульс лазера поглощается молекулами матрицы
и разрушает ее кристаллическую структуру. Часть молекул отрывается от
поверхности и образует высокотемпературный суперплотный газ (зона шлей-
фа), в котором помимо молекул, ионов и ассоциатов матрицы присутству-
ют молекулы анализируемого соединения (см. рис. 1.3 на цветной вставке).
В зоне шлейфа образуется газовая плазма, в которой протекают процессы
вторичной ионизации. Механизмы этих реакций включают протонирование
и депротонирование, перезарядку и присоединение аниона или катиона.
m/z
20 000 40 000 60 000 80 000 100 000 120 000 140 000
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
Интенсивность, отн. ед.
66431
33224
132453
Рис. 1.2. Спектр МАЛДИ мономера (m/z 66 431) и димера (m/z 132 453) амбулина
бычьей сыворотки.
Ионизация
аналита, протекающая путем поглощения энергии фотонов или
в результате ионно-молекулярных реакций, приводит к образованию поло-
жительных и отрицательных ионов, которые вытягиваются высоким потен-
циалом ( ~ 25 кВ) из области ионизации и направляются в анализатор.
Практически во всех коммерческих приборах используется времяпролет-
ный анализатор, поскольку он характеризуется и неограниченным диапазо-
ном масс, и наибольшей скоростью регистрации масс-спектра, а основной за-
дачей МАЛДИ является как раз получение информации о молекулярной
массе высокомолекулярных соединений. Кроме того, именно времяпролет-
ные приборы лучше других работают с импульсными методами ионизации и
обладают высочайшей чувствительностью, поскольку все образовавшиеся в
результате ионизации ионы достигают детектора. Спектры после каждого
лазерного импульса могут суммироваться для получения качественной ин-
формации о молекулярной массе соединения. Обычно для приемлемого ре-
зультата оказывается достаточно 30 – 50 лазерных импульсов.
К недостаткам метода можно отнести тот факт, что некоторые незначимые
ингредиенты неочищенных смесей иногда дают очень интенсивные пики в
спектрах. Эти пики могут маскировать наличие действительно важных для
исследователя компонентов, т.е. МАЛДИ не является методом количествен-
ного анализа. Методы очистки проб для последующего МАЛДИ анализа
описаны в обзоре (Y. Xu et al., 2003).
1.3. Ионизация электрораспылением
Первая работа по вводу водных растворов органических соединений в масс-
спектрометр была выполнена под руководством Л.Н. Галль и опубликована
в 1984 г. (М.Л. Александров и др., 1984). Предложенный авторами метод
ЭРИАД (экстракция ионов из раствора при атмосферном давлении) явился
не чем иным, как прообразом одной из наиболее популярных сегодня масс-
спектрометрических техник ионизации – ионизация электрораспылением
(ИЭР, Еlectrospray Ionization, ESI). Тем не менее, Нобелевская премия в
2002 г. была присуждена Дж. Фенну (J.B. Fenn) как создателю метода иони-
зации электрораспылением для ввода жидкой пробы в масс-спектрометр.
Следует подчеркнуть, что его первая работа по этой тематике (M. Yamashit
and J.B. Fenn, 1984) со ссылкой на раннюю работу М. Доуля (M. Dole et al.,
1968) была опубликована в том же 1984 г., но позднее.
Метод ионизации электрораспылением позволяет вводить образец непо-
средственно в ионный источник или с предварительным разделением его
при прохождении через колонку жидкостного хроматографа. Поток жидко-
сти (см. рис. 1.4 на цветной вставке) направляется в иглу диаметром 0.1 мм,
на которую подается высокое напряжение порядка 3 – 7 кВ. На выходе из
иглы в источнике ионов образуется аэрозоль из заряженных капель с высо-
ким поверхностным зарядом. Эти капли движутся к противоэлектроду, име-
ющему потенциал Земли. В том же направлении уменьшается и давление,
хотя в этой части ионного источника (до противоэлектрода) давление поддер-
живается на уровне атмосферного. По мере движения к входному отверстию
первого сепаратора капли уменьшаются в размере за счет испарения раство-
рителя. Достигая критического размера, при котором силы поверхностного
натяжения далее не могут противостоять силам кулоновского отталкивания
(предел Релея), капля «взрывается» с образованием более мелких капелек.
Этот процесс повторяется. В итоге возникают микрокапли, содержащие все-
го одну заряженную частицу, которая может оказаться в газовой фазе после
испарения остаточных молекул растворителя (J.F. Mora et al., 2000).
Альтернативный механизм предусматривает выброс заряженной молекулы
с поверхности одноименно заряженной капли (J.V. Iribarne and
B.A. Thomson, 1976). Недавняя работа, выполненная под руководством Ренато
Зеноби (K. Chingin et al., 2010), является очень весомым аргументом
в пользу этого механизма. Спектроскопические исследования пучка ионов,
образовавшихся при электрораспылении, по мере их движения в масс-спектрометре
показали существование всего двух пиков с разной длиной волны.
Первый из них, очевидно, связан с сольватированными протонированными
молекулами аналита, а второй — со свободными газофазными. В случае по-
степенного уменьшения степени сольватации пик поглощения должен был
быть широким и охватывать весь диапазон сольватированных частиц: от
полностью сольватированнных до свободных ионов в газовой фазе.
В любом случае в газовой фазе оказываются несольватированные молеку-
лы анализируемого вещества, которые проходят через сепаратор и оказывают-
ся в анализаторе. Модификация электрораспыления, названная «наноэлек-
трораспылением», оперирует потоками со скоростями в несколько нл мин–1
и позволяет повысить эффективность образования ионов анализируемого ве-
щества почти на два порядка (M.S. Wilm, M. Mann, 1994). Это особенно важно
для исследования пептидов и белков, поскольку дает возможность значитель-
но сократить количество аналита, необходимое для регистрации качествен-
ного масс-спектра. Работы по созданию и совершенствованию технических
решений метода ионизации электрораспылением ведутся в настоящее время
во многих лабораториях мира. В качестве приема можно предложить статью
Б. Речке и А. Тимпермана и многочисленные ссылки в ней (B.R. Rechke and
A.T. Timperman, 2011).
Помимо высочайшей чувствительности (атто- и зептомоли образца) и воз-
можности работы с термолабильными и нелетучими веществами, иониза-
ция электрораспылением позволила исследователям анализировать соеди-
нения с молекулярными массами до 1.0 × 106 Да и выше (M.A. Tito et al.,
2000). Зафиксированный рекорд составляет 1.1 × 107 Да (R. Chen et al., 1995),
когда в масс-спектрометре с преобразованиями Фурье удалось измерить мо-
лекулярную массу ДНК бактериофага Т4, зарегистрировав молекулярные
ионы с зарядом 28 – 35 тысяч. Все же следует отметить, что электрораспыление
может использоваться c максимальной эффективностью для анализа
соединений с массой до ~ 1.5 × 105 Да. В случае более тяжелых молекул спек-
тры становятся слишком сложными для расшифровки, так как большое чис-
ло пиков многозарядных ионов располагается в сравнительно небольшом
диапазоне (m/z от 500 до 3000).
Поскольку ионы, образующиеся в условиях электрораспыления, обладают
значительно меньшей внутренней энергией, чем, например, в случае
бомбардировки быстрыми атомами, их фрагментация практически не реа-
лизуется, а масс-спектр представляет собой набор пиков, обусловленных про-
тонированными молекулами с разным числом протонов, т.е. с различными
зарядами (точнее [M + nH]n+). Для инициирования фрагментации этих ионов
необходимо использовать тандемную масс-спектрометрию. Типичный масс-
спектр ионизации электрораспылением полипептида (эскулентин 1а с моле-
кулярной массой 4813.6896 Да) представлен на рис. 1.5.
Именно образование многозарядных ионов является важнейшим досто-
инством метода ионизации электрораспылением. Число присоединившихся
протонов зависит от многих факторов. Если говорить о пептидах и белках,
наиболее активно протонируются остатки оснóвных аминокислот (аргинин,
лизин, гистидин и N-концевой атом азота). Практические наблюдения пока-
100
80
60
40
20
0
Интенсивность, отн. ед. m/z
600 700 800 900 1000 1100 1200
580.372
603.095
640.862
688.964
756.913
803.624
865.044 880.491
891.341
1025.560
1039.729
1097.712
1116.605
1147.431
1173.985
1204.935
1247.676
964.348
+8
+7
+6
+5
+4
Рис. 1.5. Многозарядные ионы, образующиеся при электрораспылении в ионной
ловушке пептида эскулентина 1а с молекулярной массой 4813.6896 Да.
зывают, что для электрораспыления характерно присоединение одного про-
тона на участок цепи аминокислот массой в 1000 Да. Таким образом, белок с
молекулярной массой 100 кДа можно зарегистрировать на шкале масс в об-
ласти m/z 1000. Для глобулярных белков, растворенных в воде, предложе-
на формула (1.1) наиболее вероятного заряда (J. Fernandez de la Mora, 2000).
В этом случае использована теория постепенной десольватации органиче-
ского иона в процессе электрораспыления.
Z = 0.078 M 1/2, (1.1)
где Z – заряд, М – молекулярная масса.
Распределение интенсивностей молекулярных ионов в зависимости от
числа присоединившихся протонов позволяет исследовать доступность мест
протонирования и на базе этой информации делать выводы о высших струк-
турах белковых молекул (I.A. Kaltashov, S.J. Eyles, 2005). Еще одним достоин-
ством многозарядных ионов является возможность получения комплементар-
ной информации при активации их фрагментации. Даже обычные спектры
диссоциации, активированной соударением, будут несколько отличаться друг
от друга в зависимости от числа зарядов иона-предшественника. Суммиро-
вание информации при записи этих спектров таких молекулярных ионов по-
зволяет увеличить покрытие сиквенса, что полезно и для идентификации
известных пептидов и белков, и для de novo секвенирования (см. раздел 6.1).
Кроме того, в случае многозарядных ионов появляется возможность исполь-
зования эффективных альтернативных методов активации фрагментации:
диссоциации при захвате электрона и диссоциации при переносе электрона.
К недостаткам метода можно отнести требования высокой гомогенности про-
бы и отсутствия значимых уровней солей (менее 1 миллимоля).
Существуют методы увеличения зарядности белковых ионов, образующих-
ся в условиях ионизации электрораспылением. В частности эффективный
подход связан с небольшими добавками в пробу низколетучих суперзаряжа-
ющих (supercharging) реагентов (A.T. Ivarone et al., 2001; H.J. Sterling et al.,
2010; S. Yin and R. Loo, 2011). Наиболее популярными являются нитробензи-
ловый спирт, сульфолан, диметилацетамид, диметилсульфоксид и т. д. В ре-
зультате таких добавок возрастает степень протонирования пептидов и стано-
вится возможным зарегистрировать полипротонированные молекулы высоко-
молекулярных белков на приборах с небольшим диапазоном масс (рис. 1.6).
При работе на приборах с преобразованием Фурье (орбитальная ловушка и
ионный циклотронный резонанс) пики таких многозарядных ионов характе-
ризуются улучшенным отношением сигнал/шум, повышенным разрешением
и точностью измерения массы (S.G. Valeja et al., 2010). Механизм этого явле-
ния пока не совсем понятен. Наиболее популярная на сегодняшний день ги-
потеза связывает возникновение этого эффекта с изменениями поверхност-
ного натяжения в микрокаплях. Хотя в обычных водных растворах суперзаряжающие
добавки не вызывают значительных структурных изменений
белковых молекул, обогащение микрокапель, образующихся в условиях иони-
зации электрораспылением, мало летучими добавками приводит к химиче-
скому или термическому денатурированию больших молекул в миллисекунд-
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
а
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
б
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
в
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
г
NO2
OH
Гем+
Гем+
9+
9+
9+
9+
9+
9+
10+
10+
10+
11+
11+
11+
12+
12+
12+
13+
13+
13+
14+
14+
15+
19+ 17+ 15+
10+
10+
8+
8+
8+
8+
7+
7+
*
*
*
* * * *
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Рис. 1.6. Масс-спектры водного ацетатно-аммонийного раствора 20 мкМ миоглобина
с добавками: а — 0.00 %; б — 0.03 %; в — 0.10 %; г — 0.40 % м-нитробензилового
спирта (формула представлена на рис. 1.6а). * — зарядовые состояния ионов апомиоглобина
(H.J. Sterling et al., 2010, с разрешения Springer).
ном временнóм диапазоне. В результате протонированию становятся доступ-
ны новые центры.
Л. Чен (L.C. Chen et al., 2011) продемонстрировал изменение поведения
протонированных молекул в условиях ионизации электрораспылением при
повышенном давлении. В частности, можно понизить спонтанное отщепление
лабильных групп. Например, миоглобин, нековалентно связанный с
железосодержащим порфирином (гемом), легко теряет этот фрагмент в усло-
виях обычного электрораспыления. При повышении давления до 0.4 МПа
в спектре ионизации электрораспылением доминирует пик неразрушенного
комплекса.
Важнейшие достижения масс-спектрометрии за последние 20 лет связаны
с исследованиями природных соединений, включая биополимеры. С появле-
нием методов ионизации электрораспылением и матрично-активированной
лазерной десорбции/ионизации для масс-спектрометрии стали доступны са-
хара, нуклеиновые кислоты, белки, липиды и прочие биоорганические макро-
молекулы. Безусловно, наибольших успехов удалось достичь в исследовании
белков. Благодаря чувствительности, информативности, экспрессности, воз-
можности работать со смесями, масс-спектрометрия сегодня — основной ме-
тод анализа этих сложных для изучения объектов.
Пожалуй, можно признать, что современная масс-спектрометрия выигра-
ла конкурентную борьбу с классическим методом установления первичной
последовательности аминокислот в пептидах по Эдману, поскольку масс-
спектрометрическое секвенирование оказалась существенно быстрее, чувстви-
тельнее, информативнее и даже дешевле. Быстрое и надежное определе-
ние первичной структуры белков, т.е. последовательности аминокислотных
звеньев, само по себе уже превосходный результат. Однако масс-спектрометрия
способна изучать структуры более сложных порядков (от 2 до 4), включая
нековалентные взаимодействия белков с появлением надбелковых образова-
ний, устанавливать тип и место посттрансляционных модификаций, рабо-
тать с гликопротеинами, липопротеинами, фосфопротеинами и т.д. Масс-
спектрометрия стала незаменимой в медицине, поскольку способна быстро
и надежно диагностировать сердечно-сосудистые, генетические и онкологи-
ческие заболевания. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формиро-
ванию в конце прошлого века нового научного направления — протеомики.
Огромна роль метода и в метаболомике.
К сожалению, в русскоязычной литературе до сих пор не существовало
учебных пособий или монографий по этой важнейшей и многогранной по
своему применению тематике. Россия кардинально отстает от развитых
стран и по изучению этой дисциплины, и по использованию ее достижений.
Масс-спектрометристам, работающим в России, приходится ориентироваться
на англоязычные издания книг, оригинальные статьи и обзоры. В 2012 г. на
русском языке была издана книга «Принципы масс-спектрометрии в прило-
жении к биомолекулам» под редакцией Дж. Ласкин и Х. Лифшиц (перевод
с английского, изд-во «Техносфера»), представляющая собой сборник статей
ведущих специалистов в области масс-спектрометрии в приложении к биологии.
Книга рассчитана на подготовленных читателей. Она предоставляет
хорошую, во многом, заочную возможность познакомиться с современными
достижениями в области масс-спектрометрии биомолекул, поскольку боль-
шинство описываемых в ней методов пока не используется в нашей стране.
Предлагаемая читателям книга «Основы масс-спектрометрии белков
и пептидов» является первым учебным пособием на русском языке, излагаю-
щим основы масс-спектрометрии белков и пептидов. Книга написана в фор-
мате лекций для начинающих, иллюстрирована большим количеством ри-
сунков, спектров, схем и сопровождается представительным списком цитиро-
ванной литературы. Она рассчитана на студентов и аспирантов химических,
физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет
полезна научным сотрудникам, уже работающим в области исследований
белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.
Цель издания такой книги — заинтересовать молодых исследователей
информативной, очень красивой и востребованной во всем мире дисципли-
ной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для
решения своих собственных фундаментальных и прикладных научных задач.
Основное внимание в учебном пособии уделено методам ионизации бел-
ков и пептидов, процессам фрагментации этих соединений в газовой фазе.
Достаточно подробно рассматриваются вопросы тандемной масс-спектрометрии,
существующие методы инициирования фрагментации. Этот раздел
очень важен в современной масс-спектрометрии. Он полезен для исследова-
телей, работающих с любыми химическими соединениями и биополимерами.
Несколько глав посвящены идентификации белков и пептидов. Сюда входят
варианты автоматизированной идентификации, расшифровка спектров вруч-
ную, описание определенных сложностей масс-спектрометрического секве-
нирования и вариантов их преодоления. Рассмотрены достоинства и недо-
статки двух основных подходов установления химической структуры белков:
масс-спектрометрии «сверху-вниз» и «снизу-вверх». Отдельная глава посвя-
щена вопросам количественного анализа.
Книга посвящена Александру Леонидовичу Курцу и Киму Петровичу
Бутину, двум друзьям, замечательным профессорам химического факульте-
та Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, очень
близких нам в человеческом отношении, непосредственно участвовавшим в
нашем химическом и гуманитарном образовании. Мы всегда высоко оценива-
ли химическую эрудицию и потрясающие личностные качества этих ученых.
Именно общение с этими людьми вдохновило нас в самом начале XXI века
начать исследования в области масс-спектрометрии пептидов.
Использованные сокращения
ББА — бомбардировка быстрыми атомами (Fast Atom Bombardment,
FAB)
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ГХ/МС — газовая хроматография / масс-спектрометрия
ДИП — диссоциация, индуцированная столкновениями с поверхно-
стью (Surface Induced Decomposition, SID)
ДАС — диссоциация, активированная соударениями (Collisionally
Activated Decomposition, CAD)
ДАСПЭ — ДАС при повышенной энергии (Higher-Energy C-trap
Dissociation, HCD)
ДИИАЧТ — диссоциация в результате поглощения инфракрасного
излучения абсолютно черного тела (Blackbody Infrared
Radiative Dissociation, BIRD).
ДИС — диссоциация индуцированная соударениями (Collisionally
Induced Decomposition, CID)
ДЗЭ — диссоциация при захвате электрона (Electron Capture
Dissociation, ECD)
ДПЭ — диссоциации при переносе электрона (Electron Transfer
Dissociation, ETD)
ДОЭ — диссоциация при отрыве электрона (Electron Detachment
Dissociation, EDD)
ЖХ/МС — жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
ДИЭ — диссоциация при ионизации электронами (Electron Ionization
Dissociation, EID)
ДИЭ — диссоциация, индуцированная электронами (Electron
Induced Dissociation, EID)
ДЗВЭ — диссоциация при захвате высокоэнергетических электронов
(Hot ECD, HECD)
ИКМФД — инфракрасная мультифотонная диссоциация (Infra Red
Multi Photon Dissociation, IRMPD)
ИФА — иммуноферментный анализ
МАЛДИ — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)
МС/МС — тандемная масс-спектрометрия
— Метод точных масс и времен удерживания (Accurate Mass
and Time tags, AMT)
РВИ — распад в источнике (In-Source Decay, ISD)
РПИ — распад за пределами источника (Post Source Decay, PSD)
ТСХ — тонкослойная хроматография
УФФД — ультрафиолетовая фотодиссоциация при l = 157 нм
(UV Photodissociation at l = 157 nm)
ФСИДИС — фемтосекундная ионизация/диссоциация, индуцированная
лазером (Femtosecond Laser-Induced Ionization/Dissociation,
fs-LID)
ФТГ — фенилтиогидантоиновое производное аминокислоты
ИЭР — ионизация электрораспылением (Electrospray Ionization, ESI).
CIRCA — Combination of Infrared and Collisional Activation
ERPA — Extended Range Proteomic Analysis — протеомный анализ
в расширенном диапазоне
HECD — Hot ECD диссоциация при захвате высокоэнергетических
электронов
ICAT — Isotope-Coded Affinity Tag
iTRAQ — Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation
NETD — Negative Electron Transfer Dissociation
PSAQ — Protein Standard for Absolute Quantitation
SILAC — Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture
SISCAPA — Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide
Antibodies
TMPP-Ac — N-концевые трис(2,4,6-триметоксифенил)фосфониевые
производные
ТМТ — Tandem Mass Tag
Введение
Пептиды (греч. πεπτος — питательный) — семейство веществ, молекулы ко-
торых построены из остатков α-аминокислот, соединенных в цепь пептидны-
ми (амидными) связями –C(O)NH– (рис. 1). Первый синтетический пептид
получил T. Курциус в 1881 г., а термин «пептид» предложен Э. Фишером, ко-
торый к 1905 г. разработал общий метод синтеза этих соединений. Не суще-
ствует строгого различия между пептидами и белками. Считается, что белки
представляют собой пептиды с большой массой и возможной вторичной и
третичной структурой. Обычно природные полипептиды с молекулярной
массой более 5 – 6 тысяч Да (иногда 2 – 3 тысяч Да) называют белками. Эта
граница между белками и пептидами удивительным образом совпадает с со-
временными возможностями масс-спектрометрии. Первичная структура (по-
следовательность аминокислотных звеньев) не изучавшихся ранее пептидов
может быть установлена в результате прямого масс-спектрометрического
анализа исходных молекул. Для новых белков это пока очень сложно (см.
Протеомика «сверху-вниз», «top down», раздел 5.1.2), а положительный ре-
зультат (определение полной последовательности аминокислот) не гаранти-
рован. Часто используется дополнительное расщепление белковых молекул
в результате химических или энзиматических реакций на более мелкие
фрагменты, которые уже изучаются с помощью масс-спектрометрии.
Аминокислотный остаток пептида, несущий свободную аминогруппу, на-
зывается N-концевым, а несущий свободную карбоксильную группу — С-концевым.
Название пептида образуется из названия входящих в его состав
аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно, начиная с N-концевого.
При этом используют тривиальные названия аминокислот, в кото-
рых окончание «ин» заменяется на «ил». Исключением является C-концевой
остаток, название которого совпадает с названием соответствующей амино-
кислоты. Нумерация аминокислотных остатков осуществляется с N-конца.
Для записи первичной структуры пептида (аминокислотной последователь-
ности) используют трехбуквенные и однобуквенные обозначения аминокис-
H2N
H
N
O R2
R1
NH
O R3
H
N
O R4
NH
O R5
O
OH
Рис. 1.1. Структурная формула пентапептида.
лотных остатков (например, ASDFG — аланил–серил–аспарагил–фенилаланил–
глицин). Эти обозначения, а также структуры и массы аминокислотных
остатков самых распространенных природных α-аминокислот представлены
в табл. 4.1. Теоретически существует бесконечное количество аминокислот,
поскольку любое органическое соединение с аминной и карбоксильной груп-
пами является аминокислотой.
Помимо аминокислот, выстроенных в цепочку, в структуре пептидов, и тем
более белков, могут присутствовать определенные модификации, называе-
мые посттрансляционными. Это общее название химических модификаций
белка, синтезированного организмом на основе нуклеотидной последова-
тельности, с образованием новой ковалентной связи. Посттрансляционные
модификации существенно увеличивают разнообразие белков. На сегодняш-
ний день известно более двухсот вариантов посттрансляционной модифика-
ции белков, и, по всей видимости, модификациям подвергается подавляю-
щее большинство белков, причем, один и тот же белок может подвергаться
нескольким различным модификациям. Реализация в организме той или
иной посттрансляционной модификации не может быть установлена на осно-
вании расшифрованного генома. Определение типов модификаций, их мест
в молекуле белка и условий возникновения является задачей протеомики.
Среди простейших модификаций можно отметить окисление метионина до
сульфоксида, образование дисульфидной связи между двумя цистеиновыми
остатками, ацилирование аминогруппы N-конца или С-амидирование
(за-
мена гидрокси- на аминогруппу на С-конце).
Одной из наиболее распространенных посттрансляционных модифика-
ций белков является гликозилирование с образованием гликопептидов (гли-
копротеинов). В случае N-связанных гликанов углевод присоединен к атому
азота боковой цепи остатка аспарагина или аргинина; в O-связанных глика-
нах углеводный фрагмент присоединен к гидроксигруппам боковых цепей
остатков серина, треонина, тирозина или гидроксилизина. Под реакцией
фосфорилирования белков понимают присоединение фосфатной группы через
фосфоэфирную связь (О-фосфорилирование) к гидроксигруппе боковой цепи
остатка серина, треонина или тирозина. Фосфорилированный пептид назы-
вается фосфопептидом. Среди других наиболее распространенных посттрансляционно
модифицированных белков можно выделить сульфопротеины, со-
держащие в своем составе сульфатную группу и липопротеины, образующи-
еся при взаимодействии белков с липидами. Образуются также аддукты пеп-
тидов с самыми разнообразными органическими и металлоорганическими
соединениями, в том числе экотоксикантами. Все эти варианты обусловлены
посттрансляционными модификациями в живых организмах или природны-
ми, физико-химическими факторами. Следует подчеркнуть, что подробное
рассмотрение масс-спектрометрического
поведения посттрансляционно моди-
фицированных пептидов и белков не входит в рамки данного пособия. В не-
которых разделах будет упоминаться возможность определения места пост-
трансляционных модификаций с помощью того или иного подхода. Несколь-
ко подробнее будет рассмотрена проблема раскрытия дисульфидных связей
(раздел 6.5). Для интересующихся вопросами применения масс-спектрометрии
для детектирования и установления положения посттрансляционных
модификаций можно порекомендовать книгу В. Заикина и Дж. Халкета
(V. Zaikin and J. Halket, 2009).
Первые масс-спектры аминокислот получил Клаус Биман в 1958 г.
(K. Biemann et al., 1959) методом ионизации электронами. Основной проблемой
Бимана было перевести полярные термолабильные молекулы в газо-
вую фазу и ввести их в ионный источник. С появлением химической ионизации,
полевой десорбции и полевой ионизации удалось добиться опреде-
ленных успехов в анализе простых пептидов. Однако эксперименты были
трудоемки, характеризовались плохой воспроизводимостью и часто требовали
проведения химической дериватизации исходных соединений для по-
вышения их летучести. Достижения масс-спектрометрии в этой области
в 1958–1978 гг. изложены в исчерпывающей монографии Б.В. Розынова
(Б.В. Розынов, 1978), а варианты дериватизации аминокислот, включая со-
временные, можно найти в книге В.Заикина и Дж. Халкета (V. Zaikin and
J. Halket, 2009).
Возможности электронной и химической ионизации резко уменьшаются
при переходе от аминокислот к пептидам в связи с еще меньшей летучестью
и повышенной термолабильностью этих соединений. Для анализа простей-
ших пептидов этими методами используются различные виды дериватиза-
ции, включая алкилирование, ацилирование, триметилсилилирование и т.д.
(Б.В. Розынов, 1978; V. Zaikin and J. Halket, 2009). Тем не менее, по этим
спектрам уже можно устанавливать последовательность аминокислотных
звеньев (A.A. Kiryushkin et al., 1971; Б.В. Розынов, 1978; C.V. Bradley et al.,
1981).
Глава 1 Методы ионизации молекул
пептидов и белков
Реальный прорыв в масс-спектрометрии пептидов связан с созданием метода
бомбардировки быстрыми атомами в середине 70-х годов ХХ века
(Г.Д. Танцырев, Н.А. Клейменов, 1973; A. Benninghoven et al., 1976). Появи-
лась возможность устанавливать молекулярные массы и последовательность
аминокислотных звеньев олигопептидов с массами в тысячу и более Дальтон
(D.F. Hunt et al., 1981; C.V. Bradley et al., 1982). Еще через 15 лет с появлением
метода ионизации электрораспылением (М.Л. Александров и др., 1984;
C.M. Whitehouse et al., 1985) и матрично-активированной лазерной десорб-
ции/ионизации (M. Karas et al., 1987) масс-спектрометрия стала ключевым
методом установления первичной структуры пептидов. Возникает новая
наука — протеомика (D.C. Liebler, 2002; R. Aebersold, M. Mann, 2003).
1.1. Бомбардировка быстрыми атомами
Основоположником метода ионизации бомбардировкой быстрыми атомами
(ББА, Fast Atom Bombardment, FAB) считают Беннингховена благодаря ра-
боте (A. Benninghoven et al., 1976). Тем не менее, Г.Д. Танцырев опубликовал
свои результаты исследований с применением этого метода существенно
раньше — в 1973 г. (Г.Д. Танцырев, Н.А. Клейменов, 1973).
Принципиальная схема ионизации бомбардировкой быстрыми атомами
представлена на рис. 1.1. Для получения пучка атомов используется «атом-
ная пушка», а в качестве ионизирующих частиц — атомы инертных газов.
На выход ионов анализируемого вещества существенно влияет атомная мас-
са разогнанных частиц первичного пучка. Например, пучок атомов ксенона
эффективнее, чем атомов аргона и, тем более, атомов неона.
Пучок ускоренных атомов с энергией 7–9 кэВ направляется на раствор
анализируемого вещества в матрице, нанесенный на металлическую под-
ложку, расположенную на конце штока прямого ввода. Взаимодействуя с
веществом, атомы создают интенсивный локальный разогрев, в результате
которого молекулы поверхностных слоев отрываются в виде плотного газа,
содержащего положительные и отрицательные ионы, а также нейтральные
частицы, которые могут ионизироваться непосредственно над поверхностью
образца.
Если на шток нанесено сухое вещество, то через короткий промежуток
времени наблюдается резкое падение интенсивности пучка генерируемых
ионов, так как разрушается поверхностный слой кристаллической решетки
вещества. Поэтому используют растворенный образец. Важно, чтобы образец
был именно растворен в матрице. Если истинного раствора нет, качество
спектров значительно ухудшается. Помочь может добавление солюбилизаторов.
Диффузия в жидкой матрице протекает достаточно быстро для того,
чтобы обеспечить постоянную концентрацию молекул образца на поверхно-
сти. В этом случае пучки ионов образца достаточной интенсивности могут
генерироваться в течение длительного времени ( > 20 мин). В качестве рас-
творителя (матрицы) используется широкий круг мало летучих соединений;
чаще других — глицерин и м-нитробензиловый
спирт.
Хотя важнейшим достоинством ББА является возможность получать масс-
спектры высокомолекулярных соединений, это не такой мягкий метод иони-
зации, как полевая десорбциия или электрораспыление.
Бомбардировка об-
разца быстрыми атомами обеспечивает передачу молекулам энергии в ши-
роком диапазоне. В результате, наряду с пиками молекулярных ионов в
спектре наблюдаются интенсивные пики осколочных и перегруппировочных
ионов, что позволяет в ряде случаев не прибегать к тандемной масс-спектрометрии
для изучения фрагментации и структуры анализируемых молекул.
Масс-спектры ББА характеризуются четноэлектронными ионами типа
MH+ и [M – H]–, но не М+• и М–•. Отчасти это является результатом ионно-
молекулярных реакций, протекающих в плазме над поверхностью образца,
отчасти перенос протона происходит еще в жидкой матрице. Использование
в качестве растворителя материалов с бóльшей основностью приводит к обра-
зованию ионов [M + матрица]+. Качество спектров можно повышать добавка-
Ar+
Ar0
Атомная
пушка
Шток Анализатор
Образец на
наконечнике
штока
Ионы
Выделение и
фокусировка
Рис. 1.1. Принципиальная схема ионизации бомбардировкой быстрыми атомами.
ми, вызывающими образование ионов непосредственно в жидкой фазе. До-
бавки кислот приводят к увеличению интенсивности пиков в спектрах поло-
жительных ионов соединений с центрами основности, а добавки щелочей ис-
пользуются для увеличения выхода отрицательных ионов в спектрах соеди-
нений с кислотными группами. В частности, полипептиды с избытком
оснóвных аминокислот ( K.L. Busch et al., 1982 ) характеризуются спектрами
положительных ионов с интенсивными пиками МН+. В спектрах полипепти-
дов с избытком кислотных групп интенсивность этого пика мала, тогда как
пики депротонированных молекул, напротив, весьма интенсивны. Иногда
полезно добавлять к образцу неорганические соли. Например, добавка NaCl
к образцам полипептидов или олигосахаридов в глицериновой матрице
(M. Barber et al., 1982 ) приводит к образованию интенсивных пиков ионов
[M + Na]+.
Бомбардировка быстрыми атомами позволяет надежно устанавливать
величины m/z молекулярного и фрагментных ионов. Время анализа невели-
ко. Однако поскольку диапазон регистрируемых масс обычно не превышает
2000 Да, а для анализа необходимо иметь не менее 100 пикомолей чистого
образца, он может применяться только для анализа олигопептидов, причем
предварительно очищенных. м-Нитробензиловый спирт оказался наилуч-
шей матрицей для этой цели. В качестве растворителя образца используют
смесь воды и ацетонитрила с возможными добавками метанола, уксусной и
трифторуксусной
кислот. Хотя ББА не является «мягким» методом иониза-
ции, и в обычном масс-спектре наблюдается представительный ряд пиков
фрагментных ионов, для целей определения последовательности аминокис-
лотных звеньев в пептиде лучше использовать тандемную масс-спектрометрию.
В качестве иона предшественника выбирается протонированная моле-
кула пептида, фрагментация которой иницируется соударениями с атомами
инертного газа (см. далее «Методы инициирования фрагментации молекулярных
ионов», раздел 4.3). С широким внедрением в практику методов
матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации и ионизации элек-
трораспылением бомбардировка быстрыми атомами используется все реже,
а большинство коммерческих масс-спектрометров выпускается уже без соот-
ветствующих опций.
1.2. Матрично-активированная лазерная
десорбция/ионизация
Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ,
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) впервые описан во вто-
рой половине 80-х годов прошлого века ( M. Karas et al., 1985; M. Karas et al.,
1987; K.Tanaka et al., 1988 ). Основные достижения в разработке этого метода
принадлежат Ф. Хилленкампу и М. Карасу. В 1988 г. были опубликованы ре-
зультаты анализа белков с массами до 70 000 Да (M. Karas, F. Hillenkamp,
1988 ), а в 1990 г. — уже до 116 000 Да (B. Spengler, R.S. Cotter., 1990 ). Рекорд-
ные для масс-спектрометрии массы однозарядных ионов в несколько милли-
онов Дальтон (F. Hillinkamp et al., 2002) были зарегистрированы именно с
помощью матрично активированной лазерной десорбции/ионизации. Одно-
му из первооткрывателей метода Коичи Танаке (K. Tanaka) в 2002 г. присуж-
дена Нобелевская премия в области химии.
Метод МАЛДИ обладает высочайшей чувствительностью (уровень атто-
(10–18 ) и зепто- (10–21 ) молей), не требует сложной пробоподготовки и позволяет
работать с гетерогенными образцами. Одной из разновидностей
МАЛДИ, методом десорбционной ионизации с кремния (Desorption/Ionization
on Silicon, DIOS), установлен абсолютный рекорд чувствительности любого
аналитического метода. Пик молекулярного иона дез-Arg9-брадикинина с
изотопным расщеплением зарегистрирован для 800 йоктомолей (480 моле-
кул) этого пептида (S.A. Trauger et al., 2004 ). Повторить этот результат пока
никому
не удалось, но регистрация аналитов в зептомолярных (10–21) коли-
чествах описана многими исследователями.
Метод позволяет установить молекулярную массу пептида или белка в сот-
ни тысяч Дальтон с точностью 0.5 – 0.01 %. Для него характерны протониро-
ванные молекулы МН+ и аддукты с катионами щелочных металлов. В спек-
трах неочищенных от солей образцов пики ионов [M + Na]+ и [M + K]+ часто
имеют более высокую интенсивность, чем МН+. Метод удобен для скрининго-
вого анализа, например, для установления молекулярных масс протеолити-
ческих пептидов в смеси после энзиматического расщепления белка. Особенно-
стью метода является образование, прежде всего, однозарядных ионов. Ин-
тенсивности пиков двух- и трехзарядных ионов существенно ниже (рис. 1.2).
Тем не менее, с увеличением молекулярной массы образца до 105 – 106 Да
наблюдаются и многозарядные ионы (Y. Cai et al., 2002 ). Образованию мно-
гозарядных ионов способствует также использование неметаллических под-
ложек (V. Frankevich et al., 2003) или источников МАЛДИ с высоким давле-
нием (P.B. O’Connor, C.E. Costello, 2001).
Теория МАЛДИ объясняет преимущественное наблюдение однозарядных
ионов реакциями первичных многозарядных ионов с нейтральными молеку-
лами матрицы, электронами и анионами в зоне шлейфа (M. Karas et al.,
2000). Поскольку эти процессы эффективнее, когда в них вовлечены многоза-
рядные ионы, выживают, в основном, именно однозарядные.
Важнейшими варьируемыми параметрами метода являются природа ма-
трицы, количественное соотношение матрица/анализируемое соединение,
длина волны, долгота импульса и мощность лазерного излучения, способ
пробоподготовки и т.д. (F. Hillenkamp and J. Peter-Katalinic, 2007).
Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами об-
разца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения
в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее мо-
лекулы активно поглощали фотоны, эмиттируемые
УФ- или ИК-лазером.
В качестве матриц наиболее часто используют
2,5-дигидроксибензойную и
α-циано-4-гидроксикоричную кислоты, хотя в опубликованных на сегодняш-
ний день работах описаны уже сотни разнообразных
матриц. 2,5-Дигидроксибензойная
кислота, характеризующаяся незначительными фоновыми пика-
ми в области низких масс, особенно эффективна для получения спектров лег-
ких соединений с молекулярной массой до 1000 Да. Молярное соотношение
матрица/анализируемое вещество обычно составляет от 10 :1 до 50000 :1 и
оптимизируется для каждого нового образца. Важно, чтобы во время высу-
шивания нанесенного на подложку образца, произошла сокристаллизация
вещества матрицы и анализируемого соединения.
Короткий световой импульс лазера поглощается молекулами матрицы
и разрушает ее кристаллическую структуру. Часть молекул отрывается от
поверхности и образует высокотемпературный суперплотный газ (зона шлей-
фа), в котором помимо молекул, ионов и ассоциатов матрицы присутству-
ют молекулы анализируемого соединения (см. рис. 1.3 на цветной вставке).
В зоне шлейфа образуется газовая плазма, в которой протекают процессы
вторичной ионизации. Механизмы этих реакций включают протонирование
и депротонирование, перезарядку и присоединение аниона или катиона.
m/z
20 000 40 000 60 000 80 000 100 000 120 000 140 000
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
Интенсивность, отн. ед.
66431
33224
132453
Рис. 1.2. Спектр МАЛДИ мономера (m/z 66 431) и димера (m/z 132 453) амбулина
бычьей сыворотки.
Ионизация
аналита, протекающая путем поглощения энергии фотонов или
в результате ионно-молекулярных реакций, приводит к образованию поло-
жительных и отрицательных ионов, которые вытягиваются высоким потен-
циалом ( ~ 25 кВ) из области ионизации и направляются в анализатор.
Практически во всех коммерческих приборах используется времяпролет-
ный анализатор, поскольку он характеризуется и неограниченным диапазо-
ном масс, и наибольшей скоростью регистрации масс-спектра, а основной за-
дачей МАЛДИ является как раз получение информации о молекулярной
массе высокомолекулярных соединений. Кроме того, именно времяпролет-
ные приборы лучше других работают с импульсными методами ионизации и
обладают высочайшей чувствительностью, поскольку все образовавшиеся в
результате ионизации ионы достигают детектора. Спектры после каждого
лазерного импульса могут суммироваться для получения качественной ин-
формации о молекулярной массе соединения. Обычно для приемлемого ре-
зультата оказывается достаточно 30 – 50 лазерных импульсов.
К недостаткам метода можно отнести тот факт, что некоторые незначимые
ингредиенты неочищенных смесей иногда дают очень интенсивные пики в
спектрах. Эти пики могут маскировать наличие действительно важных для
исследователя компонентов, т.е. МАЛДИ не является методом количествен-
ного анализа. Методы очистки проб для последующего МАЛДИ анализа
описаны в обзоре (Y. Xu et al., 2003).
1.3. Ионизация электрораспылением
Первая работа по вводу водных растворов органических соединений в масс-
спектрометр была выполнена под руководством Л.Н. Галль и опубликована
в 1984 г. (М.Л. Александров и др., 1984). Предложенный авторами метод
ЭРИАД (экстракция ионов из раствора при атмосферном давлении) явился
не чем иным, как прообразом одной из наиболее популярных сегодня масс-
спектрометрических техник ионизации – ионизация электрораспылением
(ИЭР, Еlectrospray Ionization, ESI). Тем не менее, Нобелевская премия в
2002 г. была присуждена Дж. Фенну (J.B. Fenn) как создателю метода иони-
зации электрораспылением для ввода жидкой пробы в масс-спектрометр.
Следует подчеркнуть, что его первая работа по этой тематике (M. Yamashit
and J.B. Fenn, 1984) со ссылкой на раннюю работу М. Доуля (M. Dole et al.,
1968) была опубликована в том же 1984 г., но позднее.
Метод ионизации электрораспылением позволяет вводить образец непо-
средственно в ионный источник или с предварительным разделением его
при прохождении через колонку жидкостного хроматографа. Поток жидко-
сти (см. рис. 1.4 на цветной вставке) направляется в иглу диаметром 0.1 мм,
на которую подается высокое напряжение порядка 3 – 7 кВ. На выходе из
иглы в источнике ионов образуется аэрозоль из заряженных капель с высо-
ким поверхностным зарядом. Эти капли движутся к противоэлектроду, име-
ющему потенциал Земли. В том же направлении уменьшается и давление,
хотя в этой части ионного источника (до противоэлектрода) давление поддер-
живается на уровне атмосферного. По мере движения к входному отверстию
первого сепаратора капли уменьшаются в размере за счет испарения раство-
рителя. Достигая критического размера, при котором силы поверхностного
натяжения далее не могут противостоять силам кулоновского отталкивания
(предел Релея), капля «взрывается» с образованием более мелких капелек.
Этот процесс повторяется. В итоге возникают микрокапли, содержащие все-
го одну заряженную частицу, которая может оказаться в газовой фазе после
испарения остаточных молекул растворителя (J.F. Mora et al., 2000).
Альтернативный механизм предусматривает выброс заряженной молекулы
с поверхности одноименно заряженной капли (J.V. Iribarne and
B.A. Thomson, 1976). Недавняя работа, выполненная под руководством Ренато
Зеноби (K. Chingin et al., 2010), является очень весомым аргументом
в пользу этого механизма. Спектроскопические исследования пучка ионов,
образовавшихся при электрораспылении, по мере их движения в масс-спектрометре
показали существование всего двух пиков с разной длиной волны.
Первый из них, очевидно, связан с сольватированными протонированными
молекулами аналита, а второй — со свободными газофазными. В случае по-
степенного уменьшения степени сольватации пик поглощения должен был
быть широким и охватывать весь диапазон сольватированных частиц: от
полностью сольватированнных до свободных ионов в газовой фазе.
В любом случае в газовой фазе оказываются несольватированные молеку-
лы анализируемого вещества, которые проходят через сепаратор и оказывают-
ся в анализаторе. Модификация электрораспыления, названная «наноэлек-
трораспылением», оперирует потоками со скоростями в несколько нл мин–1
и позволяет повысить эффективность образования ионов анализируемого ве-
щества почти на два порядка (M.S. Wilm, M. Mann, 1994). Это особенно важно
для исследования пептидов и белков, поскольку дает возможность значитель-
но сократить количество аналита, необходимое для регистрации качествен-
ного масс-спектра. Работы по созданию и совершенствованию технических
решений метода ионизации электрораспылением ведутся в настоящее время
во многих лабораториях мира. В качестве приема можно предложить статью
Б. Речке и А. Тимпермана и многочисленные ссылки в ней (B.R. Rechke and
A.T. Timperman, 2011).
Помимо высочайшей чувствительности (атто- и зептомоли образца) и воз-
можности работы с термолабильными и нелетучими веществами, иониза-
ция электрораспылением позволила исследователям анализировать соеди-
нения с молекулярными массами до 1.0 × 106 Да и выше (M.A. Tito et al.,
2000). Зафиксированный рекорд составляет 1.1 × 107 Да (R. Chen et al., 1995),
когда в масс-спектрометре с преобразованиями Фурье удалось измерить мо-
лекулярную массу ДНК бактериофага Т4, зарегистрировав молекулярные
ионы с зарядом 28 – 35 тысяч. Все же следует отметить, что электрораспыление
может использоваться c максимальной эффективностью для анализа
соединений с массой до ~ 1.5 × 105 Да. В случае более тяжелых молекул спек-
тры становятся слишком сложными для расшифровки, так как большое чис-
ло пиков многозарядных ионов располагается в сравнительно небольшом
диапазоне (m/z от 500 до 3000).
Поскольку ионы, образующиеся в условиях электрораспыления, обладают
значительно меньшей внутренней энергией, чем, например, в случае
бомбардировки быстрыми атомами, их фрагментация практически не реа-
лизуется, а масс-спектр представляет собой набор пиков, обусловленных про-
тонированными молекулами с разным числом протонов, т.е. с различными
зарядами (точнее [M + nH]n+). Для инициирования фрагментации этих ионов
необходимо использовать тандемную масс-спектрометрию. Типичный масс-
спектр ионизации электрораспылением полипептида (эскулентин 1а с моле-
кулярной массой 4813.6896 Да) представлен на рис. 1.5.
Именно образование многозарядных ионов является важнейшим досто-
инством метода ионизации электрораспылением. Число присоединившихся
протонов зависит от многих факторов. Если говорить о пептидах и белках,
наиболее активно протонируются остатки оснóвных аминокислот (аргинин,
лизин, гистидин и N-концевой атом азота). Практические наблюдения пока-
100
80
60
40
20
0
Интенсивность, отн. ед. m/z
600 700 800 900 1000 1100 1200
580.372
603.095
640.862
688.964
756.913
803.624
865.044 880.491
891.341
1025.560
1039.729
1097.712
1116.605
1147.431
1173.985
1204.935
1247.676
964.348
+8
+7
+6
+5
+4
Рис. 1.5. Многозарядные ионы, образующиеся при электрораспылении в ионной
ловушке пептида эскулентина 1а с молекулярной массой 4813.6896 Да.
зывают, что для электрораспыления характерно присоединение одного про-
тона на участок цепи аминокислот массой в 1000 Да. Таким образом, белок с
молекулярной массой 100 кДа можно зарегистрировать на шкале масс в об-
ласти m/z 1000. Для глобулярных белков, растворенных в воде, предложе-
на формула (1.1) наиболее вероятного заряда (J. Fernandez de la Mora, 2000).
В этом случае использована теория постепенной десольватации органиче-
ского иона в процессе электрораспыления.
Z = 0.078 M 1/2, (1.1)
где Z – заряд, М – молекулярная масса.
Распределение интенсивностей молекулярных ионов в зависимости от
числа присоединившихся протонов позволяет исследовать доступность мест
протонирования и на базе этой информации делать выводы о высших струк-
турах белковых молекул (I.A. Kaltashov, S.J. Eyles, 2005). Еще одним достоин-
ством многозарядных ионов является возможность получения комплементар-
ной информации при активации их фрагментации. Даже обычные спектры
диссоциации, активированной соударением, будут несколько отличаться друг
от друга в зависимости от числа зарядов иона-предшественника. Суммиро-
вание информации при записи этих спектров таких молекулярных ионов по-
зволяет увеличить покрытие сиквенса, что полезно и для идентификации
известных пептидов и белков, и для de novo секвенирования (см. раздел 6.1).
Кроме того, в случае многозарядных ионов появляется возможность исполь-
зования эффективных альтернативных методов активации фрагментации:
диссоциации при захвате электрона и диссоциации при переносе электрона.
К недостаткам метода можно отнести требования высокой гомогенности про-
бы и отсутствия значимых уровней солей (менее 1 миллимоля).
Существуют методы увеличения зарядности белковых ионов, образующих-
ся в условиях ионизации электрораспылением. В частности эффективный
подход связан с небольшими добавками в пробу низколетучих суперзаряжа-
ющих (supercharging) реагентов (A.T. Ivarone et al., 2001; H.J. Sterling et al.,
2010; S. Yin and R. Loo, 2011). Наиболее популярными являются нитробензи-
ловый спирт, сульфолан, диметилацетамид, диметилсульфоксид и т. д. В ре-
зультате таких добавок возрастает степень протонирования пептидов и стано-
вится возможным зарегистрировать полипротонированные молекулы высоко-
молекулярных белков на приборах с небольшим диапазоном масс (рис. 1.6).
При работе на приборах с преобразованием Фурье (орбитальная ловушка и
ионный циклотронный резонанс) пики таких многозарядных ионов характе-
ризуются улучшенным отношением сигнал/шум, повышенным разрешением
и точностью измерения массы (S.G. Valeja et al., 2010). Механизм этого явле-
ния пока не совсем понятен. Наиболее популярная на сегодняшний день ги-
потеза связывает возникновение этого эффекта с изменениями поверхност-
ного натяжения в микрокаплях. Хотя в обычных водных растворах суперзаряжающие
добавки не вызывают значительных структурных изменений
белковых молекул, обогащение микрокапель, образующихся в условиях иони-
зации электрораспылением, мало летучими добавками приводит к химиче-
скому или термическому денатурированию больших молекул в миллисекунд-
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
а
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
б
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
в
100
50
0
600 1000 1400 1800 2200 2600
m/z
г
NO2
OH
Гем+
Гем+
9+
9+
9+
9+
9+
9+
10+
10+
10+
11+
11+
11+
12+
12+
12+
13+
13+
13+
14+
14+
15+
19+ 17+ 15+
10+
10+
8+
8+
8+
8+
7+
7+
*
*
*
* * * *
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Интенсивность,
отн. ед.
Рис. 1.6. Масс-спектры водного ацетатно-аммонийного раствора 20 мкМ миоглобина
с добавками: а — 0.00 %; б — 0.03 %; в — 0.10 %; г — 0.40 % м-нитробензилового
спирта (формула представлена на рис. 1.6а). * — зарядовые состояния ионов апомиоглобина
(H.J. Sterling et al., 2010, с разрешения Springer).
ном временнóм диапазоне. В результате протонированию становятся доступ-
ны новые центры.
Л. Чен (L.C. Chen et al., 2011) продемонстрировал изменение поведения
протонированных молекул в условиях ионизации электрораспылением при
повышенном давлении. В частности, можно понизить спонтанное отщепление
лабильных групп. Например, миоглобин, нековалентно связанный с
железосодержащим порфирином (гемом), легко теряет этот фрагмент в усло-
виях обычного электрораспыления. При повышении давления до 0.4 МПа
в спектре ионизации электрораспылением доминирует пик неразрушенного
комплекса.