eng
Содержание
Содержание
1
Введение в оптическую спектроскопию
1.1
Общие сведения
1.2
История оптической спектроскопии
1.3
Дополнительная литература
2
Основные принципы
2.1
Природа света
2.2
Электромагнитное излучение
2.3
Взаимодействие света и материи
2.3.1
Фундаментальные принципы оптической спектроскопии: атом водорода
2.3.2
Атомы с несколькими электронами
2.3.2.1
Электронные оболочки и периоды
2.3.2.2
Векторная модель, правила Паули и Хунда
2.3.2.3
Атом гелия
2.3.3
Простые молекулы и их спектральные свойства
2.3.3.1
Химическая связь
2.3.3.2
Электронные спектры двухатомных молекул
2.3.3.3
Молекулярные колебания
2.3.3.4
Моменты перехода
2.3.3.5
Вращательный спектр
2.3.3.6
Вращательно-колебательные полосы
2.3.3.7
Вращательные, колебательные и электронные переходы
2.3.3.8
Спектры атомов и молекул, малых и больших: сравнение
2.4
Дополнительная литература
3
Оптика в спектроскопии
3.1
Введение
3.2
Физические световые единицы
3.3
Фотометрические световые единицы
3.4
Источники света
3.4.1
Излучение черного тела
3.4.2
Лампы накаливания
3.4.3
Газоразрядные лампы
3.4.4
Светоизлучающие диоды
3.4.5
Лазеры
3.4.6
Синхротронное излучение (Черенкова)
3.5
Геометрическая оптика и волновая оптика
3.5.1
Преломление и отражение
3.5.2
Формулы Френеля
3.5.3
Линзы и зеркала
3.5.4
Траектория светового луча
3.5.5
Оптические волокна
3.5.6
Шар Ульбрихта или интегрирующая сфера
3.5.7
Модуляторы
3.6
Монохроматоры
3.6.1
Фильтры
3.6.2
Дисперсионные призмы
3.6.3
Дисперсионные решетки
3.7
Фотодетекторы
3.7.1
Фотодетекторы с внешним фотоэффектом
3.7.2
Фотодетекторы с внутренним фотоэффектом
3.7.3
Фотодетекторы с термоэлектрическим эффектом
3.7.4
Фотохимические детекторы
3.8
Кюветы
3.9
Дополнительная литература
4.
Спектроскопия атомов
4.1
Атомно-абсорбционная спектроскопия
4.1.1
Пламенный метод
4.1.2
Метод графитовой печи
4.1.3
Фоновое поглощение
4.2
Атомно-эмиссионная спектроскопия
4.3
Интерференция
4.4
Дополнительная литература
5.
Молекулярная абсорбционная спектроскопия
5.1
Закон Бугера-Ламберта-Бера
5.1.1
Вывод закона
5.1.2
Отклонения от закона
5.1.3
Терминология
5.2
Монохроматоры
5.2.1
Устройство монохроматоров
5.2.2
Типы диспергирующих решеток
5.2.3
Линеаризация длины волны
5.2.4
Типы сканирующих абсорбционных спектрометров
5.2.5
Шум
5.2.6
Фотометрическая ошибка
5.2.7
Рассеяннный свет
5.2.8
Измерение мутных образцов
5.2.9
Спецификация
5.3
Поглощающие свойства молекул
5.3.1
Основные электронные переходы
5.3.2
Комплексы с переносом заряда
5.3.3
Комплексы переходных металлов
5.4
Модификация спектров поглощения
5.4.1
Разностная спектрофотометрия
5.4.2
Гипер- и гипохромизм
5.4.3
Дифференциальная спектрофотометрия
5.4.4
Корреляция
5.4.4.1
Теория
5.4.4.2
Сглаживание
5.4.4.3
Производные
5.4.4.4
Деконволюция
5.4.4.5
Сравнение преобразований Фурье с корреляцией
5.4.5
Спектральный многокомпонентный анализ
5.5
Двухволновая спектрофотометрия
5.5.1
Введение
5.5.2
Методы
5.5.3
Измерение изменений поглощения in vivo вследствие гравитации
5.6
Спектрофотометры специального назначения
5.6.1
Спектрофотометрия остановленного потока
5.6.2
Быстрый спектральный мониторинг
5.7
Дополнительная литература
6.
Люминесцентная спектрофотометрия
6.1
Введение
6.2
Механизмы флуоресценции
6.2.1
Происхождение флуоресценции и фосфоресценции
6.2.2
Диаграммы энергии
6.2.3
От диаграммы энергии к спектрам
6.2.4
Влияние растворителя
6.2.5
Основы квантовой механики
6.2.6
Квантовый выход флуоресценции
6.3
Измерение флуоресценции
6.3.1
Флуориметр
6.3.2
Коррекция спектров флуоресценции
6.3.3
Линейность флуоресцентного сигнала
6.3.4
Мутные образцы и измерения при низких температурах
6.3.5
Дополнительные источники ошибки
6.4
Поляризация и анизотропия
6.4.1
Определения
6.4.2
Перенос энергии
6.4.3
Деполяризация
6.5
Время жизни флуоресценции
6.5.1
Определения
6.5.2
Экспериментальное определение времени жизни флуоресценции
6.5.3
Определение квантового выхода
6.5.4
Тушение флуоресценции
6.6
Отдельные приложения
6.6.1
Редкоземельные элементы и актиноиды
6.6.2
Белки
6.6.3
Метчики и зонды
6.6.4
Хелаты
6.6.5
Определение кальция
6.6.6
Суммарная флуориметрия
6.6.7
Флуоресцентные сенсоры
6.6.8
Импульсно модулированный по амплитуде (ИАМ) флуориметр
6.7
Фосфоресценция
6.8
Хемо- и фотобиолюминесценция
6.8.1
Хемолюминесценция
6.8.2
Биолюминесценция
6.8.2.1
Биолюминесценция жуков-светляков
6.8.2.2
Бактериальная биолюминесценция
6.8.2.3
Катализируемые ферментами системы, продуцирующие пероксид водорода
6.8.2.4
Приборы и оборудование
6.8.2.5
Сверхслабая люминесценция
6.9
Замедленная люминесценция
6.9.1
Теоретические основы
6.9.2
Технические требования
6.9.3
Термолюминесценция
6.10
Дополнительная литература
7
Фотоакустическая спектроскопия
7.1
Введение
7.2
Основной принцип фотоакустической спектроскопии (ФАС)
7.3
Теория фотоакустической спектроскопии
7.3.1
Общие сведения
7.3.2
Фотоакустически определяемые спектры поглощения
7.3.3
Свойства насыщения
7.3.4
Глубинные профили фотоакустических спектров
7.3.5
Измерение фотофизических параметров с помощью ФАС
7.4
Экспериментальные методы
7.5
Фотохимически активные образцы
7.5.1
Модификация ФА сигналов
7.5.2
Частотный спектр ФА сигнала
7.5.3
Хлоропласты
7.6
Некоторые методы ФАС
7.6.1
Фотоакустическая микроскопия
7.6.2
Индуцированная лазером ФАС
7.6.3
Фототермическая радиометрия
7.6.4
Фотоакустическая спектроскопия на основе ИК преобразования Фурье (ИКПФ-ФАС)
7.7
Выводы и перспективы
7.8
Дополнительная литература
8
Рассеяние, преломление и отражение
8.1
Введение
8.2
Упругое рассеяние
8.2.1
Вывод уравнения Рэлея
8.2.2
Определение молекулярной массы (молекулярного веса)
8.2.3
Рассеяние на больших частицах
8.2.4
Рассеяние Фраунгофера
8.2.5
Интенсивность рассеяния IS и размер частицы
8.2.6
Динамическое рассеяние
8.3
Рамановское рассеяние и инфракрасная спектроскопия
8.4
Радуга
8.5
Спектроскопия отражения
8.5.1
Теоретические основы
8.5.2
Некоторые практические результаты
8.6
Спектроскопия ослабленногого полного отражения (СОПО)
8.7
Дополнительная литература
9
Круговой дихроизм и оптическое вращение
9.1
Общие правила поляризации света
9.2
Дисперсия оптического вращения (ДОВ)
9.3
Круговой дихроизм (КД)
9.4
Теоретические основы эффекта Коттона
9.5
Спектрометр КД
9.6
Применения
9.7
Эллипсометрия
9.8
Заключительные комментарии
9.9
Дополнительная литература
10.
Спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона
10.1
Введение
10.2
Теория спектроскопии ближнего инфракрасного диапазона
10.3
Инфракрасный спектрометр
10.4
Представление спектров ближней ИК области
10.5
Алгоритмы анализа спектров ближней ИК области
10.6
Применения
10.6.1
Медицина и фармакология
10.6.2
Пластмассы
10.6.3
Солевой состав морской воды
10.7
Выводы
10.8
Дополнительная литература
Приложение 1 Основные физические константы
Приложение 2 Периодическая таблица элементов
Приложение 3 Коэффициенты перевода единиц энергии
1 Введение в оптическую спектроскопию
Bene docet, qui bene distinguit
Правильный выбор означает правильное изучение.
Гораций
1.1 Общие сведения
Термин оптическая спектроскопия (ОС) в данной книге охватывает все типы методов количественного и качественного анализа, основанных на взаимодействии света с живой и неживой материей.
Термин свет означает электромагнитное излучение от дальней области ультрафиолетового диапазона (УФ) до ближней области инфракрасного диапазона (ближняя ИК). На протяжении более чем двухсот лет оптическая спектроскопия применялась в различных областях науки, производства и медицины, в том числе в химии, биологии, физике и астрономии. Высокая специфичность ОС объясняется тем, что каждое вещество обладает своими спектральными свойствами, отличными от спектральных свойств других веществ. Вещества можно анализировать как в количественном, так и в качественном аспектах. В отличие от других методов спектроскопии, таких как ЯМР (ядерный магнитный резонанс), ЭПР (электронный парамагнитный резонанс), Мессбауэровской или масс-спектрометрии, для анализируемых ОС образцов практически нет ограничений. Измерения различных оптических параметров в зависимости от длины волны/энергии излучения ("спектр") или временных параметров ("кинетика") обеспечивают ценную информацию, которую не всегда можно получить другими аналитическими методами.
Оптический спектральный анализ – это хорошо развитый метод. Однако постоянно появляются сообщения о разработках новых спектрометров для новых применений. В зависимости от предъявляемых требований спектрофотометры существенно различаются по размерам, форме, применимости и, в конечном счете, по стоимости. Они бывают предназначены для определенной цели. Поэтому современная тенденция заключается скорее в использовании специализированных спектрофотометров умеренной стоимости, а не громоздких, доступных для всевозможных применений "многоцелевых установок" с наилучшими характеристиками.
Технические параметры современных спектрометров настолько совершенны, что приближаются к пределу, обусловленному известными на сегодняшний день законами физики. По сравнению с другими аналитическими методами оптическая спектроскопия обладает рядом преимуществ:
- Метод ОС не является разрушающим или агрессивным.
- Измерения можно производить с любого расстояния - от нескольких миллиметров до нескольких сот километров (с самолетов и спутников) без физического контакта с образцом. Опасные и недоступные объекты легко поддаются анализу.
- Жидкие образцы также легко исследуются, как твердые или газообразные, независимо от их оптических свойств. Для метода также не важно, является ли объект прозрачным, полупрозрачным или совершенно непрозрачным.
- По ширине охватываемого диапазона фотометрические и кинетические методы перекрывают все другие аналитические методы.
- Такой метод, как фемтосекундная лазерная спектроскопия, позволяет измерять чрезвычайно быстрые реакции, протекающие в фемтосекундной временной шкале ( ).
- Незначительное количество образца в микрометровой области (микроспектроскопия) или очень редкие явления могут быть исследованы методом счета единичных фотонов (измерение нескольких фотонов в секунду).
- С помощью люминесцентных методов определяются чрезвычайно низкие концентрации (менее 10-18 моль/л) веществ.
- Радиоактивные маркеры, применяемые для исследований в биохимических и молекулярно-биологических процессах, все в возрастающей степени заменяются более дешевыми и безопасными люминесцентными маркерами, а оборудование - недорогими люминесцентными спектрометрами.
В настоящей книге будут обсуждены существенные особенности оптической спектроскопии с минимальным описанием сложных теорий, а также различные спектрометрические процессы и аппаратура. Это довольно сложная задача в связи со значительным прогрессом, произошедшим в последнее время в области оптоэлектроники, лазерных технологий и микрокомпьютерной техники. Следует отметить, что книга не является руководством по использованию конкретного спектрофотометра. С этой целью читатель должен обращаться к инструкции производителя.
После краткого описания истории развития оптической спектроскопии в данной главе глава 2 позволит ориентироваться в квантово-теоретичеких концепциях, которые являются основой для понимания спектроскопических свойств материи. Изучение начнется с атома водорода, как простейшей квантово-механической системы, затем будут рассмотрены спектроскопические свойства маленьких, двухатомных молекул, и, наконец, будут изучены сложные молекулы (биологические).
Оптическая спектроскопия неотъемлема от оптической физики. Поэтому в главе 3 даются необходимые основы этой области знаний: определения радиометрических и фотометрических световых единиц, основы оптической геометрии, волновой оптики и оптики элементарных частиц. И, наконец, будет описаны способы генерирования света и его измерения. Будут рассмотрены свойства таких оптических компонентов, как фильтры, зеркала, линзы, оптоволокно, интегрирующие (фотометрические) сферы, а также будут описаны методы диспергирования света с помощью призм, решеток и интерферометров.
В четвертой главе на базе сведений из предыдущих глав будут рассмотрены атомно- абсорбционная спектроскопия (AAС) и атомно-эмиссионная спектроскопия (AЭС) как два варианта атомной спектроскопии.
В пятой главе более детально будут обсуждаться теоретические и практические аспекты молекулярной абсорбционной спектроскопии, которая наиболее широко применяется в качестве аналитического инструмента в различных областях. Будут рассмотрены различные варианты абсорбционных спектрофотометров и методы извлечения информации из полученного спектра.
В шестой главе рассматривается люминесцентная спектроскопия. В отличие от абсорбционной спектроскопии, позволяющей получать параметры молекулы, с помощью люминесцентной спектроскопии можно получить параметры молекулярных систем.
Фотоакустическая спектроскопия (ФАС), при которой определяется теплоотдача, будет рассмотрена в седьмой главе. С помощью ФАС определяются термодинамические взаимодействия, в частности сложных молекулярных систем в биологии, химии и медицине. Кроме того данный метод позволяет осуществлять спектральное сканирование невидимых, находящихся под поверхностью, например кожи или кожуры фрукта, слоев материала.
В восьмой главе будут обсуждены методы измерения и выявления рассеяния различных типов таких, как Релеевское, Рамановское, рассеяние Ми и Фраунгофера, включая спектроскопию отражения и ослабленного полного отражения (ОПО) . Учитывая важность хиральных и стереохимических свойств биомолекул, в девятой главе будут даны основы спектроскопии на основе дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД), хотя оба метода - производные абсорбционной спектроскопии и связаны с главами 5 и 8. Будет рассмотрена также эллипсометрия, построенная на измерении сдвига фаз при отражении поляризованного света от поверхности материала. Данный метод применяется для высокочувствительного анализа биологически важных молекул.
В настоящее время наблюдается настоящий бум применения спектроскопии в ближнем инфракрасном диапазоне (ближняя ИК). Большим спросом пользуются недорогие компьютеризированные спектрометры, работающие в этой области. Они незаменимы при анализах в пищевой и фармацевтической промышленности, медицине, нефтехимии, геологии и экологии. Подчеркнуты дальнейшие технические достижения в этой, все расширяющейся области промышленных исследований. Этой области спектроскопии посвящена глава 10.
Наиболее важные физические константы, используемые в данной книге, приведены в приложении 1. В приложении 2 дается Периодическая таблица элементов, включающая детальное распределение электронов. Кроме того, в приложении 3 приведена таблица перевода различных единиц энергии. В конце каждой главы приводится список дополнительной литературы.
На рис.1.1 представлены все типы оптической спектроскопии, рассматриваемые в данной книге.
Рис.1.1 Обзор всех видов оптической спектроскопии, рассматриваемых в данной книге. Оптическая спектроскопия основана на четырех явлениях: поглощении, отражении, рассеянии и люминесценции, которые образуют фундамент целого ряда последующих дисциплин. Для упрощения фотоакустическая спектроскопия - тип эмиссионной спектроскопии (эмиссия тепла), отнесена здесь к люминесцентной спектроскопии. 1 - оптическая спектроскопия 2 - поглощение 3 - отражение 4 - рассеяние 5 - люминесценция 6 - молекулярное поглощение
7 - атомное поглощение 8 - оптический дихроизм 9 - круговой дихроизм 10 - простое отражение 11 - диффузионное отражение 12 - Релей, Ми, Фраунгофер 13 - Раман 14 - флуоресценция 15 - фосфоресценции 16 - фотоакустика 17 - атомная эмиссия 18 - внешнее отражение 19 - внутренне отражение 20 - замедленная 21 - короткоживущая 22 - термолюминесценция 23 - xемолюминесценция 24 - фотолюминесценция 25 - биолюминесценция 26 - механолюминесценция 27 - спектроскопия возбуждения - эмиссии 28 - спектроскопия с временным разрешением 29 - поляризационная спектроскопия 30 - спектроскопия переноса энергии
1.2 История оптической спектроскопии
В таблице 1.1 представлена история оптической спектроскопии.
Таблица 1.1 История оптической спектроскопии
Дата Этап
1666 Сэр Исаак Ньютон впервые использовал призму для разложения света в спектр
1675 Вышла в свет знаменитая книга Ньютона «Оптика»
1758 Маркграф опубликовал визуальный метод определения вещества на основе изменения цветности пламени (без дисперсии)
1800 Гершель открыл ИК излучение (Англия)
1801 Риттер открыл УФ излучение (Германия)
1802 Волластон с помощью щели и линз впервые осуществил пламенную спектроскопию
1807 Янг, используя двойные щели, доказал волновую природу света; впервые интерпретировав "цвета тонких слоев" и действие оптической решетки
1808 Малюс распознал поляризацию света при отражении
1814 Фраунгофер изобрел спектроскопию с помощью дифракционных решеток (получил 1500 линий в спектре солнечного света)
1817 Янг решил проблему «поляризации отражением», объединив волновые свойства света и свойства элементарных частиц; трансверсальная поляризация
1818 Френель и Гюйгенс соединили волновые свойства света и принцип Гюйгенса
1834 Тальбот спектрально разделил "красный стронций" и "красный литий"; год рождения аналитической оптической спектроскопии
1848 Фуко исследует натрий в электрической дуге (поглощение/эмиссия)
1859 Кирхгофф установил, что длина волны поглощения равна длине волны эмиссии, и открыл натрий в спектре Солнца
1860 Кирхгофф и Бунзен открыли цезий и рубидий
1868 Ангстрем составил список линий спектра Солнца
1868 Кирхгофф и Бунзен открыли на Солнце гелий
1885 Бальмер открыл серию спектральных линий Бальмера в спектре водорода
1887 Эксперименты Майкельсона и Морли положили конец теории эфира
1887 Генри А. Роуланд усовершенствовал экспериментальную спектроскопию применением вогнутой дифракционной решетки; эксперимент Ангстрема 1868 г. получил свое развитие
1888 Роуланд опубликовал первый атлас Солнца («Круг Роуланда»)
1891 Роуланд сравнил спектры всех известных элементов со спектром Солнца и нашел несколько новых линий
1893 Роуланд опубликовал стандартный атлас спектров (сравнение со спектром натрия)
1894 На Земле нашли гелий (на Солнце его нашли в 1868 г.)
1896 Бальмер получил свое первую формулу серий спектральных линий
1887 Томпсон отрыл электрон
1897 Рубенсу впервые удалось выделить ИК излучение, используя многократное отражение от металлических слоев
1911 Резерфорд открыл атомное ядро
1920 Г. Гальбан впервые определил концентрацию молекул посредством "светоэлектрической аппаратуры"
1925 Г.Шайбе, В. Герлах и Е. Швейцер впервые провели количественный спектральный анализ
1926 Г. Ганзен построил первый записывающий двулучевой спектрофотометр по проекту Коха (1912)
1941 На рынке появился знаменитый призменный фотометр Цейса, модель DU. Впервые этот спектрофототометр давал в УФ диапазоне разрешение в 1 нм. Измеренные параметры считывались со шкалы стрелочным указателем.
1972 В.Л.Бутлер, используя монохроматор Cary 14 в сочетании с микрокомпьютером PDP11 Digital Equipment Corp.AF-01, впервые применил спектроскопию в биологических и биохимических исследованиях
(Портрет - см. книгу) Уоррен Ли Бутлер (1925 – 1984 г.г.) один из открывших растительный пигмент фитохром и один из пионеров применения оптической спектроскопии в биологических и биохимических исследованиях
Рис.1.2 Исаак Ньютон первым с помощью стеклянной призмы расщепил параллельный солнечный свет на его составляющие, то есть спектральные цвета.
1 - белый свет 2 - красный 3 - оранжевый 4 - желтый 5 - зеленый 6 - синий 7 – фиолетовый
Слово «спектр» с латинского означает появление или схема. Исаак Ньютон в 1666 г. первым с помощью призмы расщепил солнечный свет на спектральные цвета (см. рис.1.2). В 1758 г. Маркграф впервые, используя окраску цвета пламени, открыл способ визуального определения вещества невооруженным глазом. В 1802 г. Английский физик Волластон объяснил эксперимент Ньютона с призмой, усовершенствовал его и впервые наблюдал многочисленные темные линии в солнечном спектре. В то же время Гершель и Тальбот проводили эксперименты со светом пламени, и в 1834 г. Тальбот спектрально разделил красный цвет пламени стронция и красный цвет лития; что считается зарождением аналитической оптической спектроскопии.
Этот новый метод исследования, названный оптической спектроскопией, развивается с 1834 г. до настоящего времени. Особое внимание следует уделить работе в этой области физики Фраунгофера, который изобрел спектроскопию с помощью дифракционных решеток и получил 1500 линий в спектре солнечного света.
Фраунгофер был из очень бедной семьи и с малых лет работал подмастерьем. Три года он изучал, как шлифовать линзы и зеркала, и очень заинтересовался оптикой. Но так как он смог закончить только младшие классы социальной школы, то не обладал достаточными знаниями. Поэтому изучением оптики Фраунгофер занимался самостоятельно и тайно и применял свои вновь приобретенные знания в изготовлении линз и зеркал, сделав заметные успехи в развитии оптики. Несмотря на очевидные достижения, сообщество ученых и академиков Германии не приняли его в свои ряды. И только много лет спустя они признали его работы и даже присвоили знание профессора физики в Мюнхене.
Рис.1.3 Первый дисперсионный спектроскоп Фраунгофера, 1821 г. (Музей в Мюнхене, Германия)
(Портреты) Дж.фон Фраунгофер (1787 – 1826) Густав Роберт Кирхгофф (1824 – 1887) Макс Планк (1858 – 1947)
Фраунгофер построил высокоразрешающий оптический спектроскоп, который до сих пор хранится в музее Мюнхена (см. рис.1.3). Используя аналогичный спектроскоп в 1859 г., Кирхгофф определил натрий в спектре Солнца (см. рис.1.4) и на основе этого открытия получил знаменитый закон Кирхгоффа: «На данной длине волне и при определенной температуре величина спектральной эмиссии любого объекта равна величине его поглощения».
До 20-го века не было теорий, которые могли бы удовлетворительно объяснить сложное поведение, проявляемое всеми веществами. Наиболее весомый вклад в сегодняшнее понимание спектральных проявлений внесли следующие ученые.
В 1885 г. швейцарский ученый Бальмер открыл серию спектральных линий "Бальмера" в спектре водорода. В 1897 г. английский ученый Томпсон открыл электрон, а в 1911 г. его соотечественник Эрнест Резерфорд открыл атомное ядро. В 1900 г. Макс Планк сформулировал первые законы квантовой теории. Вернер Гейзенберг (1932 г.) и Эрвин Шредингер (1933 г.) получили Нобелевскую премию за пионерские работы по квантовой механике. В дальнейшем концепцию квантовой механики развивали Поль Дирак и Вольфганг Паули (1945 г.), которые также получили Нобелевскую премию. На сегодняшний день квантовая теория хорошо и в известном смысле полностью разработана.
(Портреты) Вернер Карл Гейзенберг (1901 – 1976) Эрвин Шредингер (1887 -1961) Вольфганг Паули (1900 – 1958)
Так как история развития науки переплетена с историей развития методов измерений и анализа, то история оптической спектроскопии в большей степени отражена историей астрономии и, следовательно, историей атомной спектроскопии. Только в конце 19-го века молекулярная спектроскопия становится мощным аналитическим методом. Например, с помощью спектрофотометра, способного обнаруживать характерные "полосы" гемоглобина, можно различить кровь и красители красного цвета, так что сегодня криминалисты могут найти убийцу по маленькой капле крови.
На протяжении многих десятилетий в спектроскопии использовались обычные вольфрамовые лампы накаливания, призмы, дифракционные решетки и детекторы света, которые ограничивали результаты узким диапазоном видимой области между 500 и 700 нм.
До 40-х годов 20-го века было доступно всего несколько типов коммерческих спектрофотометров (спектрофотометр Дженерал Электрик, спектрофотелометр Кенко, модель DM Колеман), к тому же на них было трудно работать и они производились в ограниченном количестве. В то время "измерение" поглощения для определения концентрации производилось визуально последовательным сравнением двух полей, подобно тому как это делается сейчас для проверки цветного видения аномалоскопом Нагеля. Знаменитый фотометр Pulfrich Цейса (было изготовлено несколько тысяч в Германии) нудно и долго работал таким способом с помощью так называемых S-фильтров в видимом диапазоне (интерференционные фильтры с полушириной полосы пропускания 15 – 20 нм). За 1941 г. было опубликовано более 800 статей по определению концентрации клинически важных компонентов крови и других жидкостей организма с использованием подобных спектрофотометров.
Еще в 30-х годах 20-го века была открыта существенная значимость УФ излучения при количественном определении витамина А, поглощающего при 320 – 330 нм Это явилось побудительной причиной создания спектрометра, включающего ультрафиолетовый диапазон. Кэрри и Бэкман создали первый такой спектрометр - знаменитую модель D, продажная цена которой в 1941 г.была 723 доллара США. Для этого прибора был разработан источник только ультрафиолетового излучения - водородная лампа. Кварцевую оптику, не поглощающую в УФ области, в те времена было очень трудно достать, ее использовали в основном в радиосвязи для военных кварцевых генераторов. Был разработан специальный фотоумножитель, чувствительный к УФ области вплоть до 220 нм (широкодоступные на основе оксида цезия были хороши лишь для области длин волн > 600 нм). Серия DU/DU1 таких спектрометров Бекмана, вероятно, одна из наиболее успешных серий в мире, продолжала совершенствоваться вплоть до 1976 г., и было продано более 30000 экземпляров этих приборов.
Параллельно с разработкой УФ - видимых спектрофотометров развивались ИК спектрометры. Однако только после второй мировой войны рынок спектрального аналитического оборудования стал быстро развиваться и совершенствоваться. Вследствие лучшего разрешения и меньшего количества рассеянного света вместо призм стали использоваться дифракционные решетки и двойные монохроматоры с автоматическим сканированием, дающие исправленные спектры, что способствовало их использованию в рутинной аналитической работе. Существенное снижение рассеянного света привело к совершенствованию детектирующих возможностей спектрофотометров на 4 -5 порядков величины.
Вскоре на рынке появились специализированные фотометры, например, для радиометрии, колориметрии или двуволнового анализа. В период значительного снижения цен на компьютеры с конца 70-х годов спектрометры стали изготавливать на базе микрокомпьютеров. Это не только облегчило измерения, но и позволило проводить анализ в непрерывном режиме. Сейчас доступны каждому и легко выполняются сложные виды анализа на основе старых теорий рассеяния Кубелки - Мунка и Фурье или различных методов приближения и корреляций в хемометрии, что используется в ближней ИК области.
Bene docet, qui bene distinguit
Правильный выбор означает правильное изучение.
Гораций
1.1 Общие сведения
Термин оптическая спектроскопия (ОС) в данной книге охватывает все типы методов количественного и качественного анализа, основанных на взаимодействии света с живой и неживой материей.
Термин свет означает электромагнитное излучение от дальней области ультрафиолетового диапазона (УФ) до ближней области инфракрасного диапазона (ближняя ИК). На протяжении более чем двухсот лет оптическая спектроскопия применялась в различных областях науки, производства и медицины, в том числе в химии, биологии, физике и астрономии. Высокая специфичность ОС объясняется тем, что каждое вещество обладает своими спектральными свойствами, отличными от спектральных свойств других веществ. Вещества можно анализировать как в количественном, так и в качественном аспектах. В отличие от других методов спектроскопии, таких как ЯМР (ядерный магнитный резонанс), ЭПР (электронный парамагнитный резонанс), Мессбауэровской или масс-спектрометрии, для анализируемых ОС образцов практически нет ограничений. Измерения различных оптических параметров в зависимости от длины волны/энергии излучения ("спектр") или временных параметров ("кинетика") обеспечивают ценную информацию, которую не всегда можно получить другими аналитическими методами.
Оптический спектральный анализ – это хорошо развитый метод. Однако постоянно появляются сообщения о разработках новых спектрометров для новых применений. В зависимости от предъявляемых требований спектрофотометры существенно различаются по размерам, форме, применимости и, в конечном счете, по стоимости. Они бывают предназначены для определенной цели. Поэтому современная тенденция заключается скорее в использовании специализированных спектрофотометров умеренной стоимости, а не громоздких, доступных для всевозможных применений "многоцелевых установок" с наилучшими характеристиками.
Технические параметры современных спектрометров настолько совершенны, что приближаются к пределу, обусловленному известными на сегодняшний день законами физики. По сравнению с другими аналитическими методами оптическая спектроскопия обладает рядом преимуществ:
- Метод ОС не является разрушающим или агрессивным.
- Измерения можно производить с любого расстояния - от нескольких миллиметров до нескольких сот километров (с самолетов и спутников) без физического контакта с образцом. Опасные и недоступные объекты легко поддаются анализу.
- Жидкие образцы также легко исследуются, как твердые или газообразные, независимо от их оптических свойств. Для метода также не важно, является ли объект прозрачным, полупрозрачным или совершенно непрозрачным.
- По ширине охватываемого диапазона фотометрические и кинетические методы перекрывают все другие аналитические методы.
- Такой метод, как фемтосекундная лазерная спектроскопия, позволяет измерять чрезвычайно быстрые реакции, протекающие в фемтосекундной временной шкале ( ).
- Незначительное количество образца в микрометровой области (микроспектроскопия) или очень редкие явления могут быть исследованы методом счета единичных фотонов (измерение нескольких фотонов в секунду).
- С помощью люминесцентных методов определяются чрезвычайно низкие концентрации (менее 10-18 моль/л) веществ.
- Радиоактивные маркеры, применяемые для исследований в биохимических и молекулярно-биологических процессах, все в возрастающей степени заменяются более дешевыми и безопасными люминесцентными маркерами, а оборудование - недорогими люминесцентными спектрометрами.
В настоящей книге будут обсуждены существенные особенности оптической спектроскопии с минимальным описанием сложных теорий, а также различные спектрометрические процессы и аппаратура. Это довольно сложная задача в связи со значительным прогрессом, произошедшим в последнее время в области оптоэлектроники, лазерных технологий и микрокомпьютерной техники. Следует отметить, что книга не является руководством по использованию конкретного спектрофотометра. С этой целью читатель должен обращаться к инструкции производителя.
После краткого описания истории развития оптической спектроскопии в данной главе глава 2 позволит ориентироваться в квантово-теоретичеких концепциях, которые являются основой для понимания спектроскопических свойств материи. Изучение начнется с атома водорода, как простейшей квантово-механической системы, затем будут рассмотрены спектроскопические свойства маленьких, двухатомных молекул, и, наконец, будут изучены сложные молекулы (биологические).
Оптическая спектроскопия неотъемлема от оптической физики. Поэтому в главе 3 даются необходимые основы этой области знаний: определения радиометрических и фотометрических световых единиц, основы оптической геометрии, волновой оптики и оптики элементарных частиц. И, наконец, будет описаны способы генерирования света и его измерения. Будут рассмотрены свойства таких оптических компонентов, как фильтры, зеркала, линзы, оптоволокно, интегрирующие (фотометрические) сферы, а также будут описаны методы диспергирования света с помощью призм, решеток и интерферометров.
В четвертой главе на базе сведений из предыдущих глав будут рассмотрены атомно- абсорбционная спектроскопия (AAС) и атомно-эмиссионная спектроскопия (AЭС) как два варианта атомной спектроскопии.
В пятой главе более детально будут обсуждаться теоретические и практические аспекты молекулярной абсорбционной спектроскопии, которая наиболее широко применяется в качестве аналитического инструмента в различных областях. Будут рассмотрены различные варианты абсорбционных спектрофотометров и методы извлечения информации из полученного спектра.
В шестой главе рассматривается люминесцентная спектроскопия. В отличие от абсорбционной спектроскопии, позволяющей получать параметры молекулы, с помощью люминесцентной спектроскопии можно получить параметры молекулярных систем.
Фотоакустическая спектроскопия (ФАС), при которой определяется теплоотдача, будет рассмотрена в седьмой главе. С помощью ФАС определяются термодинамические взаимодействия, в частности сложных молекулярных систем в биологии, химии и медицине. Кроме того данный метод позволяет осуществлять спектральное сканирование невидимых, находящихся под поверхностью, например кожи или кожуры фрукта, слоев материала.
В восьмой главе будут обсуждены методы измерения и выявления рассеяния различных типов таких, как Релеевское, Рамановское, рассеяние Ми и Фраунгофера, включая спектроскопию отражения и ослабленного полного отражения (ОПО) . Учитывая важность хиральных и стереохимических свойств биомолекул, в девятой главе будут даны основы спектроскопии на основе дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД), хотя оба метода - производные абсорбционной спектроскопии и связаны с главами 5 и 8. Будет рассмотрена также эллипсометрия, построенная на измерении сдвига фаз при отражении поляризованного света от поверхности материала. Данный метод применяется для высокочувствительного анализа биологически важных молекул.
В настоящее время наблюдается настоящий бум применения спектроскопии в ближнем инфракрасном диапазоне (ближняя ИК). Большим спросом пользуются недорогие компьютеризированные спектрометры, работающие в этой области. Они незаменимы при анализах в пищевой и фармацевтической промышленности, медицине, нефтехимии, геологии и экологии. Подчеркнуты дальнейшие технические достижения в этой, все расширяющейся области промышленных исследований. Этой области спектроскопии посвящена глава 10.
Наиболее важные физические константы, используемые в данной книге, приведены в приложении 1. В приложении 2 дается Периодическая таблица элементов, включающая детальное распределение электронов. Кроме того, в приложении 3 приведена таблица перевода различных единиц энергии. В конце каждой главы приводится список дополнительной литературы.
На рис.1.1 представлены все типы оптической спектроскопии, рассматриваемые в данной книге.
Рис.1.1 Обзор всех видов оптической спектроскопии, рассматриваемых в данной книге. Оптическая спектроскопия основана на четырех явлениях: поглощении, отражении, рассеянии и люминесценции, которые образуют фундамент целого ряда последующих дисциплин. Для упрощения фотоакустическая спектроскопия - тип эмиссионной спектроскопии (эмиссия тепла), отнесена здесь к люминесцентной спектроскопии. 1 - оптическая спектроскопия 2 - поглощение 3 - отражение 4 - рассеяние 5 - люминесценция 6 - молекулярное поглощение
7 - атомное поглощение 8 - оптический дихроизм 9 - круговой дихроизм 10 - простое отражение 11 - диффузионное отражение 12 - Релей, Ми, Фраунгофер 13 - Раман 14 - флуоресценция 15 - фосфоресценции 16 - фотоакустика 17 - атомная эмиссия 18 - внешнее отражение 19 - внутренне отражение 20 - замедленная 21 - короткоживущая 22 - термолюминесценция 23 - xемолюминесценция 24 - фотолюминесценция 25 - биолюминесценция 26 - механолюминесценция 27 - спектроскопия возбуждения - эмиссии 28 - спектроскопия с временным разрешением 29 - поляризационная спектроскопия 30 - спектроскопия переноса энергии
1.2 История оптической спектроскопии
В таблице 1.1 представлена история оптической спектроскопии.
Таблица 1.1 История оптической спектроскопии
Дата Этап
1666 Сэр Исаак Ньютон впервые использовал призму для разложения света в спектр
1675 Вышла в свет знаменитая книга Ньютона «Оптика»
1758 Маркграф опубликовал визуальный метод определения вещества на основе изменения цветности пламени (без дисперсии)
1800 Гершель открыл ИК излучение (Англия)
1801 Риттер открыл УФ излучение (Германия)
1802 Волластон с помощью щели и линз впервые осуществил пламенную спектроскопию
1807 Янг, используя двойные щели, доказал волновую природу света; впервые интерпретировав "цвета тонких слоев" и действие оптической решетки
1808 Малюс распознал поляризацию света при отражении
1814 Фраунгофер изобрел спектроскопию с помощью дифракционных решеток (получил 1500 линий в спектре солнечного света)
1817 Янг решил проблему «поляризации отражением», объединив волновые свойства света и свойства элементарных частиц; трансверсальная поляризация
1818 Френель и Гюйгенс соединили волновые свойства света и принцип Гюйгенса
1834 Тальбот спектрально разделил "красный стронций" и "красный литий"; год рождения аналитической оптической спектроскопии
1848 Фуко исследует натрий в электрической дуге (поглощение/эмиссия)
1859 Кирхгофф установил, что длина волны поглощения равна длине волны эмиссии, и открыл натрий в спектре Солнца
1860 Кирхгофф и Бунзен открыли цезий и рубидий
1868 Ангстрем составил список линий спектра Солнца
1868 Кирхгофф и Бунзен открыли на Солнце гелий
1885 Бальмер открыл серию спектральных линий Бальмера в спектре водорода
1887 Эксперименты Майкельсона и Морли положили конец теории эфира
1887 Генри А. Роуланд усовершенствовал экспериментальную спектроскопию применением вогнутой дифракционной решетки; эксперимент Ангстрема 1868 г. получил свое развитие
1888 Роуланд опубликовал первый атлас Солнца («Круг Роуланда»)
1891 Роуланд сравнил спектры всех известных элементов со спектром Солнца и нашел несколько новых линий
1893 Роуланд опубликовал стандартный атлас спектров (сравнение со спектром натрия)
1894 На Земле нашли гелий (на Солнце его нашли в 1868 г.)
1896 Бальмер получил свое первую формулу серий спектральных линий
1887 Томпсон отрыл электрон
1897 Рубенсу впервые удалось выделить ИК излучение, используя многократное отражение от металлических слоев
1911 Резерфорд открыл атомное ядро
1920 Г. Гальбан впервые определил концентрацию молекул посредством "светоэлектрической аппаратуры"
1925 Г.Шайбе, В. Герлах и Е. Швейцер впервые провели количественный спектральный анализ
1926 Г. Ганзен построил первый записывающий двулучевой спектрофотометр по проекту Коха (1912)
1941 На рынке появился знаменитый призменный фотометр Цейса, модель DU. Впервые этот спектрофототометр давал в УФ диапазоне разрешение в 1 нм. Измеренные параметры считывались со шкалы стрелочным указателем.
1972 В.Л.Бутлер, используя монохроматор Cary 14 в сочетании с микрокомпьютером PDP11 Digital Equipment Corp.AF-01, впервые применил спектроскопию в биологических и биохимических исследованиях
(Портрет - см. книгу) Уоррен Ли Бутлер (1925 – 1984 г.г.) один из открывших растительный пигмент фитохром и один из пионеров применения оптической спектроскопии в биологических и биохимических исследованиях
Рис.1.2 Исаак Ньютон первым с помощью стеклянной призмы расщепил параллельный солнечный свет на его составляющие, то есть спектральные цвета.
1 - белый свет 2 - красный 3 - оранжевый 4 - желтый 5 - зеленый 6 - синий 7 – фиолетовый
Слово «спектр» с латинского означает появление или схема. Исаак Ньютон в 1666 г. первым с помощью призмы расщепил солнечный свет на спектральные цвета (см. рис.1.2). В 1758 г. Маркграф впервые, используя окраску цвета пламени, открыл способ визуального определения вещества невооруженным глазом. В 1802 г. Английский физик Волластон объяснил эксперимент Ньютона с призмой, усовершенствовал его и впервые наблюдал многочисленные темные линии в солнечном спектре. В то же время Гершель и Тальбот проводили эксперименты со светом пламени, и в 1834 г. Тальбот спектрально разделил красный цвет пламени стронция и красный цвет лития; что считается зарождением аналитической оптической спектроскопии.
Этот новый метод исследования, названный оптической спектроскопией, развивается с 1834 г. до настоящего времени. Особое внимание следует уделить работе в этой области физики Фраунгофера, который изобрел спектроскопию с помощью дифракционных решеток и получил 1500 линий в спектре солнечного света.
Фраунгофер был из очень бедной семьи и с малых лет работал подмастерьем. Три года он изучал, как шлифовать линзы и зеркала, и очень заинтересовался оптикой. Но так как он смог закончить только младшие классы социальной школы, то не обладал достаточными знаниями. Поэтому изучением оптики Фраунгофер занимался самостоятельно и тайно и применял свои вновь приобретенные знания в изготовлении линз и зеркал, сделав заметные успехи в развитии оптики. Несмотря на очевидные достижения, сообщество ученых и академиков Германии не приняли его в свои ряды. И только много лет спустя они признали его работы и даже присвоили знание профессора физики в Мюнхене.
Рис.1.3 Первый дисперсионный спектроскоп Фраунгофера, 1821 г. (Музей в Мюнхене, Германия)
(Портреты) Дж.фон Фраунгофер (1787 – 1826) Густав Роберт Кирхгофф (1824 – 1887) Макс Планк (1858 – 1947)
Фраунгофер построил высокоразрешающий оптический спектроскоп, который до сих пор хранится в музее Мюнхена (см. рис.1.3). Используя аналогичный спектроскоп в 1859 г., Кирхгофф определил натрий в спектре Солнца (см. рис.1.4) и на основе этого открытия получил знаменитый закон Кирхгоффа: «На данной длине волне и при определенной температуре величина спектральной эмиссии любого объекта равна величине его поглощения».
До 20-го века не было теорий, которые могли бы удовлетворительно объяснить сложное поведение, проявляемое всеми веществами. Наиболее весомый вклад в сегодняшнее понимание спектральных проявлений внесли следующие ученые.
В 1885 г. швейцарский ученый Бальмер открыл серию спектральных линий "Бальмера" в спектре водорода. В 1897 г. английский ученый Томпсон открыл электрон, а в 1911 г. его соотечественник Эрнест Резерфорд открыл атомное ядро. В 1900 г. Макс Планк сформулировал первые законы квантовой теории. Вернер Гейзенберг (1932 г.) и Эрвин Шредингер (1933 г.) получили Нобелевскую премию за пионерские работы по квантовой механике. В дальнейшем концепцию квантовой механики развивали Поль Дирак и Вольфганг Паули (1945 г.), которые также получили Нобелевскую премию. На сегодняшний день квантовая теория хорошо и в известном смысле полностью разработана.
(Портреты) Вернер Карл Гейзенберг (1901 – 1976) Эрвин Шредингер (1887 -1961) Вольфганг Паули (1900 – 1958)
Так как история развития науки переплетена с историей развития методов измерений и анализа, то история оптической спектроскопии в большей степени отражена историей астрономии и, следовательно, историей атомной спектроскопии. Только в конце 19-го века молекулярная спектроскопия становится мощным аналитическим методом. Например, с помощью спектрофотометра, способного обнаруживать характерные "полосы" гемоглобина, можно различить кровь и красители красного цвета, так что сегодня криминалисты могут найти убийцу по маленькой капле крови.
На протяжении многих десятилетий в спектроскопии использовались обычные вольфрамовые лампы накаливания, призмы, дифракционные решетки и детекторы света, которые ограничивали результаты узким диапазоном видимой области между 500 и 700 нм.
До 40-х годов 20-го века было доступно всего несколько типов коммерческих спектрофотометров (спектрофотометр Дженерал Электрик, спектрофотелометр Кенко, модель DM Колеман), к тому же на них было трудно работать и они производились в ограниченном количестве. В то время "измерение" поглощения для определения концентрации производилось визуально последовательным сравнением двух полей, подобно тому как это делается сейчас для проверки цветного видения аномалоскопом Нагеля. Знаменитый фотометр Pulfrich Цейса (было изготовлено несколько тысяч в Германии) нудно и долго работал таким способом с помощью так называемых S-фильтров в видимом диапазоне (интерференционные фильтры с полушириной полосы пропускания 15 – 20 нм). За 1941 г. было опубликовано более 800 статей по определению концентрации клинически важных компонентов крови и других жидкостей организма с использованием подобных спектрофотометров.
Еще в 30-х годах 20-го века была открыта существенная значимость УФ излучения при количественном определении витамина А, поглощающего при 320 – 330 нм Это явилось побудительной причиной создания спектрометра, включающего ультрафиолетовый диапазон. Кэрри и Бэкман создали первый такой спектрометр - знаменитую модель D, продажная цена которой в 1941 г.была 723 доллара США. Для этого прибора был разработан источник только ультрафиолетового излучения - водородная лампа. Кварцевую оптику, не поглощающую в УФ области, в те времена было очень трудно достать, ее использовали в основном в радиосвязи для военных кварцевых генераторов. Был разработан специальный фотоумножитель, чувствительный к УФ области вплоть до 220 нм (широкодоступные на основе оксида цезия были хороши лишь для области длин волн > 600 нм). Серия DU/DU1 таких спектрометров Бекмана, вероятно, одна из наиболее успешных серий в мире, продолжала совершенствоваться вплоть до 1976 г., и было продано более 30000 экземпляров этих приборов.
Параллельно с разработкой УФ - видимых спектрофотометров развивались ИК спектрометры. Однако только после второй мировой войны рынок спектрального аналитического оборудования стал быстро развиваться и совершенствоваться. Вследствие лучшего разрешения и меньшего количества рассеянного света вместо призм стали использоваться дифракционные решетки и двойные монохроматоры с автоматическим сканированием, дающие исправленные спектры, что способствовало их использованию в рутинной аналитической работе. Существенное снижение рассеянного света привело к совершенствованию детектирующих возможностей спектрофотометров на 4 -5 порядков величины.
Вскоре на рынке появились специализированные фотометры, например, для радиометрии, колориметрии или двуволнового анализа. В период значительного снижения цен на компьютеры с конца 70-х годов спектрометры стали изготавливать на базе микрокомпьютеров. Это не только облегчило измерения, но и позволило проводить анализ в непрерывном режиме. Сейчас доступны каждому и легко выполняются сложные виды анализа на основе старых теорий рассеяния Кубелки - Мунка и Фурье или различных методов приближения и корреляций в хемометрии, что используется в ближней ИК области.