eng
Содержание
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие к изданиюн а русском языке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Предисловие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Авторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .17
Часть I
СТРУКТУРА И ДИНАМИКА БИОМОЛЕКУЛ В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ
Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура,
химическая активность, микросольватация, молекулярное распознавание . . . . . . . . . . . . . 20
1.1.
Введение и исторические предпосылки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.
Экспериментальные устройства и методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.1.
Методы лазерной и СВЧ спектроскопии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.2.
Некоторые экспериментальные средства: масс-спектрометрия,
спектроскопия двойного резонанса. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.3.
Спектроскопия модельных аминокислотных систем. . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.4.
Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот . . 33
1.4.1.
Фенилаланин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.4.2.
Триптофан . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.4.3.
Применение СВЧ спектроскопии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
1.5.
Спектральный анализ пептидных структур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
1.6.
Молекулярное распознавание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
1.7.
Вычисление частот колебаний. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
1.8.
Заключение и перспективы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Глава 2. Исследование электронной структуры кластеров FE—S — центров переноса
электронов в металлопротеинах при использовании анионно фотоэлектронной
спектроскопии в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.1.
Введение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.2.
Экспериментальные методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.2.1.
Электроспрей. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.2.2.
Времяпролетный масс-спектрометр с ионной ловушкой . . . . . . . . . . 76
2.2.3.
Времяпролетная фотоэлектронная спектроскопия. . . . . . . . . . . . . . . 77
2.3.
Внутренняя электронная структура кластера кубана [4Fe—4S] . . . . . . . . . . 77
2.3.1.
Фотоэлектронные спектры комплексов [Fe4S4L4]2– и [Fe4Se4L4]2–. . . 78
2.3.2.
Изучение влияния энергий фотонов и барьеры кулоновского
отталкивания (БКО). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
2.3.3.
Теоретические результаты для кластера [4Fe—4S] . . . . . . . . . . . . . . . 81
2.3.4.
ФЭС спектры и электронные структуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
2.3.5.
Влияние лиганда на энергии связи электронов
и окислительно-восстановительный потенциал . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
2.4.
Влияние концевого лиганда на ядро кубана [4Fe—4S] в системах
со смешанными лигандами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
2.4.1.
Масс-спектрометрическое детектирование реакций замещения
лигандов в растворе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
2.4.2.
Фотоэлектронные спектры для [Fe4S4L4–xLx]2– (x = 0—4) . . . . . . . . . 88
2.4.3.
Влияние концевых лигандов на электроннуюструктуру
и окислительно-восстановительные свойства
кубановых комплексов со смешанными лигандами . . . . . . . . . . . . . . 90
2.4.4.
Наблюдение линейных зависимостей энергии связи
от x в [Fe4S4L4–xL x]2– . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
2.4.5.
Сравнение с окислительно-восстановительными потенциалами
кубана со смешанными лигандами в растворе . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
2.5.
Наблюдение симметричного расщепления двухзарядных комплексов
кубана: [Fe4S4L4]2– (L = Cl, Br, SEt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.5.1.
Диссоциация, индуцированная столкновениями, (ДИС) . . . . . . . . . . 94
2.5.2.
Сравнение ФЭС спектров анионов-предшественников
и анионов-продуктов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
2.5.3.
Механизм симметричного распада: внутрикластерное кулоновское
отталкивание и антиферромагнитное взаимодействие . . . . . . . . . . . . 98
2.5.4.
Эффекты замещения кластеров [4Fe—4S] на [2Fe—2S] в белках . . . . 100
2.6.
Последовательное окисление кластера кубана [4Fe—4S]:
от [4Fe—4S]– к [4Fe—4S]3+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
2.6.1.
Получение чистых и частично координированных кластеров
кубана [4Fe—4S] с применением лазерной десорбции и ДИС . . . . . 101
2.6.2.
Времяпролетный фотоэлектронный спектр Fe4Sn
– (n = 4—6) . . . . . . . 101
2.6.3.
ФЭС Fe4S4Cln– (n = 3,4), Fe4S4Brn– (n = 2—4)и Fe4S4In–
(n = 0—4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
2.6.4.
Электронные структуры Fe4S4L4– и Fe4S6– с ядром кубана [Fe4S4]3+ 107
2.6.5.
Электронная структура Fe4S4L3– (L = Cl, Br, I) с ядром
кубана [Fe4S4]2+ и частичное влияние координации на кубан. . . . . . 108
2.6.6.
Электронные структуры Fe4S4L2– (L = Br, I) и Fe4S5–
с ядромкубана [Fe4S4]+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.6.7.
Электронные структуры Fe4S4I–
и Fe4S4– . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.6.8.
Хранение электронов и последовательное окисление
кластера кубана [4Fe—4S] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
2.7.
Заключение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .112
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Глава 3. Ионно молекулярные реакции и водородно дейтериевый обмен
для структурного исследования биомолекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
3.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
3.2.
Методы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
3.2.1.
Реакции переноса протона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
3.2.2.
Водородно-дейтериевый обмен . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
3.3.
Реакции протонного переноса в газовой фазе. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
3.3.1.
Валентность в газовой фазе и участки протонирования
однопротонированных аминокислот и белков . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
3.3.2.
Многопротонированные пептиды и белки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
3.4.
Водородно-дейтериевый обмен . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
3.4.1.
Обмениваемый водород . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
3.4.2.
Структура пептидов и белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
3.4.3.
Водородно-дейтериевый обмен в нуклеотидах . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
3.5.
Присоединение йодида водорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
3.6.
Заключение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .136
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
Глава 4. Изучение взаимодействия белков и их поведения в масс-спектрометре . . . . . . . . 142
4.1.
Структура белков и их взаимодействия в масс-спектрометрах . . . . . . . . . . 142
4.2.
Электроспрейная масс-спектрометрия биомолекул. . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
4.2.1.
Масс-спектрометрические условия, подобные естественным
условиям для белковых комлексов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
4.2.2.
Наноэлектроспрей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
4.3.
Транспортировка ионов и анализ нековалентных комплексов . . . . . . . . . 150
4.3.1.
Общие аспекты масс-спектрометрии ионов с большими
значениями m/z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
4.3.2.
Транспортировка ионов и внутренняя энергия биомолекул
в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
4.3.3.
Масс-спектрометрия нековалентных комплексов . . . . . . . . . . . . . . 154
4.4.
Некоторые примеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
4.4.1.
Малые белки теплового удара и б-кристаллин. . . . . . . . . . . . . . . . . 156
4.4.2.
Молекулярный шаперонин GroEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
4.4.3.
Исследование рибосом при помощи масс-спектрометрии . . . . . . . . 163
4.5.
Проблемы и перспективы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 166
Глава 5. Структура белка и свертывание в газовой фазе: убихитин и цитохром . . . . 168
5.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
5.2.
Свертывание белка — структура и энергетика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
5.3.
Белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
5.3.1.
Убихитин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
5.3.2.
Цитохром с. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
5.4.
Десорбция/ионизация белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.5.
Методы и оборудование для определения структуры и энергетики
газообразного белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.5.1.
Измерение ионной подвижности. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.5.2.
Водородно-дейтериевый обмен в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.5.3.
Диссоциация при захвате электрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
5.5.4.
Инфракрасная фотодиссоциационная спектроскопия . . . . . . . . . . . 175
5.6.
Из раствора в газовуюфаз у . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
5.7.
Стабильные структуры в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5.7.1.
Убихитин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
5.7.2.
Цитохром . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
5.8.
Обзор и перспективы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Глава 6. Динамическое моделирование фотоионизации
небольших биологических молекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
6.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
6.2.
Методология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
6.2.1.
Поверхность потенциальной энергии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
6.2.2.
Моделирование динамики методом классических траекторий . . . . . 202
6.2.3.
Моделирование начального состояния для одно-
и двухфотонной ионизации. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
6.2.4.
Статистическое приближение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
6.3.
Приложения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
6.3.1.
Системы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
6.3.2.
Влияние сверхбыстрого внутреннего вращения
на фотоионизациюг лицина и триптофана . . . . . . . . . . . . . 206
6.3.3.
Конформационные переходы, вызванные фотоионизацией:
глицин и триптофан . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
6.3.4.
Поток внутренней энергии и ее перераспределение . . . . . . . . . . . . . 211
6.3.5.
Неприменимость РРКМ для быстрых конформационных переходов 213
6.3.6.
Быстрая фрагментация при одно- и двухфотонной ионизации. . . . . 215
6.3.7.
Испытание РРК для быстрой фрагментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
6.4.
Проблемы и возможности для динамического моделирования
процессов масс-спектрометрии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
Глава 7. Внутримолекулярное перераспределение колебательной энергии
и эргодичность распада биомолекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
7.1.
Что мы узнали из органической масс-спектрометрии . . . . . . . . . . . . . . . . 221
7.1.1.
Введение и исторические предпосылки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
7.1.2.
Ранние эксперименты с органическими молекулами
и их согласие со статистической теорией. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
7.1.3.
Современные эксперименты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
7.1.4.
Времена внутримолекулярного перераспределения
колебательной энергии и «нерандомизированный» распад. . . . . . . . 225
7.1.5.
Случаи «изолированных» электронных состояний . . . . . . . . . . . . . . 229
7.2.
Биомолекулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
7.2.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
7.2.2.
Размер белка и его потенциал к неэргодическому поведению. . . 231.
7.2.3.
Структура белка и его потенциал к неэргодичности. . . . . . . . . . . . . 232
7.2.4.
Ионизация и возбуждение биомолекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
7.2.5.
Заключение: «за» и «против» внутримолекулярного
перераспределения колебательной энергии
и эргодического поведения биомолекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
Часть II
АКТИВАЦИЯ, ДИССОЦИАЦИЯ И РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ
Глава 8. Обзор фрагментации пептидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
8.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
8.2.
Обзор известных ионных структур пептидных фрагментов . . . . . . . . . . . . 254
8.3.
Влияние экспериментальных факторов на фрагментациюп ептидов . . . .2 5.7
8.4.
Методы изучения фрагментации пептидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
8.5.
Влияние заряженных центров на фрагментацию. . . . . . . . . . .260
8.6.
Влияние вторичных структур на фрагментациюп ептидов. . . . . .26 5.
8.7.
Применение знаний о фрагментации пептидов для разработки
алгоритма идентификации. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
8.8.
Оставшиеся проблемы и будущие направления . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
Глава 9. Пептидные катион радикалы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
9.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
9.2.
Образование пептидных катион-радикалов из комплексов
ион металла/пептид. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
9.3.
Факторы, стабилизирующие катион-радикалы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .278
9.4.
Фрагментация катион-радикалов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
8
Содержание
9.4.1.
Катион-радикалы аминокислот . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
9.4.2.
Катион-радикалы пептидов, содержащие только глициновые
остатки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
9.4.3.
Катион-радикалы пептидов, содержащие только остатки
глицина и триптофана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284
9.4.4.
Катион-радикалы пептидов, содержащие только остатки
глицина и гистидина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
9.4.5.
Катион-радикалы трипептидов GlyXxxArg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
9.5.
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .300
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300
Глава 10. Фотодиссоциация биомолекулярных ионов: прогресс,
возможности и аспекты, связанные с малыми ионами. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
10.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
10.2.
Спектроскопический подход . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
10.2.1.
Характерные электронные хромофоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
10.2.2.
Исследование координации и сольватации
в УФ/видимом диапазоне . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
10.2.3.
Определение характерных колебательных мод . . . . . . . . . . . . . . 313
10.2.4.
Широкополосные ИК спектры. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
10.2.5.
ИК исследование влияния сольватации
(водородные валентные колебания) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
10.3.
Аспекты активации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324
10.3.1.
Пороговая длина волны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324
10.3.2.
Зависимость энергии инфракрасной
многофотонной диссоциации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
10.3.3.
Фотодиссоциация с временным разрешением. . . . . . . . . . . . . . . 330
10.3.4.
Характерные спектры фотофрагментации
в видимой и УФ области . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
10.4.
Перспективные биомолекулярные приложения. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
10.4.1.
Перспективы спектроскопии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335
10.4.2.
Аспекты активации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 336
10.5.
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .337
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 338
Глава 11. Моделирование переноса энергии и мономолекулярного распада
при диссоциации, индуцированной столкновениями или поверхностью,
методами химической динамики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
11.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
11.2.
Методология моделирований ДИС и ДИП . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342
11.2.1.
Функции потенциальной энергии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343
11.2.2.
Начальные условия траекторий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344
11.3.
Моделирование ДИС . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348
11.3.1.
Столкновения кластеров Al6 и Al13 с атомами инертных газов 348
11.3.2.
Столкновения атомов Ar с N-протонированными
полипептидами глицина и аланина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358
11.4.
Моделирование ДИП. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370
11.4.1.
Поверхности потенциальной энергии для моделирования ДИП 371
11.4.2.
Результаты моделирования ДИП . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
11.5.
Будущие направления . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
Глава 12. Мягкое осаждение ионов: приборы, явления и приложения . . . . . . . . . . . . . . . 390
12.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
12.1.1.
Явления столкновений ионов с поверхностью. . . . . . . . 390
12.2.
Аппаратура для мягкого осаждения ионов: современная
и использовавшаяся прежде . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404
12.2.1.
Манхэттенский проект и разделение изотопов
при помощи масс-спектрометрии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404
12.2.2.
Разделение небольших многоатомных молекул
с использованием секторных приборов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
12.2.3.
Кластеры, полимеры и эксперименты с использованием
не отобранных по массе ионов в квадрупольных
масс-спектрометрах. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
12.2.4.
Исследование ДНК и пептидов с использованием приборов
ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье 412
12.2.5.
Многокаскадные секторные приборы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
12.2.6.
Квадрупольные фильтры масс и линейные ионные ловушки
для разделения белка. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
12.3.
Приложения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
12.3.1.
Приложения мягкого осаждения ионов и рассмотрение
этого метода в качестве препаративной технологии . . . . . . . . . . 417
12.3.2.
Мягкая ионизация для препаративной масс-спектрометрии
биомолекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
12.3.3.
Десорбционная электрораспылительная ионизация
и ее применение для анализа мягкого осаждения . . . . . . . . . . . . 421
12.4.
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .422
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 423
Глава 13. Диссоциация в результате захвата электрона
и другие ионно электронные реакции фрагментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428
13.1.
Введение: история открытия реакций ионов и электронов . . . . . . . . . . 428
13.2.
Диссоциация при захвате электронов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
13.2.1.
Сечение захвата электрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
13.2.2.
Разрыв N—Сб связи. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
13.2.3.
Механизмы ДЗЭ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436
13.2.4.
Интенсивность фрагментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437
13.2.5.
Нейтрализация заряда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
13.2.6.
Катионизированные молекулы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
13.2.7.
Модель «горячего» атома водорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
13.2.8.
Модель сольватации заряда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441
13.2.9.
Механизмы действия электрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
13.2.10.
Механизм водородной связи. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
13.2.11.
Другие типы диссоциации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 449
13.2.12.
Потери малых групп. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
13.2.13.
Диссоциация при захвате горячего электрона (ДЗГЭ) . . . . . . . . 455
13.2.14.
Диссоциация прочных связей в присутствии слабой . . . . . . . . . 456
13.2.15.
Диссоциация при переносе электрона. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 457
13.3.
Диссоциация при отрыве электрона (ДОЭ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 458
13.4.
Приборы с ДЗЭ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459
13.5.
Применение к исследованиям структуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 460
13.5.1.
Определение первичной последовательности . . . . . . . . . . . . . . . 460
13.5.2.
Локализация заряда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462
13.5.3.
Вторичная и третичная структуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462
13.5.4.
Четвертичная структура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462
13.5.5.
ДЗЭ непептидных молекул. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
13.6.
Оставшиеся проблемы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
Глава 14. Биомолекулярные ионно ионные реакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467
14.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467
14.2.
Феноменология ионно-ионных реакций биополимеров . . . . . . . . . . . . 468
14.2.1.
Реакции ионного переноса. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468
14.2.2.
Реакции переноса электрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
14.2.3.
Реакции конденсации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
14.2.4.
Фрагментация в результате ионно-ионных реакций . . . . . . . . . . 479
14.3.
Динамика реакций биоионов с ионами. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489
14.3.1.
Перенос протона и реакции ассоциации. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490
14.3.2.
Перенос электрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 495
14.4.
Оборудование для исследования биоионно-ионных реакций. . . . . . . . . 500
14.5.
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .502
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504
Часть III
ТЕРМОХИМИЯ И ЭНЕРГЕТИКА
Глава 15. Термохимическое изучение биомолекул. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 508
15.1.
Введение и определения. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 508
15.2.
Методы термохимических измерений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
15.2.1.
Метод равновесия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
15.2.2.
Метод брекетинга (скобок) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 511
15.2.3.
Кинетический метод . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512
15.2.4.
Пороговая диссоциация, индуцированная
столкновениями (ПДИС) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516
15.2.5.
Диссоциация инфракрасным излучением
абсолютно черного тела (ДИИАЧТ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .518
15.2.6.
Диссоциация, индуцированная поверхностью( ДИП) . . . . . . 523
15.2.7.
Фотодиссоциация с временным разрешением (ФДВР) . . . . . . . . 526
15.2.8.
Выделение кинетической энергии (ВКЭ)
и распределение выделения кинетической энергии (РВКЭ) . . . . 527
15.2.9.
Излучательная ассоциационная кинетика
и прямое ассоциационное равновесие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529
15.2.10.
Теория и сравнение экспериментальных методов . . . . . . . . . . . 531
15.3.
Приложения и примеры. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
15.3.1.
Реакции переноса протона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
15.3.2.
Термохимия ионов металлов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535
15.3.3.
Термохимия ионных кластеров:
обнаружение солевых мостиков в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . 542
15.4.
Данные термохимии как помощь для масс-спектрометрических
исследований. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 547
Глава 16. Влияние энергии и энтропии на диссоциацию пептидов
и белков в газовой фазе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554
16.1.
Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554
16.2.
Диссоциация многоатомных молекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 555
Содержание 11
16.2.1.
Микроканоническая константа скорости . . . . . . . . . . . . . . . . . . 555
16.2.2.
Тепловая диссоциация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 558
16.3.
Исторический обзор экспериментальных методов измерения
пороговой энергии и энтропии активации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560
16.3.1.
Спектроскопия фотоэлектронных-фотоионнных
совпадений (СФФС) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561
16.3.2.
Фотодиссоциация с временным разрешением (ФДВР) . . . . . . . . 561
16.3.3.
Масс-спектрометрия фотоионизации
с временным разрешением (МСФИВР) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
16.3.4.
Пороговая диссоциация, индуцированная
столкновениями (ПДИС) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
16.4.
Почему сложно определить параметры диссоциации биомолекул . . . . . 565
16.5.
Диссоциация пептидов, индуцированная поверхностью. . . . . . . . . . . . . 567
16.5.1.
Методология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 568
16.5.2.
Примеры. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 570
16.6.
Диссоциация посредством инфракрасного излучения
абсолютно черного тела (ДИИАЧТ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .575
16.6.1.
Общие предпосылки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575
16.6.2.
Преимущества больших молекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577
16.6.3.
Примеры: пептиды и белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 578
16.6.4.
Интерпретация параметров Аррениуса с использованием
теоремы Толмана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 581
16.6.5.
Компенсация энтальпии и энтропии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584
16.7.
Анализ влияния энтропии на реакции ассоциации белков . . . . . . . . . . 587
16.8.
Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .589
Библиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . 590
Предметный указатель . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595
ПРЕДИСЛОВИЕ К ИЗДАНИЮ
НА РУССКОМ ЯЗЫКЕ
Пожалуй, важнейшим достижением масс-спектрометрии за последние 20 лет стало
проникновение в мир биологических природных соединений. Благодаря ионизации
электрораспылением и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации
масс-спектрометрии стали доступны сахара, нуклеиновые кислоты, белки и пептиды,
липиды и прочие биоорганические молекулы. Самые крупные успехи связаны имен-
но с исследованием белков. Благодаря чувствительности, информативности, эксп-
рессности, возможности работать со смесями масс-спектрометрия стала сегодня наи-
более востребованным методом анализа этих важнейших соединений. Уже быстрое и
надежное установление первичной структуры белков, т.е. последовательности амино-
кислотных звеньев, могло бы считаться превосходным результатом. Однако проводи-
мые в XXI веке исследования позволяют изучать и стуктуры более сложных порядков
(от 2 до 4), включая нековалентные взаимодействия белков с образованием надбел-
ковых структур. Масс-спектрометрия оказалась способной устанавливать тип и место
посттрансляционных модификаций, работать с гликопротеинами, липопротеинами,
фосфопротеинами и т.д. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формирова-
ниюв конце прошлого века нового научного направления — протеомики.
Практические достижения масс-спектрометрии белков и пептидов неоспоримы.
Тем не менее, работа со столь большими молекулами, которые ранее были недоступ-
ны классической органической масс-спектрометрии, поставила новые теоретические
вопросы. Справедлива ли квазиравновесная теория для больших молекул? Какова
структура молекулярных и фрагментных ионов пептидов? Отличаются ли структуры
белков и пептидов в газовой фазе и растворе?
Настоящая книга — это собрание статей по основным аспектам, лежащим в осно-
ве масс-спектрометрии биомолекул. Выбранные темы разделены на три части:
1) структура и динамика биомолекул в газовой фазе; 2) активация, диссоциация и
реакционная способность; 3) термохимия и энергетика. К сожалению, в русскоязыч-
ной литературе пока отсутствуют монографии, посвященные масс-спектрометрии
белков и пептидов. Немногочисленные группы масс-спектрометристов, работающие
в России в этой области, ориентируются на англоязычные издания и оригинальные
статьи и обзоры, хотя число наших соотечественников, работающих в масс-спектро-
метрии пептидов за рубежом, очень значительно. В качестве примера можно привес-
ти Романа Александровича Зубарева, создателя метода диссоциации при захвате
электрона и автора одной из глав этой книги. Да и сама Юлия Ласкин имеет россий-
ские корни. Книга рассчитана на продвинутых читателей и будет интересна физико-
химикам, спектроскопистам и биохимикам, работающим с белками и пептидами. Бе-
зусловно, это хорошая возможность познакомиться с современными достижениями в
этой области и для российских масс-спектрометристов, особенно учитывая, что це-
лый ряд описываемых подходов и методов пока не используется в нашей стране.
Президент Всероссийского
масс-спектрометрического общества,
доктор химических наук, профессор
А.Т. Лебедев
Эта книга посвящается памяти Хавы Лифшиц —
одной из пионеров в области химии ионов в газовой фазе
и основ масс-спектрометрии — великого ученого,
великолепного учителя и хорошей подруги.
Джулия Ласкин
ПРЕДИСЛОВИЕ
Изобретение способов перевода биологических молекул в газообразное состояние
при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) и
ионизации электрораспылением (ИЭР) привело к революции в биологической
масс-спектрометрии. Развитие этих методов было очень успешным благодаря свой-
ственным им уникальным аналитическим характеристикам. После их внедрения ста-
ло возможным измерять молекулярные массы с высокой точностью, а также успеш-
но определять последовательности аминокислотных остатков в пептидах. Сейчас с
помощьюмасс-спектрометрии можно получить и сведения о пептидных и белковых
структурах высших порядков. Исключительно высокая чувствительность, высокое
разрешение по массе и быстрота анализа — ключевые факторы, благодаря которым
масс-спектрометрия стала лидером среди аналитических методов, используемых для
идентификации и исследования биомолекул.
Успехи данного направления в значительной степени основаны на принципах
масс-спектрометрии, разрабатываемых с середины 1970-х для малых органических
молекул. Однако, в процессе изучения поведения биомолекул в газовой фазе возник-
ло множество трудностей, связанных с гибкостьюи размером данных объектов. На-
пример, было сложно достигнуть эффективной фрагментации больших молекул тра-
диционными масс-спектрометрическими способами. Исследование фундаменталь-
ных ограничений существующих методов активации ионов привело к развитию но-
вых аналитических подходов к изучениюфр агментации больших молекул в газовой
фазе. Установление механизмов фрагментации молекул и влияния первичной и вто-
ричной молекулярных структур на наблюдаемые спектры диссоциации улучшило
идентификациюбиомолекул в прикладных исследованиях.
Химия биомолекулярных ионов в газовой фазе развилась во множество новых за-
хватывающих научных направлений во многом благодаря большим размерам биомоле-
кул, их конформационной гибкости и их способности существовать в виде многоза-
рядных ионов. Многозарядные биомолекулярные ионы — превосходные объекты для
изучения ионно-ионной химии и процессов, следующих за захватом ионами медлен-
ных электронов. В настоящее время разработаны различные способы получения фено-
менологического понимания образования и фрагментации катион-радикалов с избы-
точным содержанием водорода, молекулярных катион-радикалов и анион-радикалов
пептидов и белков. Разработка новых подходов в термохимии биомолекул, находящих-
ся в газообразном состоянии, и исследование энергетики их диссоциации — главная
тема данного научного направления. Колебательная спектроскопия биомолекулярных
ионов — еще одна быстро развивающаяся область. В свою очередь, новые методы
спектроскопии высокого разрешения были успешно применены к большим молеку-
лярным системам, давая ценную информацию, дополняющую масс-спектрометриче-
ские данные. Химическое взаимодействие биомолекул с твердыми мишенями создает
потенциал для подготовки новых поверхностей для разнообразных приложений в био-
логии и биотехнологии.
Кроме того, существует несколько фундаментальных проблем, связанных с физи-
кой процессов. Например, вопрос эргодичности и/или статистического или нестати-
стического поведения биомолекул при их фрагментации возник в результате разви-
тия нескольких методов диссоциации, включая диссоциацию при захвате электрона
(ДЗЭ) и фотодиссоциацию. Старые вопросы, поставленные много лет назад при ис-
следовании органических молекул, снова вышли на передний план: подвергаются ли
газофазные биомолекулы внутримолекулярному перераспределениюколебательной
энергии (ВПКЭ) перед их диссоциацией? Все ли виды колебаний вовлечены в
ВПКЭ? Существуют ли селективность и реакционная способность, управляемые за-
рядами? Тот факт, что большие белки фрагментируют в масс-спектрометрах за ко-
роткие промежутки времени (что абсолютно необходимо для их анализа и секвени-
рования), несколько удивителен, принимая во внимание наши предыдущие сведения
о диссоциации относительно малых органических молекул в газовой фазе и ее опи-
сание с использованием статистических теорий [Райс-Рампспергер-Кассель-Маркус/
квазиравновесная теория (РРКМ/КРТ) и т.п.].
Настоящая книга — это собрание статей по основным аспектам, лежащим в осно-
ве масс-спектрометрии биомолекул. Выбранные темы разделены на три части:
1) структура и динамика биомолекул в газовой фазе; 2) активация, диссоциация и
реакционная способность; 3) термохимия и энергетика.
Фундаментальная масс-спектрометрия всегда была неразрывно связана с разно-
образием методов газофазной спектроскопии, которые обеспечивают уникальные
подходы к изучениюструктуры и динамики ионов и молекул в газовой фазе. Ультра-
фиолетовая и инфракрасная спектроскопия высокого разрешения, о которой расска-
зано в главе 1, позволяет изучать структуру и динамику индивидуальных конформе-
ров нейтральных биомолекул, помогая в исследовании влияния растворителя на их
свойства, поведения кластеров биомолекул в газовой фазе и молекулярного распо-
знавания. В главе 2 приводится пример исследований переноса электронов в железо-
серных (Fe—S) кластерах с помощьюфотоэл ектронной спектроскопии фотоотщепле-
ния высокого разрешения. В частности, данный метод используется для изучения
влияния растворителя и окружающей среды белка на электронные свойства кластера
кубического типа [4Fe—4S], наиболее распространенного агента для переноса и на-
копления электронов в металлопротеинах.
Ионно-молекулярные реакции и водородно-дейтериевый обмен традиционно ис-
пользовались в масс-спектрометрии для установления структуры частиц. В главе 3
приводится краткий обзор применения этих методов для изучения структуры и кон-
формации биомолекул в газовой фазе. В то время как методы спектроскопии в настоя-
щее время ограничиваются относительно малыми системами, масс-спектрометрия ис-
пользуется даже для исследования четвертичной структуры больших белковых комп-
лексов. Экспериментальные подходы, используемые в таких исследованиях, изложены
в главе 4. Конформации белка и его свертывание в газовой фазе обсуждаются в главе 5.
Понимание динамики белка при отсутствии растворителя важно для отделения влия-
ния растворителя от влияния собственных свойств белков на их поведение в растворе.
Динамика внутримолекулярного перераспределения колебательной энергии
(ВПКЭ) для биомолекул в газовой фазе рассматривается в главах 6 и 7. Классические
траекторные моделирования с использованием полуэмпирических поверхностей по-
тенциальной энергии PM3, описанные в главе 6, способствуют пониманию крайне бы-
строй динамики процессов, следующих за фотоионизацией биомолекул, и примени-
мости статистических теорий к диссоциации этих больших гибких молекул. Исследо-
вание ионной химии пептидов и белков в газовой фазе открыло огромное множество
очень интересных явлений, некоторые из которых (например, диссоциация в результа-
те захвата электронов и фотодиссоциация) были описаны как неэргодические процес-
сы, в которых ВПКЭ отсутствует. Все «за» и «против» ВПКЭ и эргодического поведе-
ния биомолекул по результатам экспериментов рассматриваются в главе 7.
Фрагментация протонированных пептидов в газовой фазе — важное условие для
идентификации пептидов и белков с использованием тандемной масс-спектромет-
рии (МС/МС). Понимание механистических аспектов фрагментации пептидов в за-
висимости от их последовательности и структуры, изложенное в главе 8, играет цен-
тральнуюроль в интерпретации спектров тандемной масс-спектрометрии и мето-
дов оптимизации поиска в базах данных. В большинстве масс-спектрометрических
исследований используются локализованные биомолекулы (протонированные или
катионизированные металлами), рожденные в результате использования мягких ме-
тодов ионизации. Образование и диссоциация пептидных катион-радикалов, опи-
санные в главе 9, — это новая быстро развивающаяся область ионной химии биомо-
лекул в газовой фазе. Такие ионы образуются в результате фрагментации в газовой
фазе комплексов нейтральных пептидов с переходными металлами и различными
органическими лигандами.
Столкновительная активация и многофотонное возбуждение традиционно испо-
льзуются для идентификации биомолекул в различных масс-спектрометрических
приложениях. О текущем положении дел в исследовании многофотонного возбужде-
ния, спектроскопии и фотодиссоциации биомолекул в газовой фазе рассказано в
главе 10. Глава 11 описывает моделирование передачи энергии в столкновениях
ионов с атомарными нейтральными частицами и поверхностями методом классиче-
ских траекторий. Явления, наблюдаемые после столкновений ионов с поверхностью,
и аппаратура, используемая в таких исследованиях, представлены в главе 12 с укло-
ном на осаждение биологических молекул на разнообразные поверхности. Осажде-
ние используется для специфической модификации поверхности при помощи пучка
отобранных по массе ионов любого размера и состава или для разделения и подго-
товки биомолекул на подложках в чистом виде для последующего анализа.
Еще один метод активации ионов в биологической масс-спектрометрии основан
на захвате медленных электронов многозарядными ионами. Диссоциация при захва-
те электрона (ДЗЭ), обсуждаемая в главе 13, открывает разнообразие уникальных ка-
налов диссоциации и обеспечивает информациюо структуре иона в дополнение к
известной из экспериментов по столкновительной диссоциации и многофотонному
возбуждению. В главе 14 представлены фундаментальные принципы ионно-ионной
химии биомолекул. Ионно-ионные реакции обеспечивают средство для управления
зарядовым состоянием многозарядных пептидов и белков. Методики понижения за-
ряда в реакциях многозарядных биомолекул с однозарядными ионами противопо-
ложной полярности разрабатываются в качестве мощного инструмента исследования
структуры пептидов и белков.
Масс-спектрометрия широко используется для термохимических исследований.
Однако изучение термохимии и энергетики диссоциации пептидов и белков является
достаточно проблематичным из-за неприменимости большинства методов, разрабо-
танных для малых и средних по размеру ионов, к интерпретации фрагментации бо-
льших биомолекул. В главе 15 представлен краткий обзор масс-спектрометрических
подходов, используемых для изучения термохимии биомолекул, и изложены текущее
положение в этой области и ограничения существующих методов, с уклоном на
определение сродства биомолекул к протону и ионам щелочных металлов. В главе 16
описаны экспериментальные методы изучения энергетики и энтропийных эффектов
при диссоциации пептидов и белков.
Наконец, мы хотели бы поблагодарить авторов глав, которые потратили свое
время и приложили значительные усилия для подготовки высококачественных ста-
тей для данной книги. Особая благодарность Джину Футреллу за его щедруюпомощь
на различных стадиях проекта и ценные рекомендации по содержаниюнескольких
глав. Мы также благодарны многим другим коллегам, которые предоставили свои
комментарии и предложения по поводу содержания данной книги.
Джулия Ласкин и Хава Лифшиц
АВТОРЫ
Richard L. Beardsley, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Kathrin Breuker, Institute of Organic Chemistry and Center for Molecular Biosciences
Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck, Innrain 52a, A-6020 Innsbruck, Austria.
Guilong Cheng, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
R. Graham Cooks, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
Robert C. Dunbar, Chemistry Department, Case Western Reserve University, Cleveland,
OH 44106.
You-Jun-Fu, Department of Physics, Washington State University, 2710 University Drive,
Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory and
Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O. Box
999, Richland, WA 99352.
R. Benny Gerber, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA 92697;
Department of Physical Chemistry and the Fritz Haber Research Center, The Hebrew University,
Jerusalem 91904, Israel.
Markus Gerhards, Heinrich-Heine Universitдt Diisseldorf, Institut fьr Physikalische
Chemie I, Universitдtstrasse 26.33.O2, 40225 Dьsseldorf, Germany.
Bogdan Gologan, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
M. Kirk Green, McMaster Regional Centre for Mass Spectrometry, Department of
Chemistry, McMaster University, Hamilton, Canada.
William L. Hase, Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University,
Lubbock, TX 79409-1061.
Kristin A. Herrmann, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Amy E. Hilderbrand, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Alan C. Hopkinson, Centre for Research in Mass Spectrometry and the Department of
Chemistry, York University, 4700 Keele Street, Toronto, Ontario, Canada M3J 1P3.
Julia Laskin, Fundamental Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
P.O. Box 999 K8-88, Richland, WA 99352.
Carlito B. Lebrilla, Department of Chemistry, University of California, Davis, CA
95616.
Chava Lifshitz, Department of Physical Chemistry and The Farkas Center for Light Induced
Processes, The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel.
Scott A. McLuckey, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive,
West Lafayette, IN 47907-2084.
Samy O. Meroueh, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre
Dame, Notre Dame, IN 46556-5670.
Asif Rahaman, Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University,
Lubbock, TX 79409-1061.
Carol V. Robinson, The University Chemical Laboratory, University of Cambridge,
Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, United Kingdom.
Dorit Shemesh, Department of Physical Chemistry and The Fritz Haber Research Center,
The Hebrew University, Jerusalem 91904, Israel.
K. W. Michael Siu, Centre for Research in Mass Spectrometry and the Department of
Chemistry, York University, 4700 Keele Street, Toronto, Ontario, Canada M3J 1P3.
Frank Sobott, Structural Genomics Consortium, University of Oxford, Botnar Research
Centre, Oxford OX3 7LD, United Kingdom.
Kihyung Song, Department of Chemistry, Korea National University of Education,
Chongwon, Chungbuk 363-791, Korea.
Jiangping Wang, Department of Chemistry, Wayne State University, Detroit, MI 48202.
Lai-Sheng Wang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University
Drive, Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory
and Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O.
Box 999, Richland, WA 99352.
Ping Wang, Department of Chemistry, The University of Akron, Akron, OH 44325.
Xue-Bin Wang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University
Drive, Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory
and Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O.
Box 999, Richland, WA 99352.
Chrys Wesdemiotis, Department of Chemistry, The University of Akron, Akron, OH
44325.
Justin M. Wiseman, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
Vicki H. Wysocki, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Xin Yang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University Drive,
Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory and Chemical
Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O. Box 999,
Richland, WA 99352.
Qingfen Zhang, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Roman Zubarev, Laboratory for Biological and Medical Mass Spectrometry.
Uppsala University, Box 583, Uppsala S-751 23, Sweden.
18 Авторы
Часть I
СТРУКТУРА И ДИНАМИКА
БИОМОЛЕКУЛ
В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ
Глава 1
Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура,
химическая активность, микросольватация, молекулярное распознавание
Маркус Герхардс
Дюссельдорфский университет
Генриха Гейне,
Институт физической химии I,
Дюссельдорф, Германия
1.1. Введение и исторические предпосылки
Как было уже отмечено в предисловии, перевод больших молекул в газообразное со-
стояние без их диссоциации затруднителен. Изучение такого процесса традиционно
базируется на применении масс-спектрометрических методов. При этом ощущается
недостаток спектроскопической информации об анализируемых молекулах. Для по-
лучения дополнительных сведений об энергиях различных электронных состояний, а
также о структурных и динамических изменениях исследуемых изолированных моле-
кул целесообразно сочетать масс-спектрометриюс различными спектроскопически-
ми методами. Данное предложение вызвано необходимостьюпоиска ответов на сле-
дующие вопросы:
1. Каковы движущие силы свертывания белка или агрегации пептидов?
2. Как сольватация изменяет вторичнуюструктуру пептидов, и как управлять дан-
ным процессом? Корректно ли при моделировании добавлять одну молекулу воды
за другой, чтобы определять структурные изменения белков?
Найдя ответы на эти вопросы на молекулярном уровне, мы сможем понимать и
предсказывать структуры и динамику пептидов. Основная идея данной главы — об-
зор комбинированных спектроскопических и масс-спектрометрических исследова-
ний. В ней будут рассматриваются только нейтральные аминокислоты и пептиды.
Спектроскопия ионов, еще одно быстроразвивающееся направление, в этой главе не
рассматривается.
Как будет отмечено в других главах, большие заряженные молекулы переводятся
в газовуюфазу с помощьюМАЛДИ (Karas и Hillenkamp, 1988), ЭРИ (Fenn и др.,
1989), ЛИФИЖ (лазерно-индуцированного формирования ионов из жидкости) (Kleinekofort
и др., 1996) или других источников. Нейтральные молекулы могут быть де-
сорбированы при помощи нагревания. Однако, в ходе этого процесса чистые амино-
кислоты и пептиды фрагментируют с выбросом молекулы CO2. В данной главе рас-
сматриваются различные способы ввода нейтральных молекул в газовую фазу. Про-
рыв в этой области был достигнут с помощьюизобретения источников с лазерной
десорбцией (см. раздел 1.2) в сочетании со сверхзвуковым охлаждением и лазерной
ионизацией нейтральных десорбированных молекул. Объединение масс-спектромет-
рии отобранных нейтральных молекул (ионизируемых для детектирования в виде ка-
тионов) с методами спектроскопии было инициировано пионерской работой Леви и
его коллег (Cable и др., 1987, 1988a, b; Rizzo и др., 1985, 1986b). Начав с анализа ами-
нокислот при помощи сочетания лазерной десорбции с флуоресцентной спектроско-
пией или резонансной многофотонной ионизацией, группа Леви увеличила размер
исследуемых молекул до трипептидов (Cable и др., 1987, 1988a, b). В результате спек-
троскопических исследований были получены сведения о колебаниях в состоянии
S1, преимущественно в низкочастотной области спектра, вплоть до нескольких со-
тен см-1. Однако, области амида I или амида II, так же как и валентные колеба-
ния NH, не были исследованы. Хотя работа группы Леви привела к фантастическим
спектроскопическим результатам, основной ее недостаток состоит в невозможности
четкой интерпретации полученных спектров. Во-первых, нельзя исключить, что эти
спектры — результат наложения спектров различных изомеров. Во-вторых, компью-
теры, существовавшие в конце 1980-х, не могли быть использованы для достоверно-
го предсказания колебательных спектров разных изомеров. Более того, структуры со-
стояний S1 все еще нельзя предсказать с точностью, доступной для состояний S0.
Даже вычисление энергий и колебаний трипептидов в состоянии S0 для сотен воз-
можных изомеров — задача непосильная для существующих компьютеров. Кроме
того, в этих вычислениях необходимо учитывать ангармоничность колебаний, осо-
бенно для области низких частот. Из-за указанных проблем спектры, полученные
группой Леви, почти невозможно достоверно интерпретировать. С развитием новых
методов спектроскопии (методов двойного резонанса) появилась возможность экспе-
риментально различать изомеры и регистрировать частоты колебаний в областях
амида I или II, так же как и валентные колебания NH. Соответствующие методы бу-
дут рассмотрены в разделе 1.2. К тому же, начиная с 1990-х годов, быстрое увеличе-
ние мощности компьютеров позволило получить достоверные сведения о структурах
изолированных больших молекул в газовой фазе. Как результат технических усовер-
шенствований в конце 1990-х начались исследования динамических моделей амино-
кислот и пептидов. Так возникла новая быстро растущая область научных исследова-
ний, которая будет подробно описана в разделах 1.3—1.6.
Хотя в данной главе в основном рассматриваются различные методы лазерной
спектроскопии, разработки в области СВЧ спектроскопии также будут обсуждаться.
Эти методы позволяют регистрировать спектры высокого разрешения и, на их осно-
ве, получать точнуюинформациюо геометрии молекул.
В следующих разделах рассматриваются различные методы и их приложения, на-
чиная с отдельных динамических моделей и заканчивая пептидами. Обзор остаю-
щихся проблем дается в конце главы.
1.2. Экспериментальные устройства и методы
1.2.1. Методы лазерной и СВЧ спектроскопии
Существует несколько спектроскопических методов анализа основного и возбуж-
денного электронных состояний изолированных биомолекул в газовой фазе. Враща-
тельные и колебательные спектры обеспечивают информацию о структуре исследуе-
мых молекулярных систем. Флуоресцентные методы дают возможность получить ин-
формациюо состояниях S0 и S1 исследуемых аминокислот и пептидов, особенно в
низкочастотной области спектра (см. разделы 1.4—1.6). При использовании флуорес-
центной спектроскопии рассеяния (ФСР) (см. рис. 1.1a) частота лазера возбуждения
постоянна, а флуоресцентное излучение рассеивается, обеспечивая сведения о состоя-
1.2. Экспериментальные устройства и методы 21
нии S0. В лазерно-индуцированной флуоресцентной (ЛИФ) спектроскопии частота ла-
зера возбуждения сканируется, а детектируется полное флуоресцентное излучение
(рис. 1.1b). Данный метод дает информацию о низкочастотных колебаниях возбужден-
ного электронного состояния. Еще один метод определения колебательных частот со-
стояния S1 — резонансная двухфотонная ионизация (РДФИ) (рис. 1.1c). Как и в ЛИФ,
лазер возбуждения сканируется, но для ионизации исследуемых веществ используется
второй фотон того же самого лазера (монохромная РДФИ) или другой ультрафиолето-
вый лазер (бихромная РДФИ). Ионы регистрируются эффективно только тогда, когда
первый лазер настроен на резонанс с колебательным (вращательным) уровнем состоя-
ния S1. Если данный электронно-колебательный уровень существует достаточно долго
в сравнении с длительностьюлазерного импульса, то вероятность поглощения второго
лазерного фотона увеличивается, что приводит к формированиюионов. Необходимо
упомянуть, что в данной главе внимание будет сосредоточено, главным образом, на
исследованиях с применением наносекундных (нс) лазерных систем.
Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
РЛ РДФИ ИК/РДФИ
ЛИФ ИК/РДФИ УФ/УФ
Рис. 1.1. Различные методы лазерной спектроскопии в приложении к изолиро-
ванным аминокислотам и пептидам: a — лазерно-индуцированная флуо-
ресценция (ЛИФ) с анализом колебаний в состоянии S0; b — лазерно-
индуцированная флуоресценция (ЛИФ) с анализом колебаний в состоя-
нии S1; c — резонансная двухфотонная ионизация, в приложении к ис-
следованиюколебаний в возбужденном состоянии; d, e — ИК/РДФИ
метод исследования инфракрасных спектров основного и возбужденного
состояний, соответственно; f — ультрафиолетово-ультрафиолетовое вы-
жигание провалов в приложении к анализу различных изомеров (см. по-
дробнее в тексте)
Основное преимущество метода РДФИ по сравнениюс методом ЛИФ — это воз-
можность объединения спектроскопии с масс-спектрометрией. Таким образом,
ионы, генерированные в процессе РДФИ, можно выбрать по массе и, в результате,
получать информациюоб исследуемых веществах (см. рис. 1.2 и раздел 1.2). В моле-
кулярных пучках, содержащих, главным образом, мономеры, обычно присутствуют и
другие комплексы, например, кластеры этого мономера или кластеры воды, которую
зачастуюневозможно полностьюудалить из газовых коммуникаций. Поэтому
РДФИ-спектроскопия с отбором молекул и комплексов по массе очень полезна в та-
ких экспериментах.
Очень важное направление в изучении валентных колебаний NH, так же как и
колебаний амида I и II, было открыто в результате развития комбинированных мето-
дов с использованием ИК/УФ излучения. В настоящее время используется сочетание
инфракрасной и флуоресцентной (ИК/ЛИФ) спектроскопии с РДФИ (ИК/РДФИ;
см. рис. 1.1d). В обоих методах фотон ультрафиолетового лазера имеет энергию, со-
ответствующую переходу выбранного изомера с электронно-возбужденного на ос-
новной колебательный уровень состояния S0. Сканируя инфракрасный лазер, можно
возбудить различные колебательные моды состояния S0. Если излучение инфракрас-
1.2. Экспериментальные устройства и методы 23
Времяпролетный Микроканальные Ионный
масс-спектрометр пластины сигнал
Цифровой Компьютерный
осциллограф анализ данных
Ионные линзы
Отклонение
по оси y Ультрафиолетовый
ионизирующий лазер
Отклонение
по оси x
Ускоряющие пластины Скиммер Импульсный клапан
в конфигурации Молекулярный
Уайли—Макларена пучок
Область
дрейфа
Молекулы в
пучке гелия
Ультрафиолетовый
Инфракрасный лазер возбуждающий лазер
Рис. 1.2. Экспериментальная установка для исследования молекул методами
РДФИ, ИК/РДФИ или ультрафиолетово-ультрафиолетовой спектроско-
пией выжигания провалов. Ионы, генерированные двумя ультрафиоле-
товыми фотонами, анализируются по массе в линейном времяпролетном
спектрометре. Пептиды вводятся посредством импульсного клапана в
поток инертного газа (He или Ar). Этот клапан можно нагревать. Источ-
ник с лазерной десорбцией также может быть помещен перед клапаном
(не показано)
ного лазера находится в резонансе с некоторым колебательным уровнем состояния
S0, то населенность основного колебательного состояния уменьшается. При запуске
ультрафиолетового лазера после инфракрасного эффективность ультрафиолетового
возбуждения снижается, так как количество молекул в основном состоянии умень-
шилось при резонансном инфракрасном возбуждении. Уменьшение эффективности
возбуждения ультрафиолетовым лазером приводит к снижениюфлуоресцентного
сигнала (в случае с техникой ИК/ЛИФ) или к ослаблениюсигнала РДФИ (в случае
использования метода ИК/РДФИ). Таким образом, оба метода используют получе-
ние инфракрасного спектра выбранного изомера, находящегося в состоянии S0, пу-
тем регистрации интенсивности ЛИФ или РДФИ сигналов как функции выбранной
длины волны инфракрасного фотона. Также, как и РДФИ, метод ИК/РДФИ облада-
ет селективностьюпо массе и структуре. Этот метод также селективен для различных
колебательных уровней состояния S0. Первоначально ИК/РДФИ спектр был зареги-
стрирован Пэйджем и его коллегами (Page и др., 1988). Впоследствии были опуб-
ликованы результаты множества других подобных исследований в этой области
(см. разделы 1.3—1.6), начиная с публикаций Бручи (Riehn и др., 1992), Миками (Tanabe
и др., 1993) и Цвира (Zwier, 1996) и их коллег. В данных работах зачастуювмес -
то термина ИК/РДФИ используются другие названия: ИК/УФ двойного резонанса,
ИК спектроскопия выжигания провалов и спектроскопия депопуляции в результате
ИК возбуждения. Автор этой главы и его коллеги опубликовали первый ИК/РДФИ
спектр области валентных колебаний C=0 (Gerhards и др., 2002). Это стало возмож-
ным благодаря созданиюновой лазерной системы, работающей в наносекундном ре-
жиме, которая генерирует узкуюполосу инфракрасного излучения (шириной менее
0,1 см–1) высокой энергии (~1 мДж; теперь от 4,7 до 10 мкм) (Gerhards и др., 2002;
Gerhards, 2004).
Область валентных колебаний C=O важна, так как колебания амида I и амида II
характеризуют структуру пептидов. Вместо лазера, описанного ранее (Gerhards,
2004), для различных пептидных приложений используется лазер на свободных элек-
тронах (ЛСЭ) (Oepts и др., 1994) (см. разделы 1.3—1.5). Данная лазерная система
очень мощная (обычно ~50 мДж в одном макроимпульсе) и охватывает диапазон
энергий ~40—2200 см–1. Но у нее есть и недостаток: довольно плохое спектральное
разрешение (~15 см–1 для волны ~ 6 мкм).
Еще одна лазерная система для области излучения ~6 мкм (пригодная для иссле-
дований пептидов) была описана Куяновым и др. (Kuyanov et al., 2004). В ней инф-
ракрасное излучение производится стимулированным обратным комбинационным
рассеянием в твердом параводороде при 4 K с накачкой системой ПГ/ПУ (парамет-
рическим генератором / параметрическим усилителем) в ближней области спектра
инфракрасного излучения. В отличие от инфракрасного излучения, получаемого ге-
нерацией разностной частоты (ГРЧ) (Gerhards, 2004), ширина полосы в этом случае
больше (0,4 вместо 0,1 см–1), и энергия на выходе сильно зависит от частоты, варьи-
руясь от 1,7 мДж для длины волны 4,4 мкм до 120 мкДж для длины волны 8 мкм
(Kuyanov и др., 2004).
Инфракрасное излучение в области валентных NH (~3450 см–1) или ОH
(~3650 см–1 — важная для исследования водных кластеров частота) колебаний обыч-
но производится генерацией разностной частоты, ПГ/ПУ (см., например, Huisken и
др. (1993)) или комбинацией СРЧ и ПУ (например, см. Unterberg и др. (2000)). По-
дробно о таком лазере частично рассказано в ссылках о приложениях ИК/ЛИФ и
ИК/РДФИ спектроскопии.
Наконец, необходимо упомянуть, что метод ИК/РДФИ (ИК/ЛИФ) также исполь-
зуют для определения колебательных переходов в электронно-возбужденном состоя-
нии (рис. 1.1е). Данный метод был предложен Эбатой и др. (Ebata, 1996). В соответст-
вии с методом ИК/РДФИ состояние S1 переводится в возбужденное состояние путем
поглощения одного ультрафиолетового фотона, после чего уменьшение населенно-
сти состояния S1, вызванное последующим инфракрасным возбуждением, детектиру-
ется путем регистрации снижения сигнала РДФИ, обусловленным ионизацией вто-
рым ультрафиолетовым фотоном. (В случае использования ИК/ЛИФ метода второй
ультрафиолетовый фотон не нужен, так как регистрируется уменьшение флуоресцен-
ции, являющееся следствием инфракрасного возбуждения.)
Еще один метод двойного резонанса, используемый для анализа пептидов, называ-
ется УФ/УФ спектроскопией выжигания провалов (см. рис. 1.1f). Он был впервые
применен Липертом и Колсоном (Lipert and Kolson, 1989) к кластеру фенол-H2O. В от-
личие от техники ИК/РДФИ, сканируется не инфракрасный, а ультрафиолетовый ла-
зер, в то время как излучение второго ультрафиолетового лазера (запущенного после
первого сканирующего ультрафиолетового лазера) имеет фиксированную длину вол-
ны, соответствующую, например, электронному переходу изомера. Данный метод ис-
пользуется для определения принадлежности различных электронных переходов одно-
му и тому же изомеру. А именно, когда первый (сканирующий) ультрафиолетовый ла-
зер настроен на резонанс с электронным переходом, принадлежащим изомеру, воз-
бужденному вторым лазером, флуоресценция или ионный сигнал, вызванный вторым
ультрафиолетовым лазером, уменьшаются, так как возбуждение первым лазером уже
удалило часть молекул из пучка. В отличие от инфракрасно-ультрафиолетовых мето-
дов, оба лазерных фотона УФ/УФ метода ведут к возникновениюионного или флуо-
ресцентного сигнала. Таким образом, сигналы, образующиеся в результате действия
первого и второго лазеров, необходимо различать. Лазеры обычно запускаются с за-
держкой в 100—300 нс так, чтобы лучи лазеров могли пространственно пересекаться.
Например, если и первый, и второй лазер формируют ионы путем поглощения двух
фотонов, то или 1) разрешение спектрометра должно быть достаточно хорошим для
различения ионов, произведенных этими двумя лазерами, или 2) ионы разделяются
при помощи быстрого переключения высокого напряжения, которым ионы, сформи-
рованные первым лазером, ускоряются в направлении, противоположном направле-
ниюдвижения ионов, сформированных первым лазером.
Методами двойного резонанса ИК/РДФИ и УФ/УФ спектроскопии выжигания
провалов производят селекциюизомеров и идентифицируют различные молекулы по
их инфракрасным спектрам, которые можно регистрировать для всех характерных
колебательных переходов. Еще один метод, с помощьюкоторого получают дополни-
тельнуюинформациюо динамическом поведении молекулы, — это ИК спектроско-
пия изменения популяции (ИКИП) (Dian и др., 2002b), которая, так же как и метод
заполнения провалов, была предложена Цвиром и его коллегами (Dian и др., 2002b,
2004b) (см. рис. 1.3). При использовании данного метода молекулы в молекулярном
пучке возбуждаются дважды. Сначала молекулы возбуждаются непосредственно по-
зади скиммера импульсного клапана в области охлаждения посредством столкнове-
ний. ИК возбуждение какого-либо конформера (например, возбуждение валентного
колебания NH) может привести к формированиюдругого конформера. При дальней-
шим расширении сверхзвуковой струи сохранившееся охлаждение столкновениями
может «заморозить» новуюпопуляцию , индуцированнуюИК возбуждением. Регист-
рация различных популяций производится посредством ЛИФ спектроскопии (или
посредством РДФИ). Сравнением ЛИФ спектров, полученных после ИК возбужде-
ния, со спектрами, полученными без него, определяют изменение популяции. Разли-
чие между методами ИКП и ИК с заполнением провалов заключается в том, что в
первом методе ИК лазер сканируется, а ультрафиолетовый лазер настроен на резо-
нансный перенос одного выбранного конформера. Таким образом, определяется эф-
фективность формирования выбранного изомера в зависимости от ИК возбуждения.
В методе заполнения провалов сканируется ультрафиолетовый лазер, а ИК лазер на-
строен на частоту, соответствующую одному колебательному переходу. В этом случае
количественно исследуется образование различных изомеров в результате ИК воз-
буждения. Эти новые методы были успешно применены к различным молекулам,
включая защищенные аминокислоты (Dian и др., 2002b, 2004a, b) (см. раздел 1.4.).
Для всех вышеупомянутых методов необходим ароматический хромофор. Метод с
инфракрасным излучением и резонансным переносом энергии (ИК/РПЭ), разрабо-
танный Дефрансуа и его коллегами (Lucas и др., 2004), предполагает возможность
регистрации ИК спектров веществ без такого хромофора. Данный метод — это обоб-
щенный метод РПЭ, в котором нейтральная молекула (с большим полным диполь-
ным моментом ј 2D) сталкивается с атомом ксенона, возбужденным до высокого
ридберговского состояния. Столкновение возбужденного атома ксенона с нейтраля-
ми вызывает резонансный перенос электронной энергии, что приводит к формиро-
ваниюанионов. Произведенные дипольно-связанные анионы или даже квадруполь-
но-связанные анионы (ДСА или КСА) имеют дополнительный электрон на очень
размытой орбитали и сохраняют структуру нейтралей-предшественников. Так как
приращение внутренней энергии практически равно нулю, то этот очень мягкий
Валентное
колебание NH
II. Охлаждение III. Ультра-
при I. ИК фиолетовый Уровень
столкновениях накачка зонднулевой
энергии
валентного
колебания NH
Рис. 1.3. а — три изомера NATMA (Ac-Trp-NHMe) (см. подробнее в разделе 1.4);
b, c — схемы инфракрасного перемещения (ИКП) и спектроскопии за-
полнения провалов [21]. При возбуждении выборочно одного изомера
ИК фотоном можно заселить популяции двух других изомеров. После
дальнейшего охлаждения при столкновениях в расширяющемся пучке
охлажденные молекулы B анализируют с помощью ультрафиолетового
лазера. Из-за уменьшения населенности популяции B в результате ИК
возбуждения флуоресцентный сигнал, вызванный ультрафиолетовым ла-
зером, уменьшается (см. рис. 1.14). Сканируя ультрафиолетовый лазер,
можно найти распределение для всех изомеров (спектроскопия заполне-
ния провалов). (Рис. взят из Dian и др. (2002b).)
процесс ионизации происходит без фрагментации даже слабо связанных кластеров.
Из-за влияния дипольного момента нейтрали на ионизациюданный метод чувстви-
телен к массе и структуре частицы. Если исследуемая молекула до РПЭ резонансно
возбуждена ИК фотоном, то остаточная энергия может разрушить слабые межмоле-
кулярные связи в кластерах или привести в ходе диссоциации к разделениюДСА в
результате процесса РПЭ. Таким образом, процесс РПЭ при ИК возбуждении ней-
тралей менее вероятен, чем РПЭ для молекулы, находящейся в основном колебате-
льном состоянии. Данный подход — это очень полезное дополнение к методам, тре-
бующим ароматического хромофора. При помощи этого метода были получены
спектры димера воды и комплекса формамид-вода (Lucas и др., 2004), находящиеся в
очень хорошем согласии с более ранними газофазными исследованиями. В недавней
публикации та же самая группа исследовала формамид и его димер для проверки
пригодности этого метода к исследованию мономеров и прочно связанных кластеров
с энергиями связи боќльшими, чем энергия связи электрона (ЭСЭ) дипольно-связан-
ного аниона (ДСА) (Lucas и др., 2005).
Классический метод определения параметров структуры — это СВЧ спектроско-
пия молекулярных пучков с преобразованием Фурье (СВЧС МП ПФ) (Balle и Flygare
1981; Legon, 1983; Andresen и др., 1990; Harmony и др., 1995; Grabow и др., 1996;
Storm и др., 1996; Suenram и др., 1999). В этом подходе молекулярный пучок расши-
ряется в кювете интерферометра Фабри-Перо и поляризуется коротким СВЧ им-
пульсом, направленным вдоль оси кюветы. Когерентное излучение вращательных
переходов преобразуют в цифровую форму и обрабатывают преобразованием Фурье с
цельюполучения частотного спектра. Метод привлек большое внимание, так как его
можно использовать также и с источниками лазерной абляции (Suenram и др., 1989;
Lessari и др., 2003). Подобно ИК/РПЭ СВЧ спектроскопия требует наличия у иссле-
дуемых частиц дипольного момента. Однако ей не нужен ароматический хромофор.
С ее помощьюможно получить отличное разрешение (в области кГц), но разреше-
ние по массе получить нельзя.
Еще один метод, который является своего рода оптическим аналогом метода
СВЧС МП ПФ, — это вращательная когерентная спектроскопия (ВКС). Это завися-
щий от времени метод с высоким разрешением, основанный на квантовых биениях,
являющихся результатом когерентного возбуждения различных вращательных уров-
ней электронно-колебательного состояния. Квантовые биения образуются при су-
перпозиции вращательных уровней, и их частоты — целые кратные вращательных
констант или их комбинаций. Первоначальные эксперименты были выполнены Бас-
киным, Фелкером и Зевэйлом (Baskin и др., 1986; Felker и др., 1986; Felker, 1992).
Линейно поляризованный пикосекундный лазер с импульсной накачкой возбуждает
молекулы, которые имеют дипольный момент, параллельный поляризации лазера в
нулевой момент времени. Из-за того, что молекулы вращаются с различными скоро-
стями, синхронизация теряется и снова обнаруживается через характерные проме-
жутки времени, связанные с вращательными константами. Такие промежутки време-
ни и соответствующие вращательные константы можно измерять с помощью второго
импульса, задержанного по времени. Таким способом находят вращательные кон-
станты, а, следовательно, и получают информацию о структуре. В контексте данной
главы этот метод использовался только для модельных аминокислотных систем
(Connell и др., 1990), хотя он также применим и к боќльшим системам (см. например,
Weichert и др. (2001) и Riehn (2002)).
Все методы, описанные выше, используют методы молекулярных пучков. Альтер-
нативный подход получения ультрахолодных спектров — использование капелек гелия
для исследования колебательных спектров аминокислот. Вилесов, Тоэннис и их кол-
леги исследовали аминокислоты, например, Trp, Tyr, (Lindinger и др., 1999; Toennies
и Vilesov, 2004), защищеннуюаминокислоту Ac-Trp-NH2 (NATA; см. раздел 1.4) и
триптамин (см. раздел 1.3) (Lindinger и др., 1999; Toennies и Vilesov, 2004), которые
были инжектированы в струюсверхтекучего 4He. Существуют две схемы детектиро-
вания резонансного ультрафиолетового возбуждения: (1) с помощьюрегистрации
ЛИФ, или (2) контроля уменьшения размера капли He. То есть, испарение атомов
He после ионизации аминокислот может регистрироваться масс-спектрометром как
функция длины волны излучения ультрафиолетового лазера. Данный метод в сочета-
нии с ИК возбуждением в области валентных колебаний OH также использовался
для анализа глицина (Huisken и др., 1999) и его димера (Chocholousova и др., 2002).
В случае с глицином все три конформера, наблюдаемые для данной аминокислоты
при помощи СВЧ спектроскопии (см. ниже), были идентифицированы путем срав-
нения с результатами ab initio вычислений высокого уровня (Chocholousova и др.,
2002). В настоящее время расширение прменения метода с каплями He до больших
пептидов — все еще перспектива для будущих исследований. (Для ознакомления с
другими методами, включая ИК/ИК методы двойного резонанса, которые еще не
применялись к аминокислотам, см., например, Douberly и др. (2005)). Интересно об-
ратить внимание на то, что изомеры, наблюдаемые в пучках He, могут отличаться от
наблюдаемых в экспериментах со сверхзвуковой струей. Это является результатом
или очень низких температур (0,38 K) в каплях He, или агрегации He (см. ниже).
Наконец, необходимо упомянуть, что для некоторых аминокислот можно полу-
чить ИК спектры с преобразованием Фурье путем использования источника быстро-
го нагрева (Linder и др., 2005). А именно: при использовании такого метода можно
задержать распад на секунды и детектировать излучение нефрагментировавшей ами-
нокислоты.
1.2.2. Некоторые экспериментальные средства:
масс спектрометрия, спектроскопия двойного резонанса
Основная схема установки, использующей пульсирующуюсверхзвуковуюструюдля
анализа биомолекул в газовой фазе в сочетании со спектроскопией и масс-спектро-
метрией, показана на рис. 1.2. Данная установка (которуютакже используют автор
главы и его коллеги) содержит несколько дифференциально откачиваемых вакуум-
ных камер (как правило, три) для транспортировки исследуемых частиц из источ-
ника к масс-спектрометру. В экспериментах обычно используется времяпролет-
ный масс-спектрометр (ВПМС) одной из двух конструкций: 1) линейной (ЛВПМС)
(рис. 1.2) или 2) рефлектронной (РВПМС) (Mamyrin и др., 1973; Kьhlewind и др.,
1984; Bergmann и др., 1989; Boesl и др., 1992). В схеме с рефлектроном ионы сначала
замедляются, а затем фокусируются в плоскости детектора для коррекции различий в
скоростях ионов одной и той же массы. Анализаторы в ЛВПМС и РВПМС могут
быть ориентированы перпендикулярно или параллельно направлениюмолекулярно -
го пучка. При перпендикулярном расположении масс-анализатора (см. рис. 1.2) вли-
яние различий в скоростях частиц на анализ минимально.
В случае с флуоресцентным спектрометром обычно используется только одна ва-
куумная камера, которая содержит источник и оптику для фокусировки флуоресцен-
тного излучения на детекторе. Для разрешения флуоресцентного спектра между ка-
мерой и детектором помещают монохроматор. Детектором может служить или фото-
умножитель, или камера с прибором с зарядовой связью(ПЗС-камера). При исполь-
зовании ПЗС-камеры можно регистрировать полный спектр для каждого лазерного
выстрела.
Для экспериментов с очень высоким разрешением (электронная спектроскопия с
вращательным разрешением) используется прибор с непрерывным пучком и двумя
скиммерами, что требует приблизительно трех или четырех вакуумных камер с диф-
ференциальной откачкой. Флуоресценция, полученная после возбуждения непре-
рывным кольцевым лазером на красителе с очень высоким разрешением, регистри-
руется на фотоумножителе, сопряженным со счетчиком фотонов (Majewski и Meerts,
1984; Pratt, 1998; Schmitt и др., 2005).
Наиболее важная часть прибора, предназначенная для произведения достаточного
количества недиссоциировавших аминокислот и пептидов, — это источник. Источ-
ники, обсуждаемые в данной главе, формируют только нейтрали. Для перевода ней-
тральных аминокислот и пептидов в газовуюфазу используются, главным образом,
два типа источников. Если используются защищенные аминокислоты (см. ниже), то
применяются специальные источники с нагревом (см. например, Fricke и др., 2004 и
раздел 1.5). В таких источниках расстояние между небольшой камерой, изготовлен-
ной из нержавею щей стали и содержащей исследуемое вещество, и импульсным кла-
паном очень короткое. Кроме того, и камера, и соединители защищены стеклянны-
ми поверхностями. Нагревание в таком источнике должно быть чрезвычайно одно-
родным. Для получения достаточного количества больших пептидов в газовой фазе
могут использоваться температуры ниже 200 °C. В другом устройстве с нагреванием
вещество находится не в области повышенного давления позади клапана, а перед
импульсным клапаном (Snoek и др., 2000). То есть, вещество соприкасается с вакуу-
мом камеры источника. Данная конструкция использовалась для хрупких незащи-
щенных аминокислот (см. например, раздел 1.4.1 (Snoek и др., 2000)). Из-за наличия
вакуума для перевода достаточного количества молекул в газовуюфазу могут исполь-
зоваться температуры ниже 150 °C.
Схожая с нагреванием лазерная десорбция также теперь применяется для перевода
пептидов в газовуюфазу. Сравнение теплового нагрева и лазерной десорбции показы-
вает, что методы с нагреванием более простые и обеспечивают более устойчивый сиг-
нал. При использовании методов уменьшения популяции посредством лазерного воз-
буждения (ИК/УФ, УФ/УФ) — подходов с существенным шумовым сигналом — необ-
ходимо обеспечить стабильнуюбазовуюли ниюдля ионного сигнала, сформированно-
го путем применения УФ лазера фиксированной частоты. Кроме того, количество
необходимого для анализа вещества обычно меньше в случае использования теплового
нагрева. Современные исследования в области усовершенствования лазерных десорб-
ционных источников сосредоточены на решении данных проблем. Если нет способа
перевести пептиды в газовуюфазу нагревом без фрагментации, то лазерная десорб-
ция — это единственная альтернатива. Различные группы исследователей описали
свои десорбционные источники (Grotemeyer и др., 1986; Tembreull и Lubman, 1986,
1987a, b; Cable и др., 1988a, b; Meijer и др., 1990; Cohen и др., 2000; Piuzzi и др., 2000;
Hьnig и др., 2003). Как правило, исследуемое вещество смешивается с матрицой.
В большинстве случаев применяется графит (Meijer и др., 1990; Cohen и др., 2000;
Piuzzi и др., 2000; Hьnig и др., 2003). В современных источниках его прессуют с не-
большим количеством исследуемого вещества. В пионерской спектроскопической ра-
боте группы Леви в качестве матрицы применялся краситель (Cable и др., 1988a, b).
В процессе десорбции матрица поглощает энергиюкороткого лазерного импульса (на-
пример, импульса длительностью10 нс, произведенного лазером на неодимовом стек-
ле — иттрий-алюминиевом гранате, с длиной волны 1064 нм и энергией 1 мДж). Та-
ким образом, матрица нагревается чрезвычайно быстро, и интересующие нас молеку-
лы испаряются из нее в газовую фазу. На следующем этапе молекулы охлаждаются в
молекулярном пучке, формирующемся при расширении инертного газа, напускаемого
через импульсный клапан. Источник расположен непосредственно перед скиммером.
Это может быть вращающийся стержень или диск, покрытый матрицей (или чистым
веществом). Процесс быстрого нагрева с последующим охлаждением настолько эф-
фективен, что пептиды не фрагментируют. Некоторые группы исследователей также
описывают десорбционные источники, использующие чистые вещества (без матрицы)
1.2. Экспериментальные устройства и методы 29
(Tembreull и Lubman, 1986, 1987a, b; Grotemeyer и др., 1996). Данные источники также
упоминаются как источники с абляцией (см. ниже). Основная идея всех десорбцион-
ных источников нейтралей — это разделение процессов ионизации и транспортировки
нейтральных пептидов в газовуюстадиюс последующим охлаждением. Это — общий
подход к решениюпроблемы перевода больших и хрупких молекул в газовуюфазу в
достаточных количествах, что позволяет применять к нейтралям различные спектро-
скопические методы, описанные в разделе 1.2.1.
Источник с лазерной абляцией (Bondybey и English, 1981; Dietz и др., 1981) ис-
пользует в качестве мишени вместо матрицы с исследуемым веществом само чистое
вещество. В результате лазерной абляции на поверхности мишени остаются неболь-
шие дефекты, так как удаляется значительное количество вещества. В большинстве
лазерных экспериментов, представленных в данной главе, используются частоты по-
вторения лазерных импульсов от 10 до 20 Гц. Следовательно, источники с десорб-
цией и абляцией специально конструируются для использования низких частот по-
вторения импульсов. В настоящее время уже существуют абляционные источники,
предназначенные для использования более высоких (килогерцовых) частот (Smits и
др., 2003). Они очень хорошо сочетаются с фемтосекундными лазерными системами,
работающими при частотах повторения импульсов порядка нескольких кГц. Еще
одно интересное приложение — это комбинация источника с лазерной абляцией и
СВЧ спектроскопии (Suenram и др., 1989; Lessari и др., 2003) (см. раздел 1.2.1). Ко-
нечно, использование методов абляции обычно требует большего количества вещест-
ва, что ограничивает их применение для исследования больших пептидов.
1.3. Спектроскопия модельных аминокислотных систем
Применение современных методов двойного резонанса начиналось с модельных сис-
тем. Такие системы, как, например, N-фенилформамид (Manea и др., 1997; Dickinson
и др., 1999; Fedorov и Cable, 2000; Robertson, 2000; Mons и др., 2001; Robertson и
Simons, 2001), 2-фенилацетамид (Robertson и др., 2001) и N-бензилформамид (Robertson
и др., 2000) (см. рис. 1.4), содержат одну связь H—N—C=O, которая может слу-
жить модельюамидной связи в пептиде. Необходимо указать, что данные молекулы
не обеспечивают реалистичного описания пептидной связи, так как она не полно-
стьюидентична связям в аминокислотах или пептидах, а именно: в пептиде атомы
б—C расположены на конце каждой амидной группы, и NH2-группа расположена на
N-конце пептида. Хотя модель исследуемых амидов и несовершенна, она дает воз-
можность получить сведения о структурных особенностях изолированных амидов.
Более того, гидратационные оболочки были подробно исследованы с помощьюэтих
моделей. Ароматический хромофор использовался для всех динамических моделей,
так как этот выбор позволяет применение ИК/РДФИ.
В случае с N-фенилформамидом можно наблюдать цис- и трансизомеры относи-
тельно связи H—N—C=O. Цисизомер немного более стабилен, чем трансизомер
(рис. 1.4a) (Manea и др., 1997; Dickinson и др., 1999). Для N-бензилформамида (Robertson,
2000) трансизомер становится намного более устойчивым (рис. 1.4d), что ти-
пично и для реального пептида (см. ниже). Введение группы CH2 приводит к увели-
чениюгибкости структуры (фенил заменяется на бензил), а также позволяет лучше
моделировать основнуюаминокислотную цепь. В случае с 2-фенилацетамидом (Robertson
и др., 2001) (см. рис. 1.4f) боковая цепь прикреплена к карбонильной функ-
циональной группе, сохраняя первичнуюамиднуюNH 2-группу.
Выбранные модели — хорошие кандидаты для исследования последовательной гид-
ратации. В случае с N-фенилформамидом энергии протон-донорной связи одной мо-
лекулы воды с группой C=O или протон-акцепторной связи с группой N—H почти
30 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
равны (Монс и др., 2001) (рис. 1.4b). В противоположность мономеру, трансизомер
N-фенилформамида более стабилен после гидратации и сохраняется во всех кластерах
с водой (Dickinson и др., 1999; Fedorov и Cable, 2000). Применение накачки излучени-
ем дает возможность исследовать перемещения молекулы воды от одного участка свя-
зи к другому (Clarkson и др., 2005a). В случае с группой, содержащей две молекулы
воды, димеры воды связаны или с C=O, или с группой N—H (Dickinson и др., 1999;
Fedorov и Cable, 2000). Изомер, содержащий группу N—H донора, дополнительно ста-
билизируется в результате взаимодействия O—H р. В случае с кластером с тремя мо-
лекулами воды получается циклическая конфигурация между донорной связью
(C=O H) и акцепторной связью(N—H O) (рис. 1.4c). Такая геометрическая конфи-
гурация напоминает структуру протонной нити (Tanner и др., 2003; Smedarchina и др.,
2000), которая может вести к формированиюамфионных структур в аминокислотах.
В отличие от кластеров N-фенилформамида и воды, цисизомер предпочтителен в
N-бензилформамидной группе гидратированных кластеров. Были получены различ-
ные изомеры моно- и дигидратированного N-бензилформамида, аналогичные N-фе-
нилформамидным кластерам (см. рис. 1.4e) (Robertson и др., 2000). Интересный здесь
элемент — это донорно-акцепторная структура, в которой одна молекула воды связана
одновременно с группами N—H и C=O посредством водородной связи. Опыт, полу-
1.3. Спектроскопия модельных аминокислотных систем 31
2-фенилацетамидТрипта мид
Рис. 1.4. Модельные системы различных аминокислот: a — N-фенилформамид и
его кластер с одной (b) и тремя (c) молекулами воды; d — N-бензилфор-
мамид и его кластер с одной молекулой воды (e); f — 2-фенилацетамид;
g — триптамин. (Рисунок частично взят из Robertson и Simons (2001).)
ченный при анализе данных небольших модельных систем, можно применить для ис-
следования гидратированных аминокислот и пептидов (см. ниже).
Некоторые другие молекулы также можно рассматривать в качестве аналогов
аминокислот (см., например, раннюю работу Martinez и др. (1991, 1993)). Триптамин
(см. рис. 1.4g) был исследован несколькими группами. Данная молекула содержит
индольный хромофор подобно триптофану (см. раздел 1.4).
Первые эксперименты с молекулярными пучками нейтрального триптамина в га-
зовой фазе были выполнены Леви и его коллегами (Park и др., 1986). Применяя ин-
дуцированнуюлазером флуоресценцию (ЛИФ) и резонанснуюдвухфотоннуюиони -
зацию(РДФИ), авторы наблюдали шесть полос в электронном спектре S1—S0, соот-
ветствующих шести различным конформерам. Конфигурации пяти из шести кон-
формеров определяли, записывая спектры флуоресцентного возбуждения с высоким
разрешением, что привело к определениютрех скошенных и двух заслоненных
структур в соответствии с положением аминогруппы относительно кольца индола.
Также было показано, что один переход в электронном спектре состоит из двух
очень близко расположенных друг к другу полос, которые (при более раннем изуче-
нии) не могли быть различены вращательным анализом (Philips и Levy, 1986, 1988).
Кроме того, низшее электронно-возбужденное состояние может быть определено как
1Lb, как и для триптофана. Последующие эксперименты с дейтерированным трипта-
мином подтвердили эти результаты и привели к более точному определениюположе -
ния аминогруппы (Wu и Levy, 1989). Последующие исследования структуры прово-
дились при помощи вращательной когерентности (Connell и др., 1990) и СВЧ спек-
троскопии (Caminati, 2004). По СВЧ спектрам в сочетании с ab initio вычислениями
Каминати и его коллеги выделили два конформера (Caminati, 2004). Цвир и его кол-
леги исследовали триптамин ультрафиолетово-ультрафиолетовым выжиганием про-
валов и ИК/РДФИ спектроскопией и с помощьюТФП вычислений определили семь
структур, включая интерпретацию двух близко расположенных друг к другу полос,
которые нельзя было различить прежде (Carney и Zwier, 2000). Та же самая группа
также измерила барьеры конформационной изомеризации триптамина, применяя
стимулированнуюэмиссиюс заполнением провалов накачки (СЭЗПН) и стимулиро-
ваннуюэмиссиюс переносом заселенностей при накачке (СЭПЗН) (Dian и др.,
2004a; Clarkson и др., 2005b, c). В этих методах сканируется либо УФ лазер стимули-
рованной накачки эмиссии в процессе возбуждения-осаждения или третий лазер,
анализирующий конформеры после процесса стимулированной накачки эмиссии.
Пратт и его коллеги обнаружили дополнительные полосы во вращательных спект-
рах двух полос и зафиксировали препятствия внутримолекулярному движению, объ-
ясняющие появление таких полос (Nguyen и др., 2005).
Микросольватированные кластеры триптамина были изучены намного менее
тщательно, чем мономеры. Парк и его коллеги (1986) обнаружили, что большинство
возможных конформеров при формировании кластеров с метанолом преобразуется в
конформер одного вида. Сипиор и Сулкес (1988) получили тот же результат для кла-
стеров с метанолом, этанолом и димером воды, применяя ЛИФ спектроскопию. Ин-
тересное отклонение от данной тенденции наблюдалось для кластера с диоксаном
(Peteanu и Levy, 1988), который может быть только акцептором водорода. Кластеры
триптамина с водой (до трех молекул молекул воды в кластере) были исследованы
при помощи РДФИ и ИК/РДФИ (Carney и др., 2001). Первая молекула воды присо-
единяется к неподеленной паре аминогруппы, а кластеры с двумя и тремя молекула-
ми воды образуют мостик с индольной группой NH. Коннелл и его коллеги (Connell
и др., 1990) выявили моногидратированный кластер с мостиком, используя враща-
тельнуюкогерентнуюспектроскопию . Этот результат подтвердили Шмитт и его кол-
леги (Schmitt и др., 2005), которые зарегистрировали лазерно-индуцированный флуо-
ресцентный спектр разрешением вращательных уровней для шести мономерных кон-
формеров и моногидратированного кластера триптамина. Авторы наблюдали допол-
нительное стабилизирующее взаимодействие воды с одной из ароматических связей
C—H. Экспериментальные наблюдения были подтверждены ab initio вычислениями.
Это взаимодействие приводит к ситуации, когда различия по энергии для всех воз-
можных кластеров триптамина с водой намного больше, чем между различными мо-
номерами.
Мелантонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) и его кластер с водой также были
исследованы при помощи ИК/УФ спектроскопии (Florio и др., 2002; Florio и Zwier,
2003). Пять конформеров мономера — три структуры с транс- и две с цисконфигура-
цией амидной группы, а также четыре моногидрированных и два дигидрированных
конформера были обнаружены и изучены.
1.4. Спектроскопия двойного резонанса
и СВЧ спектроскопия аминокислот
Три природные ароматические аминокислоты — это фенилаланин (Phe), тирозин
(Tyr) и триптофан (Trp) (см. рис. 1.5). Благодаря ароматическим хромофорам (бензол
в Phe, фенол в Tyr, индол в Trp) их можно исследовать при помощи методов отбора
по массе и изомерно-селективных методов двойного резонанса (УФ/УФ и ИК/УФ).
В данном разделе описаны применения данных методов для ароматических амино-
кислот.
1.4.1. Фенилаланин
Первая ароматическая аминокислота, исследованная при помощи ИК/УФ спектро-
скопии двойного резонанса, — это Phe (Snoek и др., 2000). По ЛИФ спектрам и по
измерениям насыщения, выполненным ранее группой Леви (Martinez и др., 1992),
было идентифицировано, по крайней мере, пять изомеров. Доказательство этого
факта при помощи УФ/УФ двухрезонансной спектроскопии является очень хоро-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 33
Фенилаланин Триптофан Тирозин
Глицин Валин Пролин
Рис. 1.5. Шесть природных аминокислот, три из которых — ароматические (Phe,
Trp, Tyr). Структура, показанная для глицина, — самая устойчивая в га-
зовой фазе
шим учебным примером (см. рис. 1.6b). Шесть изомеров имеют различные энергии
возбуждения S1 S0. Для пяти изомеров можно зарегистрировать ИК/РДФИ спект-
ры (см. рис. 1.6c), что дает некоторые сведения об их структурах. Внутримолекуляр-
ные водородные связи между группами NH2 и COOH доминируют в структурах изо-
меров Phe (см. рис. 1.6a). Разнообразие изомеров частично возникает из-за того, что
функциональные группы могут действовать как водородный донор и водородный ак-
цептор. В этом первоначальном исследовании эти шесть изомеров коррелировали с
шестьюсамыми стабильными структурами Phe (см. рис. 1.6).
В дальнейшем Ким и его коллеги исследовали изомеры Phe, анализируя их по-
тенциалы ионизации. Для получения данных значений сканировали второй лазер
(метод РДФИ, см. рис. 1.1b), и регистрировали ионный ток в зависимости от часто-
ты второго ионизирующего лазера (Lee и др., 2002a, b, 2003). Не было зафиксирова-
но отчетливого возрастания тока в спектрах, указывающего на сильное изменение
геометрии. Однако, согласно первичным данным, спектры можно разделить на две
группы. Для четырех изомеров ионный ток резко возрастает при энергии ~ 8,8 эВ,
для двух изомеров — при энергии большей, чем 9 эВ. Данное расхождение, вероят-
но, является результатом различий в расположении фенильного кольца и основой
цепи Phe. То есть, потенциал ионизации зависит от взаимодействия ионизированно-
го фенольного хромофора с группой NH2, которая может образовывать водородную
связь с фенильным кольцом. Если не существует заметного р-взаимодействия, то по-
тенциал ионизации будет ниже, чем в случае сильного р-взаимодействия. Результа-
ты, полученные при изучении потенциалов ионизации, соответствуют данным Снука
и его коллег (Snoek 2000), за исключением одного изомера E.
В дальнейшем Саймонс и его коллеги снова исследовали шесть изомеров Phe, вы-
полняя контурный анализ вращательных полос РДФИ спектров (Lee и др., 2004).
(кислота)
ЛИФ
РДФИ
УФ/УФ
Нерезонансное
УФ излучение
Волновое число (см–1)
Волновое число
(вакуум) (см–1)
Рис. 1.6. a — девять самых устойчивых структур Phe, вычисленные на уровне MP2
[базисный набор 6-311 G(d, p)] (Snoek и др., 2000). Переходы S1 S0,
полученные из CIS вычислений, указаны стрелками; b — ЛИФ (Martinez
и др., 1992), РДФИ и УФ/УФ с выжиганием провалов (Snoek и др., 2000)
спектры Phe. Спектр с выжиганием провалов ясно указывает на то, что,
по крайней мере, шесть различных изомеров (A, B, C, D, X, E) принадле-
жат РДФИ спектру; c — ИК/РДФИ спектрам изомеров A, B, C, D, X.
Корреляция экспериментально наблюдаемых структур с девятью воз-
можными структурами рассматривается в этом разделе. (Части (a) и (b)
взяты из Robertson и Simons (2001); часть (c) взята из Snoek и др. (2000).)
Оказалось, что идентификация четырех конформеров (1 = X, 2 = D, 3 = B, 6 = C;
см. сокращения на рис. 1.6) согласуется с данными, полученными на основе спек-
тров ИК/РДФИ (Snoek и др., 2000). Повторное определение было сделано для изо-
мера A, который теперь коррелирует со структурой 7. И, наконец, изомер E был со-
поставлен со структурой 9 (см. рис. 1.6a). Стоит обратить внимание на то, что самые
устойчивые изомеры были найдены экспериментально и были также четко иденти-
фицированы различными спектроскопическими методами. Однако были пропущены
изомеры (особенно 4 и 5), энергия которых ниже, чем у изомеров 7 и 9.
Еще один аспект, который рассматривали Ли и его коллеги (2004), — это время
жизни S1 изомеров, полученных в результате задержанной ионизации облученной
пробы. В отличие от всех изомеров, имеющих времена жизни в состоянии S1 ~ 80 нс
(изомеры 2, 3, 6, 7) или 120 нс (изомер 9), основной изомер 1 существует всего 20 нс.
Данный изомер стабилизирован внутримолекулярными водородными связями
(см. рис. 1.6a), что способствует эффективному безызлучательному распаду.
Также проводились исследования производных аминокислот, а именно: группа
NH2 N-конца была ацетилирована, а группа OH С-конца заменялась или на эфир-
ную, или на амидную группу.
В то время как при исследовании чистого Phe благодаря взаимодействиюкислот -
ных и основных концевых групп были получены превосходные спектры, анализ за-
щищенных аминокислот и пептидов предложил хорошие модели описания внутрен-
ней части большого пептида, так как взаимодействуют только функциональные
группы основной цепи.
Структура пептида характеризуется схемой Рамачандрана (Ramachandran и др.,
1966), на которой показаны углы и ш основных цепей аминокислот. Данный под-
ход можно также применить и к защищенным аминокислотам (см. рис. 1.7). Соот-
ветствующим примером может служить определение углов в Ac—Phe—OMe (IUPAC,
1974; Schulz и Schirmer, 1979; Gerhards и Unterberg 2002): Ѕ (C , Cб, N, C3) и
ш Ѕ (O1, C , Cб, N) с —180° < , ш Ѕ 180°; см. рис. 1.7. Першель и его коллеги (1991)
в их работе, касающейся различных частично защищенных аминокислот, указали на
то, что для каждого из углов и ш существует три различных значения, соответству-
ющих минимумам потенциальной энергии. Это приводит к девяти возможным кон-
формациям основных цепей пептидов. Для описания девяти возможных конфигура-
ций применяются обозначения бD, бL, вL, гL, гD, еD, еL, дL и дD (Perczel и др., 1991).
Изомеры бD( Ј 0—120°, ш Ј 0—120°) и бL( Ј —120—0°, ш Ј —120—0°) описывают
спиралевидные структуры. вL( Ј —120—120°, ш Ј —120—120°) описывает структуру
в-пластов. гL( Ј —120—0°, ш Ј 0—120°) и гD( Ј 0—120°, ш Ј —120—0°) соответству-
ют инверсионный и нормальный повороты г, еD(Ц Ј 0—120°, ш Ј —120—120°) и
еL(Ц Ј —120—0°, ш Ј —120—120°) представляют обратнуюи нормальнуюструктуры
полипролина II. Соответствующие углы структур д — дL(Ц Ј —120—120°,
ш Ј 0—120°) и дD (Ц Ј —120—120°, ш Ј —120—0°). Углы кручения ч1 Ѕ (N, Сб, Cв, C1)
и ч2 Ѕ (Сб, Св, C1, C2) определяют структуру боковой цепи Ac—Phe—OMe. Углы ч1 и
ч2 описывают вращение вокруг осей Сб—Св и Св—С1, соответственно. В случае с уг-
лом ч1 три положения фенильной группы соответствуют минимумам потенциальной
энергии. Данные положения обозначаются как g + (гош +, ч1 ~60°), б (противопо-
ложный, ч1 ~180°) и g — (гош —, ч1 приблизительно —60°) (IUPAC, 1974; Gelin и
Karplus, 1979). Другой важный параметр, описывающий относительное положение
группы NH1 относительно группы CO ацетильного фрагмента — это угол щ. Данный
угол определяет транс- и цисизомеры относительно положения амидной группы.
Обычно транс-структуры аминокислот более стабильны, чем соответствующие
цис-структуры. Для углов , ш и ч1 27 различных конформеров (девять вариантов по-
ложения основной цепи пептида, умноженные на три различных значения ч1) могут
соответствовать минимумам на поверхности потенциальной энергии Ac—Phe—OMe,
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 35
но только одна структура была получена в спектрах РДФИ (Gerhards и Unterberg,
2002; Gerhards и др., 2002). Спектры ИК/РДФИ были зарегистрированы в области
валентных колебаний NH и в области колебаний амида I/II (валентные колебания
C=O, деформационные колебания NH) (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др.,
2002). Сравнивая экспериментально наблюдаемые колебательные частоты со значе-
ниями, полученными в результате ab initio вычислений и вычислений методом тео-
рии функционала плотности (ТФП), можно сделать вывод, что Ac—Phe—OMe имеет
структуру вL (см. рис. 1.8a) с боковой цепьюв анти- или левовращающем + положе-
нии. То есть, образуется структура вL (а) или вL (g+). Дальнейшие исследования
вплоть до характеристичной области ясно указывают на то, что для мономера фор-
мируется структура вL(g+) (Fricke и др., 2006a).
Молекула Ac—Phe—NHMe — еще один пример защищенной аминокислоты на
основе Phe. Она содержит две амидных группы (O=C—N—H) и поэтому является ди-
пептидной моделью. В спектре РДФИ Ac—Phe—NHMe было обнаружено пять изоме-
ров (Gerhards и др., 2004). В соответствии с ab initio вычислениями и вычислениями
ТФП самая устойчивая структура — это снова вL(а) (см. рис. 1.8a и 1.9), но вторые и
третьи по устойчивости структуры содержат внутримолекулярные водородные связи
и имеют форму гL (см. рис. 1.8b, в случае с защитной эфирной группой эти типы
структуры невозможны). Необходимо упомянуть, что г-структуры также называют
структурами C7, и из-за взаимодействия атома H в группе NH—CH3 и атома O аце-
тилированной карбоксильной группы оба атома находятся в положениях 1,7 относи-
тельно друг друга (см. рис. 1.8b). Структуры, относящиеся к в-пласту, называют
структурами C5 из-за слабого взаимодействия между атомами H и O при параллель-
ной ориентации группы NH и карбонильной, которые находятся в положениях 1,5
(см. рис. 1.7a и 1.8a).
В качестве примера спектры ИК/РДФИ изомера вL(а) Ac—Phe—NHMe показаны
на рис. 1.9. Это очень типично для вытянутого (относящегося к в-пласту) располо-
жения для всех NH колебаний с частотами более 3400 см–1, так как соответствующие
Рис. 1.7. a — структура Ac—Phe—OMe. Показаны пять самых важных углов (Ц, ш,
ч1, ч2, щ), которые описывают основу (Ц, ш) и боковуюцепь (ч1, ч2), а
также цис-транс-изомерию( щ). В Ac—Phe—OMe N-конец Phe ацетилиро-
ван, а C-конец содержит функциональнуюэфирнуюгруппу; b — схема
Рамачандрана, на которой показаны девять различных конфигураций
основной цепи относительно углов Ц и ш. (Рисунок частично взят из
Gerhards и Unterberg (2002).)
группы NH свободны и не связаны с водородом. Особенность данного изомера
Ac—Phe—NHMe заключается в том, что можно наблюдать только одно колебание в
области валентных колебаний C=O. Согласно вычислениям предсказанная интен-
сивность второго валентного колебания C=O намного ниже. В случае со структурой
поворота гL частота одной группы NH, связанной с водородом, ниже 3400 см–1, тог-
да как другое валентное колебание NH выше 3400 см–1 (Gerhards и Unterberg, 2002;
Gerhards и др., 2004). Кроме того, переходы, которые принадлежат группам NH, свя-
занным с водородом, обычно шире, чем наблюдаемые для валентного колебания
свободной NH группы. Вообще можно утверждать, что информациюоб основной
структуре исследуемых молекул получают из положения, интенсивности и ширины
колебательного перехода. Если, кроме того, колебательные переходы зарегистрирова-
ны в широком спектральном диапазоне (характеристичная область, амид I, II, вален-
тные колебания NH, обертоны), то для интерпретации спектра имеется достаточно
информации. В подобных системах (например, в Ac—Trp—NHMe) также наблюдают
структуры в-пласта и г-витка.
Третий пример защищенной аминокислоты на основе Phe — это Ac—Phe—NH2.
В данном случае группа NH2 ацетилирована, и используется чистый амид. Такая мо-
дель менее эффективна для описания внутренней структуры пептида (который не со-
держит никаких первичных групп NH2), но вводит дополнительнуючастоту валент-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 37
гL-виток
в-виток (тип I) гL—в-виток (тип I)
вL-виток (тип I) — вL-виток (тип I) 310 винтовой
Рис. 1.8. Схемы различных вариантов связи, описывающие положение основной
цепи пептида: a — структура, относящаяся к в-пласту (вL-конфигурация
C5); b — г-виток (структура гL, C7); c — комбинированная структура
гL—вL; d — в-виток (тип I) (структура C10); e — расположение гL—гL;
f — комбинированный гL—в-виток (тип I); g — последовательные в-вит-
ки (тип 1); h — винтовая структура 310 (идентичная комбинированному
повороту в (тип III) — поворот в (тип I))
ных колебаний NH, которая может быть полезна для интерпретации структуры. Ана-
лиз Ac—Phe—NH2 с применением ИК/РДФИ приводит к трем конформерам (Chin и
др., 2005d). Как и в Ac—Phe—NHMe (Gerhards и др., 2004), самой устойчивой оказы-
вается структура, относящаяся к в-пласту, тогда как у двух других структур есть эле-
менты гL-витка. Очень интересно обратить внимание на тот факт, что конформер,
содержащий гL структуру (гош +), показывает очень низкий выход флуоресцентных
квантов (Chin и др., 2005d). Это может быть результатом взаимодействия связи N—H
с р-системой, что приводит к быстрому безызлучательному распаду (см. ниже).
г-витки также наблюдаются в пептиде Z—Pro—NHMe (с Z=C6H5—CH2—O, Pro
см. на рис. 1.5). Данная система базируется на пролине, и так как у этого вещества
нет хромофора в боковой цепи, ароматический хромофор представлен в защитной
группе (Compagnon и др., 2005).
г-витки — важные элементы вторичной структуры. Другие типы вторичной струк-
туры включают спирали, в-пласты и в-витки (см. рис. 1.8 и 1.10). в-виток и спирали
представлены ниже, но даже для защищенных аминокислот можно рассмотреть наибо-
лее простые структуры с в-пластами. Модель в-пласта — это совокупность, по край-
ней мере, двух защищенных аминокислот или пептидов, в которых у аминокислот то
же положение, что и у аминокислот в большом пептиде (см. рис. 1.10). Для обсужде-
ния динамических моделей с в-пластами лучше использовать защищенные аминокис-
ИК/РДФИ спектр ИК/РДФИ спектр
(амидI/II) (валентные колебания NH = амидА)
Рис. 1.9. Структура и ИК/РДФИ спектр модельного дипептида Ac—Phe—NHMe
(Gerhards и др., 2004). Спектр показан в областях переходных колебаний
амидов I/II (1450—1800 см–1) и валентных колебаний N—H (амид A).
Все переходы в области валентных колебаний NH имеют частоты, суще-
ственно большие 3400 см–1, что указывает на наличие структуры в-плас-
та. (Рисунок частично взят из Gerhards и др. (2004).)
лоты вместо незащищенных, так как в данном случае наиболее полярные группы рас-
положены в основной цепи молекулы, а не на ее концах. В незащищенных аминокис-
лотах (см., например, шесть самых устойчивых изомеров Phe на рис. 6 в Snoek и др.
(2000)) кислотная группа COOH и группа NH2 обладают тенденцией к формированию
межмолекулярных водородных связей, тогда как молекулы, подобные Ac—Phe—OMe
или Ac—Phe—NHMe (или Ac—Phe—NH2), обычно имеют вытянутые структуры, отно-
сящиеся к в-пласту, которые идеальны для формирования димеров. Такие димеры яв-
ляются подходящими примерами моделей с в-пластами, что приводит к вопросу о том,
существуют ли движущие силы формирования более сложной вторичной структуры
для изолированных молекул в газовой фазе (без окружающей среды).
Действительно, в случае с Ac—Phe—OMe и Ac—Phe—NHMe анализ спектров
ИК/РДФИ в сочетании с ab initio вычислениями показывает, что димеры — это мо-
дели в-пласта (см. рис. 1.11). Для дипептида Ac—Phe—NHMe существуют две различ-
ные модели с в-пластами: конфигурация с внешними связями с группами NH
N концов (группы NHMe) с водородными связями двух групп CO c C-концами (аце-
тильные группы) (рис. 1.11a) и структура с внутренними связями с группами NH
аминокислоты с водородными связями с группой CO амидной группы (рис. 1.11b).
Сравнивая спектры ИК/РДФИ с колебательными спектрами, предсказанными для
различных структур, можно сделать вывод о том, что формируется димер с внешни-
ми связями (Gerhards и др., 2004). В случае с Ac—Phe—OMe образуется только кон-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 39
Рис. 1.10. Часть белка шелка, содержащая вторичнуюструктуру антипараллельно-
го в-пласта. Сплошным прямоугольником обозначена малая модель
в-пласта с малым расстоянием между соседними связями N—H···O=C,
тогда как пунктирным прямоугольником обозначена модель с боль-
шим расстоянием N—H···O=C. Обе структуры можно взять за образец
большого в-пласта. Оба прямоугольника могут быть рассмотрены как
полный антипараллельный в-пласт. Таким образом, повторяя этот эле-
мент (содержащий оба образца), можно воспроизвести полный в-пласт
(Gerhards и др., 2006a)
фигурация с в-пластами и внутренними связями, что было определено эксперимен-
тально (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др., 2002). Важно заметить, что фор-
мируется более чем один димер с внутренними или внешними связями. Три возмож-
ных ориентации боковой цепи (g+, g–, a) для каждого мономера дают девять
возможных структур димера с внутренними или внешними связями. Количество ко-
лебательных частот для NH и CO, наблюдаемых в ИК/РДФИ спектрах, указывает на
то, что это симметричные структуры, а именно: структуры, в которых у этих двух мо-
номеров одинаковая ориентация боковой цепи. Таким образом, остаются только три
возможных структуры димеров с внутренними или внешними связями. В случае с
Ac—Phe—NHMe только расположение вL(g+)-вL(g+) соответствует экспериментально
наблюдаемым частотам и интенсивностям в областях колебаний C=O и NH (Gerhards
и др., 2004). Для (Ac—Phe—OMe)2 конфигурации вL(g +)-вL(g +) и вL(a)-вL(a)
соответствуют полученным экспериментально спектрам (Gerhards и Unterberg, 2002;
Gerhards и др., 2002). Вновь исследования в характеристичной спектральной области
указывают на то, какая структура присутствует. Так как большое количество инфор-
мации об основной цепи можно получить с помощьюИК спектроскопии, детальный
анализ положения боковых цепей может стать интересной задачей для измерений
вращательных спектров с высоким разрешением, которые теперь возможны для сис-
тем размера защищенной аминокислоты или ее димера.
Для построения большей модели с в-пластами размер системы увеличивают, сис-
тематически добавляя одну за другой аминокислоты. Это приводит к формированию
пептидных структур, что будет рассматриваться в следующем разделе.
Рис. 1.11. Динамические модели с в-пластами для двух структур, описанных на
рис. 1.10: a — для димера Ac—Phe—OMe наблюдается конфигурация с
внутренними связями (Gerhards и др., 2002; Gerhards и Unterberg, 2002);
b — в случае с Ac—Phe—NHMe возможны структуры и с внутренними,
и с внешними связями, но только конфигурация с внешними связями
была экспериментально обнаружена (Gerhards и др., 2004). (Рисунок ча-
стично взят из Gerhards и др. (2004).)
Для исследования процесса микросольватации представляют интерес кластеры
Phe с водой. Ким и его коллеги анализировали кластер Phe с одной молекулой воды,
применяя метод РДФИ (Lee и др., 2002a, b). Структуру идентифицировали исключе-
нием конформеров в результате гидратации. Выяснилось, что кластер можно полу-
чить из мономера А (см. рис. 1.6; А = 7), форма которого не изменяется существен-
ным образом при образовании комплекса с одной молекулой воды. Согласно ab initio
вычислениям (одноточечные энергии по теории MP2 для конфигураций, оптимизи-
рованных по теории ТФП, базисный комплект 6-31 + G(d)) самая устойчивая струк-
тура содержит молекулу воды, соединеннуюс карбоксильной группой. Таким обра-
зом, OH карбоксильной группы действует как протонный донор по отношениюк
молекуле воды, тогда как атом Н воды образует связь с C=O группой COOH. Полез-
но также применять метод ИК/РДФИ к системе Phe/вода, так как он дает непосред-
ственнуюинформациюо структуре. Важно, что этот метод также работает, когда
возбужденные кластеры фрагментируют, так как ИК возбуждение происходит до УФ
возбуждения, то есть ИК фотон возбуждает неповрежденный кластер.
Эффект микросольватации защищенной аминокислоты был исследован автором с
коллегами (Fricke и др., 2006b), которые анализировали кластер Ac—Phe—OMe с мо-
лекулами воды (в количестве до трех). Данные структуры были проанализированы с
помощьюметода ИК/РДФИ в области валентных колебаний NH и ОH, а также в об-
ласти валентных колебаний амида I и II. В отличие от незащищенных аминокислот,
воду нельзя присоединить к полярным концевым группам COOH и NH2. Два метода
присоединения одной молекулы воды показаны на рис. 1.12 (a) и (b). Существует
конкуренция между группами амидной связи NH (протонный донор) и CO (протон-
ный акцептор). В структуре (a) образуется связь между группами NH и CO, тогда как
в (b) одна молекула воды прикреплена в качестве протонного донора к группе CO
амидной функции. Интересно обратить внимание на то, что обе структуры получены
экспериментально (Fricke и др., 2006b). Для кластера с двумя молекулами воды фак-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 41
Рис. 1.12. Экспериментально наблюдаемые структуры для кластера Ac—Phe—OMe
с одной (a, b), двумя (c, d) и тремя (e) молекулами воды (Fricke и др.,
2006b). Четко видны конкурирующие эффекты для воды, выступающей
в качестве протонного донора или акцептора
тически была получена структура, где одна молекула воды расположена с каждой
стороны от Ac—Phe—OMe (см. рис. 1.12c). Данная структура — это наложение двух
кластерных структур с одной молекулой воды. Однако, также наблюдается и второй
изомер, в котором димер воды связан водородной связьюс CO амидной группы
(рис. 1.12d) (Fricke и др., 2006b). Наконец, только один изомер был получен для кла-
стера с тремя молекулами воды, который состоит из соединения с одной молекулой
в качестве мостика между группами NH and CO с одной стороны, и с димером воды с
водородной связьюс группой CO с другой стороны. Первый слой сольватации запол-
нен тремя дополнительными молекулами воды. Очень интересный результат — это
то, что в случае с Ac—Phe—OMe первый слой сольватации фактически никак не
влияет на основнуюцепь. То есть, основное положение вытянутой структуры, отно-
сящейся к в-пласту, остается. Интересно посмотреть на изменения структур в слу-
чае, если сольватациюбольших пептидов исследовать пошагово (то есть добавляя
молекулу воды одну за другой).
1.4.2. Триптофан
Триптофан — это аминокислота, наиболее эффективно поглощающая УФ излучение.
При помощи методов лазерной десорбции Леви и его коллеги в 1980-х получили его
РДФИ и ЛИФ спектры (Rizzo и др., 1985, 1986a, b; Philips и др., 1988). Из измерений
зависимости сигнала от мощности излучения можно предположить, что вклад в
РДФИ сигнал вносят шесть изомеров. То есть, переходы в РДФИ спектрах принад-
лежат одному и тому же конформеру, если интенсивности их пиков одинаковы (Rizzo
и др., 1986b). Пики, принадлежащие различным конформерам, не имеют одина-
ковых интенсивностей из-за различий в популяциях молекул, находящихся в состоя-
нии S0. Еще одно доказательство существования шести изомеров было получено с
помощьюспектров рассеянной флуоресценции (РФ), зарегистрированных для пере-
ходов из состояния S1. РФ cпектры не идентичны. В частности, широкий флуорес-
центный сигнал с красным смещением, наблюдаемый для изомера А (конформера с
самой низкой энергией возбуждения), дает основание для предположения о том, что
в электронно-возбужденном состоянии может быть образована амфионная форма
(Rizzo и др., 1986a). Другим объяснением этого явления может служить сильное
взаимодействие электронно-возбужденных состояний lLa и lLb конформера A. Со-
гласно измерениям рассеяния флуоресценции с высоким временным разрешенным
конформер А оказывается нейтральюс самым коротким временем жизни в электрон-
но-возбужденном состоянии (Engh и др., 1986; Philips и др., 1988). Более поздние эк-
сперименты показали, что спектры ЛИФ и РФ являются практически зеркальным
отражением друг друга (Snoek и др., 2001). Уширение пиков в спектре РФ может воз-
никать из-за неразрешенной электронно-колебательной структуры Trp, сигнал кото-
рой усиливается (из-за больших коэффициентов Франка-Кондона) в спектре РФ.
Ранняя работа группы Леви получила очень важные, но, в основном, косвенные
свидетельства существования различных конформеров Trp. Применение методов
двойного резонанса позволило проверить эти предположения. Действительно, как
УФ/УФ выжигание провалов (Piuzzi и др., 2000), так и ИК/РДФИ (Snoek и др., 2001)
спектроскопия подтвердили существование шести изомеров Trp. Исследования в об-
ласти валентных колебаний NH привели к идентификации, по крайней мере, пяти
изомеров. Самая устойчивая структура A (см. рис. 1.13a) содержит внутримолекуляр-
нуюводороднуюсвязь между ОН карбоксильной группы и группой NH2 с атомами
водорода группы NH2, направленными в сторону ароматического индольного кольца
боковой цепи (Snoek и др., 2001). Во второй самой устойчивой структуре E группа
NH2 действует как донор протонов по отношениюк C=O карбоксильной группы.
Cтруктуры А и E в дальнейшем были подтверждены измерениями в ИК характери-
стичной области от 330 до 1500 см–1 (Bakker и др., 2003) (см. рис. 1.13). Третий изо-
мер D содержит водороднуюсвязь между группой NH2 и ОH карбоксильной группы,
которая является акцептором протонов. Хотя это пока полностьюне подтверждено
ИК-спектроскопией, сходство расчетных и экспериментальных спектров и в характе-
ристичной области ИК спектра, и в области валентных колебаний NH подтверждает
даннуюгипотезу. Интересно обратить внимание на то, что исследования Trp в ка-
пельках гелия (Lindinger и др., 2001) продемонстрировали полное подавление струк-
туры A, которая является самой устойчивой в экспериментах с молекулярным пуч-
ком и во всех вычислениях, выполненных в данной системе до уровня MP2, включая
тройной-ж базисный набор (Snoek и др., 2001). Возможным объяснением данного эк-
спериментального результата может быть агрегация атомов He около ароматического
хромофора (индольного кольца), что приводит к дестабилизации структуры A. Этот
результат показывает, что сверхтекучий He существенно влияет на самые устойчивые
структуры.
Процесс микросольватации Trp был исследован путем добавления к нему молекул
воды. В двух экспериментах были исследованы водные кластеры при помощи сочета-
ния ИК/УФ спектроскопии и ab initio вычислений методом ТФП (Snoek и др., 2002;
Tarcabal и др., 2004). Исследования амидной области (Snoek и др., 2002) были расши-
рены до характеристичной области при помощи лазера на свободных электронах
(Tarcabal и др., 2004). Существенная проблема получения правильной структуры со-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 43
Волновое число (см–1)
Рис. 1.13. Спектры ИК/РДФИ трех изомеров Trp в характеристичной области
и области амида II от 330 до 1500 см–1 (Bakker и др., 2003). Экспери-
ментальные спектры (вверху) сравниваются с расчетными спектрами
(ниже), полученными с помощьюТФП уровня B3LYP/6-31 + G(d).
Данные спектры приводятся и как линейчатые спектры, и как спект-
ральные профили лазера на свободных электронах (Oepts и др., 1994).
Соответствующие структуры изомеров A, D и E приводятся внизу (по-
дробно в тексте). (Рисунок взят из Bakker и др. (2003).)
Относительное
сечение (относи-
тельные единицы)
Интенсивность
ИК излучения
(Ї 100 км/мол)
стоит во фрагментации кластеров более высоких порядков до моногидратированных
кластеров. Выяснилось, что экспериментально полученный ИК спектр дает, главным
образом, трехгидратированный кластер. Для кластера Trp/вода важно обратить вни-
мание на то, что конформер Trp, наблюдаемый в кластере, не идентичен тому, кото-
рый был получен для одиночной молекулы Trp. То есть, вода не просто присоединя-
ется к мономеру Trp, но и перестраивает Trp в конфигурацию, оптимальную для
формирования оболочки сольватации. Кроме того, можно сделать вывод, что в клас-
терах с тремя или меньшим числом молекул воды амфионная структура не образует-
ся. В более ранней статье добавление других молекул (метанола, этанола, хлорофор-
ма, бензола и ацетона) исследовали ЛИФ спектроскопией и рассеянной флуоресцен-
тной спектроскопией (Teh и др., 1989). Согласно результатам электронной спектро-
скопии молекула растворителя присоединена к б-амину (то есть к группе NH
основной цепи), а не к группе NH индольной структуры.
Как и в случае с Phe, несколько производных Trp были исследованы различными
методами. В ранних статьях группа Леви (Park и др., 1986; Tubergen и др., 1990) про-
анализировала методами ЛИФ, РДФИ и РФ следующие производные: 3-индол-ук-
суснуюкислоту, 3-индолпропионовуюкислоту, триптамин, N-ацетилтриптофанэти-
ловый эфир (NATE), различные амиды триптофана, N-ацетилтриптофан, N-ацетилт-
риптофанамид (NATA) и N-ацетилтриптофан-диметиламид (NATDMA). В последней
молекуле Trp ацетилирован по NH2-группе и амидирован в кислотном участке (ис-
пользовался или чистый или диметилированный амид). Цель всех этих исследова-
ний состояла в том, чтобы понять, почему подобные вещества дают различные элек-
тронные спектры. В частности, некоторые спектры имеют отчетливые пики в облас-
ти низких частот и широкий флуоресцентный пик с красным смещением, тогда как
другие конформеры тех же самых веществ дают четкие резонансные флуоресцентные
спектры без явных низкочастотных переходов. Предполагается, что вероятность фор-
мирования внутримолекулярной водородной связи между группой NH и карбониль-
ной группой может вести к различным электронным спектрам. Относительные поло-
жения основной и боковой цепей (индольного кольца) также сильно влияют на
спектроскопические результаты. Важно заметить, что индольное кольцо обладает
двумя близкими электронными состояниями: 1La и 1Lb. Спектроскопические данные
являются следствием возмущения электронной структуры, обусловленного типом
производного аминокислоты и конфигурацией исследуемых молекул. Данный аспект
также рассматривала группа Цвира, опубликовавшая ряд статей по NATA, в частно-
сти, по N-ацетилтриптофан-метиламиду (NATMA, Ac—Trp—NHMe) (Dian и др.,
2002a, b; 2003, 2004a, b, c; Evans и др., 2004). Как и Ac—Phe—NHMe (см. выше),
NATMA (Ac—Trp—NHMe) представляет собой дипептид. С помощьюспектроскопии
УФ/УФ выжигания провалов были определены электронно-возбужденные состояния
для трех различных конформеров NATMA. В отличие от двух других конформеров,
третий имеет широкий электронный переход (см. спектр выжигания провалов во
вставке на рис. 1.14 и структуры на рис. 1.3) (Dian и др., 2002a). При дальнейшем
применении ИК/УФ спектроскопии двойного резонанса были получены частоты ко-
лебаний, сравненные с расчетными спектрами (подробно о вычислении спектров
см. раздел 1.7). Оказалось, что вещество с широким электронным переходом имеет
г-виток C5. Необычное поведение данной структуры объясняется возможным взаи-
модействием состояния 1ру* с состоянием 1Lb. Данное взаимодействие может быть
результатом ориентации и силы дипольного момента, а также ориентации боковой
цепи относительно основной цепи (с группой NH, которая может быть направлена к
р-системе). Прямое свидетельство о взаимодействии состояния 1ру* с состоянием
1Lb получают по ИК/РДФИ спектрам состояния S1. В спектрах, принадлежащих изо-
мерам с г-витком и имеющим широкий пик УФ поглощения, индольные валентные
колебания не обнаруживаются, что указывает на диссоциацию из состояния 1ру* по
связи NH (Dian и др., 2003). Этот результат ясно показывает, что фотофизика зави-
сит от структуры частиц, а не только от типа растворителя.
NATMA представляет интерес не только с точки зрения исследования различных
электронных состояний, но также может быть использована для демонстрации мето-
дов ИК спектроскопии изменения популяции и ИК спектроскопии заполнения про-
валов (см. рис. 1.14 (Dian и др., 2002b, 2004c)). В случае с NATMA популяция может
очень эффективно перераспределяться между различными изомерами, хотя в ходе
экспериментов наблюдалась лишь умеренная селективность конформеров. Другими
словами, возбуждение одного изомера, например, самого устойчивого C5, ведет к об-
разованиюдвух других изомеров, но никогда к формированиюизомера, не принад-
лежащего к трем наиболее стабильным. Распределение популяции моделировали с
помощьюпотенциалов силовых полей (Amber, OPLS) в сочетании с РРКМ вычисле-
ниями (Evans и др., 2004). Экспериментальные результаты моделировали функцией,
зависящей от избыточной энергии и скорости охлаждения. Охлаждение после ИК
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 45
Волновое число (см–1)
Увеличение
Снижение
Волновое число (см–1)
Рис. 1.14. a — ЛИФ спектр NATMA (Ac—Trp—NHMe), проанализированный спек-
троскопией УФ/УФ выжигания провалов (вставка). Таким образом был
определен вклад от трех изомеров NATMA (см. рис. 1.3); b — спектр,
полученный методом заполнения провалов, зарегестрированный при
возбуждении одного валентного колебания NH изомера B. Сканируя
УФ лазер, можно наблюдать уменьшение флуоресценции для изомера B
и увеличение флуоресценции для изомеров А и C (Dian и др., 2002b).
Для C проявляются только широкие спектральные переходы, что указы-
вает на наличие очень эффективных каналов релаксации электронного
возбуждения (Dian и др., 2003) (подробнее см. в тексте). (Рисунок взят
из Dian и др. (2002b).)
Интенсивность (относительные единицы)
возбуждения является важным фактором, влияющим на это перераспределение.
Условия охлаждения менялись при изменении давления и относительного расстоя-
ния x/D (где x — расстояние до скиммера, D — диаметр отверстия скиммера). Для
нескольких значений x/D, давления и длин волн ИК и УФ излучения были зарегист-
рированы ИК/УФ спектры при различных временах задержки между импульсами
ИК и УФ лазеров. Результаты оказались чрезвычайно чувствительны к изменению
параметра x/D, так как охлаждение происходит за несколько сотен наносекунд (Dian
и др., 2004b).
Для получения более четкого понимания о влиянии различных факторов на изме-
нение популяции изомеров исследования были распространены на мелантонин, кото-
рый дает больший чем NATMA, сигнал и имеет в основной цепи всего одну группу NH
(Dian и др., 2004b). Оказывается, что перераспределение можно изменить, варьируя
условия охлаждения. Кроме того, перераспределение после ИК возбуждения наблю-
далось между различными транс-изомерами, но не для цис-структур. Это является ре-
зультатом влияния высоты барьера транс-цис-изомеризации, который невозможно
преодолеть при поглощении одного ИК фотона. Таким образом, выбранный метод
пригоден для определения высоты барьера (Dian и др., 2004b). Вопросы, касающиеся
селективности метода в химических процессах, остаются открытыми. Они могут быть
исследованы при помощи ИКИП спектроскопии и спектроскопии заполнения прова-
лов. Как было упомянуто выше, необходимо принять во внимание многие параметры
(например, выбраннуюдлину волны ИК излучения, интенсивность охлаждения, коли-
чество изомеров, относительнуюэнергиюиз омеров). Кроме того, исследования состо-
яния S1 требуют более сложного описания, чем состояние S0, вследствие влияния воз-
мущений, вызванных различными электронными состояниями.
Другой причиной исследования защищенного Trp является анализ элементов вто-
ричных структур. Из данных РДФИ и ИК/РДФИ спектроскопии и ab initio вычисле-
ний следует, что мономер Trp имеет структуру в-пласта (Gerlach и др., 2005). Данный
результат подобен полученному для защищенных аминокислот Ac—Phe—OMe и
Ac—Phe—NHMe (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др., 2002, 2004), для которых
структуры в-пласта самые устойчивые. Как и в случае с защищенными аминокисло-
тами, содержащими Phe (Ac—Phe—OMe и Ac—Phe—NHMe), димер Ac—Trp—OMe мог
бы служить моделью в-пласта. Однако основное различие между аминокислотами
Phe и Trp заключается в наличии полярной группы в боковой цепи Trp. В частности,
индольная NH группа участвует в образовании межмолекулярных водородных связей
с группами CO второго Trp (см. рис. 1.15b, c). Действительно, анализ димера
(Ac—Trp—OMe)2 дает структуру, в которой одна из индольных групп NH образует во-
дороднуюсвязь с С=O эфирной группы, тогда как другая образует водороднуюсвязь
с CO ацетильной группы (Gerlach и др., 2005). Эта структура асимметрична (см. рис.
1.15c), тогда как в симметричной структуре (рис. 1.15b) обе индольные группы NH
были бы соединены водородной связьюили с CO эфирных или ацетильных групп.
Модельная система для в-пласта (рис. 1.15a) с водородными связями между группа-
ми NH основной цепи и CO эфирных групп (которые параллельны группам NH
основной цепи) не наблюдается, так как индольные группы NH более кислотные.
Данное различие между Phe и Trp указывает на сильное влияние боковой цепи на
структуры аминокислот. Такое влияние боковой цепи может усилиться при возник-
новении водородных связей между группами NH и р-системами боковой цепи. Ис-
следования различных защищенных аминокислот показывают, что взаимодействие
между боковыми и основными цепями влияет на структуры как изолированных пеп-
тидов, так и на структуры их кластеров. В частности, для наблюдения в-пластов сле-
дует избегать боковых цепей с полярными группами (например, NH или ОН). Инте-
ресен вопрос: приводит ли добавление воды, например, к димеру Ac—Trp—OMe к
трансформации димера в в-пласт с сольватированными группами NH индольной бо-
ковой цепи или сольватированы лишь свободные функциональные группы основной
цепи (NH или CO) при сохранении структуры несольватированного димера? Экспе-
рименты, похоже, указывают на то, что первая молекула воды присоединяется через
водороднуюсвязь NH···O=C димера. Получается, что при большем количестве мо-
лекул растворителя можно получить структуру с в-пластами димера Ac—Trp—OMe.
1.4.3. Применение СВЧ спектроскопии
Свободные аминокислоты интенсивно изучались при помощи СВЧ спектроскопии в
газовой фазе. Глицин, самая простая аминокислота, был предметом многих исследова-
ний. Начиная с ранней работы Брауна и его коллег (Brown и др., 1978) и Сьюнрама и
Ловаса (Suenram и Lovas, 1978), СВЧ спектр глицина рассматривался несколько раз с
цельюполного структурного анализа трех возможных конформеров глицина (Berulis и
др., 1985; Bludsky и др., 2000; Brauer и др., 2004; Brown и др., 1978; Godfrey и Brown,
1995; Godfrey и др., 1996; Guelin и Cernicharo, 1989; Hollis и др., 1980; Lovas и др., 1995;
McGlone и др., 1999; Miller и др., 2005; Senent и др., 2005; Snyder и др., 1983; Suenram и
Lovas, 1978, 1980; Suenram и др., 1989). В самой устойчивой структуре группа NH2 об-
разует разветвленнуювнутримолекулярнуюводороднуюсвязь с группой C=O (изомер
I). То же самое наблюдается для аланина (Blanco и др., 2004; Brauer и др., 2004; Csaszar,
1996; Godfrey, 1993; Godfrey и др., 1996; McGlone и др., 1999).
Гистамин был исследовал Фогельсангером и его коллегами (1991). Они регистри-
ровали вращательный спектр в спектрометре со свободно расширяющейся сверхзву-
ковой струей. Наблюдались четыре конформера (Vogelsanger и др., 1991). Два различ-
ных конформера аланина наблюдали Годфри и его коллеги (Godfrey и др., 1996) с
помощьюспектрометра со свободно расширяющейся сверхзвуковой струей и моду-
ляцией Штарка. Развитие методов абляции (Suenram и др., 1999; Lessari и др., 2003)
открыло путь к исследованиюдругих аминокислот, которые ранее было невозможно
изучать в газовой фазе из-за фрагментации при нагревании. Алонсо и его коллеги
зарегистрировали вращательные спектры пролина, валина (Lessari и др., 2002, 2004)
и аланина (Blanco и др., 2004), применяя СВЧ спектроскопиюмолекулярных пучков
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 47
Рис. 1.15. Различные структуры димера Ac-Trp-OMe (Gerlach и др., 2005): a — ди-
намическая модель в-пласта со связями N—H···O=C между основны-
ми цепями; b — димер с водородными связями между NH индольной
группы и C=O эфирной группы. Его называют симметричным диме-
ром, так как у обоих мономеров водородные связи принадлежат одному
и тому же типу. В отличие от этой структуры c — асимметричный ди-
мер, где NH одной индольной группы соединена водородной связьюс
С=O эфирной группы, тогда как NH другой индольной группы образует
водороднуюсвязь с C=O амидной группы. (Рисунок взят из Gerlach и
др. (2005).)
с лазерной абляцией и использованием преобразования Фурье (СВЧС МП ПФ). Для
пролина (Allen и др., 2004; Czinski и Csaszar, 2003) были обнаружены два конформера
с водородной связьюмежду OH карбоксильной группы и одиночной парой электро-
нов азота. Этот экпериментальный факт отличается от наблюдаемого для самых
устойчивых конформеров глицина и аланина с вышеупомянутой разветвленной
внутримолекулярной водородной связьюмежду группами NH2 и C=O. Для валина
было найдено два конформера с двумя различными типами водородной связи, опи-
санными выше.
Начиная с середины 1990-х несколько производных и аналогов аминокислот
были исследованы путем регистрации вращательных спектров. Туберген и его колле-
ги зарегистрировали вращательные спектры семи изотопных аналогов аланинамида
(Lavrich и др., 1999). Они выявили структуру с водородной связьюмежду амидом и
амином, в которой амидная группа играла роль донора. В более поздней работе Лав-
рич и Туберген исследовали кластер аланинамида с водой, который является инте-
ресным примером производного аминокислоты с водородной связью(без ароматиче-
ского хромофора) (Lavrich и Tubergen, 2000). Здесь вода действует и как водородный
донор по отношениюк группе C=O, и как водородный акцептор по отношениюк
NH2 амидной группы, образуя циклическуюструктуру с водородной связью, похо-
жуюна структуру изомера Ac—Phe—OMe(H2O)1—3 (см. рис. 1.12a, c, e).
Модель дипептида N-ацетилаланин N-метиламид и его изотопный аналог 15N(15N2)
были успешно изучены посредством спектроскопии СВЧС МП ПФ. В данной системе
была обнаружена свернутая структура г-типа (Lavrich и др., 2003b), похожая на полу-
ченнуюдля других дипептидных моделей таких, как, например, Ac—Phe—NHMe или
Ac—Trp—NHMe (см. выше). Кроме того, были изучены производные валина, глицина
и пролина. Исследование валинамида не привело к однозначному соответствиюмежду
теоретическими и экспериментальными результатами, но согласно ab initio вычислени-
ям у трех самых устойчивых конформеров есть внутримолекулярные водородные связи
(Lavrich и др., 2002). У N-ацетилглицина был обнаружен только один конформер с
внутримолекулярной водородной связью между карбонильной группой кислоты и
амидным протоном (Lovas и др., 2004). Были также обнаружены два конформера каж-
дой молекулы в экспериментальных исследованиях 4(S)- и 4(R)-гидроксипролина
(Lessari и др., 2005). И снова у каждого конформера была обнаружена внутримоле-
кулярная водородная связь или между одной парой электронов атома азота кольца и
OH карбоксильной группы, или между NH и C=O.
Исследование дикетопиперазина предложило интересное объяснение конформа-
ционных свойств циклопептидов (Bettens и др., 2000). Был обнаружен только один
изомер, который имеет структуру, отличнуюот структуры в твердой фазе, получае-
мой с помощьюрентгеновской кристаллографии.
Кроме того, модели пептидов (Lavrich и др., 2003a; Ohashi и др., 2004) и аналоги
тирозина и триптофана, тирамина (Melandri и Maris, 2004) и триптамина (см. раз-
дел 1.3) были изучены посредством СВЧ спектроскопии.
Наконец, необходимо упомянуть о том, что все изолированные аминокислоты,
исследованные в газовой фазе до сих пор, не являются амфионами. Данные структу-
ры возникают в результате агрегации с водой. Возникает вопрос, сколько молекул
воды необходимо для образования амфиона. За исключением теоретических подхо-
дов (см. например, Ding и Krogh-Jespersen (1992), Jensen и Gordon (1995), Gutowski и
др. (2000), Kassab и др. (2000), Chaudhari и др. (2004, 2005a, b)), Боуэн, а также
Джонсон и его коллеги (Diken и др., 2004, 2005; Xu и др., 2003) анализировали клас-
теры группы анионов глицина/воды, применяя масс-спектрометрию, фотоэлектрон-
нуюспектроскопию(Xu и др., 2003) и методы ИК фотодиссоциации (Diken и др.,
2004, 2005). Хотя эти системы являются анионами, утверждают, что роль дополни-
тельного электрона зависит от гидратации. Таким образом, по результатам, получен-
ным из исследования анионов, можно сделать вывод о том, что для формирования
амфиона в нейтральном кластере необходимо меньшее число молекул воды. Боуэн и
его коллеги нашли, что амфионная структура образуется при добавлении пяти мо-
лекул воды. Джонсон и его коллеги наблюдали формирование кластеров (глицин/
H2O)12, – . Будущие ИК исследования эффективно охлажденных анионов глицина/воды
сделают возможным изучение формирования структур кластеров различных разме-
ров. Первый ИК спектр фотодиссоциации, зарегистрированный для «теплого» клас-
тера, глицин/(H2O)6
– не может быть однозначно интерпретирован (Diken и др., 2005).
Кроме кластеров глицина с водой, Боуэн и его коллеги исследовали анионные
кластеры Trp и Phe с водой. Было найдено, что для образования амфиона необходи-
ма сольватация четырьмя молекулами воды (Xu и др., 2003).
1.5. Спектральный анализ пептидных структур
Стимулом исследования поведения пептидов является получение информации о дви-
жущих силах трансформации белков. В экспериментах в газовой фазе можно иссле-
довать изолированные пептиды. Также можно определить зависимость формирова-
ния различных вторичных структур от последовательности аминокислотных остат-
ков. Даже для защищенных аминокислот могут быть рассмотрены различные мотивы
вторичных структур (г-виток, в-пласт и т.д.), см. раздел 1.4. Рассмотрение агрегации
пептидов помогает изучениюселективности и эффективности межмолекулярных
пептидных связей. Наконец, последовательное добавление молекул воды (процесс
микросольватации) позволяет проанализировать влияние сольватации на структуру
пептидов.
Были исследованы три основных типа аминокислот и пептидов:
1) незащищенные пептиды со свободной кислотной группой COOH, а также
группой NH2; 2) частично защищенные пептиды с ацетилированной группой NH2
и COOH группой, которая или не модифицирована, или метилирована; 3) циклопеп-
тиды, у которых соединены концы (COOH и NH2).
Как уже было сказано во введении, первуюэкспериментальнуюработу по изуче-
ниюпептидов выполнили Леви и его коллеги. Они применяли РДФИ и ЛИФ спек-
троскопиюдля дипептидов Trp—Gly, Gly—Trp, Phe—Trp, Trp—Phe и Trp—Trp и три-
пептидах Trp—Gly—Gly и Gly—Gly—Trp (Cable и др., 1987, 1988a, b). Спустя более чем
10 лет де Ври и его коллеги продолжили эту работу и исследовали ряд дипептидов
(Gly—Tyr, Ala—Tyr, Tyr-Ala) и трипептид Phe—Gly—Gly (Cohen и др., 2000). В этой
работе также применялась спектроскопия УФ/УФ выжигания провалов для опреде-
ления числа конформеров различных веществ, которые вносят вклад в РДФИ
спектр. Более того, было сделано предварительное определение возможных структур
путем сравнения пиков РДФИ спектров с вычислениями, выполненными для соот-
ветствующих молекул, находящихся в состоянии S0. Подобные же исследования
(с применением УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса) выполнили Кляйнер-
манс и его коллеги (Hьnig и др., 2003) для дипептидов Gly—Trp, Trp—Ser и Pro—Trp
(см. рис. 1.16).
Все эти приложения дают возможность определить число конформеров. Однако,
в отличие от УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса, применение методов
ИК/УФ двойного резонанса позволяет получить информациюо структурах в состоя-
нии S0. Таким образом, сравнивая колебательные частоты, полученные эксперимен-
тально, с расчетными значениями и значениями, полученными для меньших субъе-
диниц, можно получить сведения о структурах. Группа автора этой главы сначала
применяла ИК/РДФИ для защищенного дипептида Ac—Val—Phe—OMe (Unterberg и
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 49
др., 2003) (см. рис. 1.17). Спектры регистрировались в области NH и области амида
I/II. Использование новой ИК системы с высоким разрешением в области амида I/II
позволило нам определить близко расположенные колебательные частоты связи
C=O. Согласно данным, полученным для Ac—Phe—OMe и согласующимися с вычис-
лениями методом Хартри-Фока в приложении к дипептидам, для данной молекулы
возможна структура в-пласта. Интересно, что для дипептидов был получен только
один изомер, что указывает на конформационнуюпреселекциюв газовой фазе. Это
частично является следствием влияния защитных групп, которые исключают образо-
вание изомеров, формирующих межмолекулярные структуры с водородными связя-
ми между кислотными и основными концевыми группами.
Начиная с 2004 года, был опубликован ряд статей об исследованиях защищенных
пептидов с применением ИК/РДФИ техники. Монс и его коллеги исследовали раз-
личные дипептиды и трипептиды с цельюполучения моделей различных элементов
вторичных структур (Chin и др., 2004, 2005b, c). Были исследованы конформеры
Ac—Pro—Phe—NH2 и Ac—Phe—Pro—NH2 (Chin и др., 2004), а также Ac—Phe—Gly—NH2
и Ac—Gly—Phe—NH2 (Chin и др., 2005c) (см. рис. 1.18). Кроме того, ряд трипептидных
моделей вида Ac—X—Phe—NH2 (X = Gly, Ala, Val) (Chin и др., 2005b) был проанализи-
рован при помощи ИК/РДФИ спектроскопии в сочетании с ab initio ТФП вычисле-
ниями. В случае с Ac—Pro—Phe—NH2 последовательность, состоящая из двух гL-вит-
ков, оказалась самой стабильной структурой (см. рис. 1.8e), тогда как для
Ac—Phe—Pro—NH2 вL(гош—)-гL наиболее устойчива структура, показанная на
рис. 1.8c. Менее выгодный конформер образует структуру в-витка (рис. 1.8d; такие
структуры также называют структурами C10). Хотя добавление Pro в аминокислотную
Рис. 1.16. РДФИ и УФ/УФ спектры выжигания провалов для дипептида Trp-Ser,
указывающие на присутствие двух изомеров (Hьnig и др., 2003). Кроме
того, видны низкочастотные пики. Структура, показанная на этом ри-
сунке, не обязательно связана с одним из спектров, так как прямой ин-
формации о структуре из УФ спектров не было получено. (Подробнее
см. в тексте.) (Рисунок взят из Hьnig и др. (2003).)
последовательность пептида может благоприятствовать образованиюструктуры в-вит-
ка, Pro оказался не самым важным компонентом. Всегда существует баланс между
прочностьюмежмолекулярных водородных связей (которые прочнее в структурах
г-витка и относительно слабы в в-витках, что определяется по небольшому красному
смещениюдля группы NH, вовлеченной в водороднуюсвязь) и натяжением основной
цепи пептида (которое слабее для в-витка). Кроме того, взаимодействия вида NH···р
могут повлиять таким образом, что структуру будет невозможно предсказать на осно-
вании последовательности аминокислот.
Конкуренция различных взаимодействий приводит к двум конформерам трипеп-
тидов Ac—Phe—Gly—NH2 и Ac—Gly—Phe—NH2. Наиболее устойчивый изомер
Ac—Phe—Gly—NH2 имеет структуру вL(a)-гL, а менее выгодный изомер имеет конфи-
гурацию в-витка. В случае с Ac—Gly—Phe—NH2 образуется последовательность двух
г-витков (см. рис. 1.18) и одного в-витка (Chin и др., 2005c). Для Ac—Phe—Gly—NH2
предпочтительнее в-виток типа II, тогда как для Ac—Gly—Phe—NH2 наиболее вероя-
тен виток типа I. Различные типы в-витков различаются по ориентации основной
цепи пептида, характеризуемой двумя наборами углов ш и (Venkatachalan, 1986;
Hutchinson и Thornton, 1994). Подобная структура также наблюдается у других ди-
пептидов ряда Ac—X—Phe—NH2 (где X = Ala, Val). В частности, были обнаружены два
изомера со структурами г- или в-витков (Chin и др., 2005b).
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 51
ИК/РДФИ спектр
1765 Сложный
эфир
1711 Ацетил
Волновое число ИК лазера (см–1)
Рис. 1.17. ИК/РДФИ спектры Ac—Val—Phe—OMe в областях амида I (C=O), ва-
лентных CH и амида А колебаний (Unterberg и др., 2003). Структура,
показанная на этом рисунке, получена в результате анализа ИК спектра
в сочетании с ab initio вычислениями. Переходы для NH c частотами
более 3400 см–1 (с одним обертоном при 3420 см–1) указываю т на
структуру, относящуюся к в-пласту. Подробнее см. статьюUnterberg и
др. (2003). (Рисунок взят из Unterberg и др. (2003).)
52 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
в-виток II (а)
Рис. 1.18. а — ИК/РДФИ спектры области амида А (колебания NH) для раз-
личных изомеров пептидов Ac—Phe—Gly—NH2 и Ac—Gly—Phe—NH2.
Наиболее интенсивные изомеры А трипептидов Ac—Phe—Gly—NH2
и Ac—Gly—Phe—NH2 имеют структуры вL—гL (сравните с подобной
структурой на рис. 1.8c) и гL—гL (сравните с рис. 1.8e), соответственно.
Второй компонент B представляет различные структуры в-витка (типы
II и I) для двух модельных трипептидов. Вычисленные колебательные
частоты получены методом ТФП (уровень B3LYP/6-31 + G(d)). Подроб-
нее см. Chin и др. (2005).) (Рисунок взят из Chin и др. (2005c).); b — са-
мые устойчивые структуры у Ac—Phe—Gly—NH2. Структура вL(a)—гL
включает не только взаимодействие C5 и C7, но также и взаимодейст-
вие N—H···р между основной и боковой цепями, что стабилизирует
связь. (Рисунок взят из Chin и др. (2005c).)
Изучение дипептидов было продолжено для защищенных трипептидов, которые
используются как модели тетрапептидов. В недавних публикациях группа Монса ис-
следовала системы Ac—Phe—Gly—Gly—NH2 (Chin и др., 2005a), Ac—Ala—Phe—Ala—
—NH2, Ac—Ala—Ala—Phe—NH2 и Ac—Phe—Ala—Ala—NH2 (Chin и др., 2005e).
Ac—Phe—Gly—Gly—NH2 имеет структуру с двумя последовательными в-витками
(см. рис. 1.8g) при отсутствии винтовой структуры. Ac—Phe—Ala—Ala—NH2 содержит
комбинациюструктур в-пласта и двух г-витков (вL(a)-гL-гL). Ac—Ala—Ala—Phe—NH2
формирует структуру, содержащую в-виток и мотив гL (Chin и др., 2005e) (см. рис.
1.8f). Третий изомер, Ac—Ala—Phe—Ala—NH2, служит первой динамической моделью
для описания винтовой структуры типа 310, в которой наблюдаются два последова-
тельных в-витка (типа III и типа I), что указывает на начало винтовой структу-
ры, состоящей из трех аминокислотных остатков на одном витке (Chin и др., 2005e)
(рис. 1.8h).
Группа автора этой главы продолжила работу с модельным трипептидом
Ac—Val—Tyr(Ме)—NHMe (Fricke и др., 2004). Хромофор здесь — тирозин, содержа-
щий группу OMe вместо группы OH. Такая модификация была сделана для того, что-
бы исключить образование любых внутримолекулярных водородных связей с груп-
пой OH боковой цепи. Для данной молекулы был получен только один изомер. Его
структура может быть интерпретирована как вL—вL (структура, полностьюотнося -
щаяся к в-пласту) (Fricke и др., 2004) (см. рис. 1.19). Так как спектральные парамет-
ры для в-витков очень схожи, то для модельного трипептида был записан полный
спектр вплоть до частот 1000 см–1 при помощи нашей лазерной системы с высо-
ким разрешением (см. рис. 1.19 (Fricke и Gerhards, 2005)). Можно сказать, что
Ac—Val—Tyr(Ме)-NHMe — наиболее хорошо спектроскопически исследованная мо-
лекула такого размера. Наша лазерная система с высоким разрешением помогла за-
регистрировать спектры в области валентных колебаний NH и амида I/II вплоть до
характеристичной области ~ 1000 см–1. Тем не менее, спектры, наблюдаемые для
двух полностьюразличных структур, описанных здесь, очень похожи. Это является
хорошим примером того, что спектральные исследования иногда неоднозначны.
Хотя обширная спектральная информация и может быть получена (см. например,
интерпретацию Ac—Phe—OMe в разделе 1.4), надежная идентификация структуры
возможна только по полному спектру.
Наконец, был исследован модельный тетрапептид Ac—Leu—Val—Tyr(Ме)—NHMe,
в результате чего были получены две структуры, содержащие или набор трех после-
довательных г-витков, или комбинацию в- и г-витков (Fricke и др., 2006c). Поводом
для выбора такого варианта тетрапептида послужила идея моделирования пептида
KLVFF (Lys—Leu—Val—Phe—Phe) (в нашей модели вместо Phe присутствует Tyr),
важного для изучения болезни Альцгеймера (см. раздел 1.6).
Можно сказать, что большая часть исследований защищенных пептидов была вы-
полнена до сих пор с цельюсистематичес кого исследования элементов вторичных
структур и понимания движущих сил и механизмов свертывания пептидов. По неза-
щищенным пептидам были опубликованы две статьи, рассматривающие системы
Trp—Gly, Gly—Trp и Trp—Gly—Gly с помощьюИК/РДФИ спектроскопии в области
валентных колебаний NH (Hьnig и Kleinermanns, 2004), а также в характеристичной
области спектра при применении лазера на свободных электронах (Bakker и др.,
2005). В случае с Trp—Gly были обнаружены, по крайней мере, четыре конформера.
Однако ИК спектры были получены только для двух из них. Наиболее интенсивный
изомер практически полностьюразвернут. Однако взаимодействие N—H···NH2
между группой NH Trp и группой NH2 свободной кислоты все еще имеет место. Для
Gly—Trp наблюдаются два конформера, и для обоих наблюдается (как и для Trp—Gly)
взаимодействие N—H···NH2. Однако один конформер более вытянутый (разверну-
тый), тогда как другой содержит прочнуюводороднуюсвязь ОН···O=C между груп-
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 53
пой COOH глицина и группой CO Trp. Для трипептида Trp—Gly—Gly наблюдаются
два изомера. В одном изомере обнаруживается прочная водородная связь ОН···O=C
между группой COOH и первым, и вторым глициновыми остатками. Кроме того, об-
разуется водородная связь между NH индольной группы и C=O группы COOH. За
исключением взаимодействия N—H···NH2, второй изомер практически полностью
развернут. Структуры, полученные на основе ИК спектров, не совсем однозначны,
и из-за дополнительных свободных групп COOH и NH2 необходимо рассчитывать
больше структур для свободных пептидов, чем для защищенных систем. Данные
группы могут участвовать в нескольких водородных связях (см. например, простую
молекулу Phe (Snoek и др., 2000)), что приводит к усложнениюанализа структуры.
Третий класс важных пептидов — это циклопептиды, у которых N- и C-концы
соединены. Данные молекулы представляют интерес с точки зрения выполнения
ими различных биологических функций таких, как, например, перенос ионов
(Duax и др., 1996; Kubik и др., 2002). Первые спектроскопические исследования
изолированных пептидов, отобранных по массе, были выполнены Вайнкауфом и
54 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
Экспериментальный
Относящийся
к в-пласту
в-виток
Волновые числа ИК-лазера (см–1) Волновые числа ИК-лазера (см–1)
Относящийся
к в-пласту
в-виток
Рис. 1.19. ИК/РДФИ спектр модельного трипептида Ac—Val—Tyr(Ме)-NHMe в
областях амида А (колебания NH) и амида I/II (см. также Fricke и др.
(2004)), а также в характеристичной области спектра вплоть до
1000 см–1. Сравнивая экспериментальный спектр с расчетным (ТФП,
функционал B3LYP, базисный комплект 6-31 + G(d)), невозможно сде-
лать однозначный выбор между структурой в-пласта и структурой
в-витка, что указывает на трудности, которые могут возникнуть в неко-
торых случаях несмотря на наличие спектральной информации
его коллегами. Они исследовали циклический пептид Trp—Gly с помощьюРДФИ и
УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса (Wiedemann и др., 2004). Де Ври и его
коллеги первыми применили ИК/РДФИ метод. Они изучали циклопептид Phe—Ser
(Abo-Riziq и др., 2005). Для него было обнаружено пять различных изомеров (так-
же с помощьюУФ/УФ спектроскопии двойного резонанса). ИК спектры изомеров,
а также соответствующие структуры и их расчетные колебательные частоты показа-
ны на рис. 1.20. Превосходное совпадение расчетных и экспериментальных значе-
ний указывает на то, что идентификация различных изомеров может быть доста-
точно достоверной.
Всего одна статья была опубликована по микросольватации пептидов. В ней был
исследован комплекс Ac—Val—Tyr(Ме)—NHMe(H2O)1 (Fricke и др., 2004). По
ИК/РДФИ спектру можно сказать, что молекула воды действует как акцептор водо-
рода и соединена водородной связьюс защитной группой NHMe. Исследование бо-
льших кластеров (с большим количеством молекул воды), а также исследования раз-
личных кластеров пептид/вода — важное направление будущих экспериментов. Не-
обходимо упомянуть, что наблюдение больших кластеров пептидов с несколькими
молекулами воды при помощи масс-спектрометрии — не проблематично, но значи-
тельная фрагментация таких кластеров после УФ возбуждения мешает получить од-
нозначнуюкорреляциюмежду наблюдаемым ИК/РДФИ спектром и размером клас-
тера. Таким образом, необходимо регистрировать бихромные РДФИ спектры (см.
рис. 1.1 и 1.2), процесс получения которых характеризуется пониженной фрагмен-
тацей.
В настоящее время проводится значительная работа по изучениюдругих типов
пептидов (защищенных или незащищенных, циклопептидов). Область применения
анализа больших пептидов в газовой фазе быстро растет, и некоторые группы ученых
уже преуспели в исследованиях больших систем. Что касается незащищенных разно-
видностей, дельта-сониндуцирующий нонапептид (ДИСП) был исследован с помо-
щьюлазера на свободных электронах в области 600—2200 см–1. Но только с помо-
щьюэкспериментов в характеристичной области спектра и области амида I/II невоз-
можно отличить свернутые структуры от развернутых (Bakker и др., 2005). Однако
этот эксперимент — только первый шаг, который указывает на возможность иссле-
дования больших систем. Точно так же циклический грамицидин S, состоящий из
10 аминокислотных остатков, был исследован с применением ИК/РДФИ метода в
области валентных колебаний NH. У него было обнаружено несколько изомеров
(de Vries, 2005). Наконец, модельная система для в-пласта, образованного агрегацией
двух трипептидов (димер Ac—Val—Tyr—NHMe), была исследована в области валент-
ных NH и C=O колебаний с использованием новой лазерной системы с высоким
разрешением (Gerhards и др., 2006a). Этот димер —первая модель в-пласта, которая
содержит и «внутренние», и «внешние» связи (см. рис. 1.10). Таким образом, в-пласт
служит модельюячеек, из которых можно составить большой в-пласт путем просто-
го масштабирования.
Все стратегии и результаты схожи тем, что они подверждают эффективность ком-
бинированной ИК/УФ спектроскопии в качестве мощного инструмента исследова-
ния больших пептидных систем. Хотя РДФИ спектры в целом содержат очень широ-
кие пики, соответствующие ИК/РДФИ спектры демонстрируют спектральные пере-
ходы с хорошим разрешением. Более того, ширина пика — это признак типа перехо-
да. Узкие пики указывают на наличие свободных NH или CO групп, тогда как более
широкие пики соответствуют структурам с водородными связями. Однако данные
тенденции незначительно зависят от размера системы. На вопрос, почему ИК спек-
троскопия намного менее чувствительна, чем УФ спектроскопия, к размеру системы,
ответить нелегко. По всей видимости, частично это происходит из-за ситуации, ког-
да в большой молекуле многие существенные колебательные переходы локализова-
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 55
Рис. 1.20. ИК/РДФИ спектры циклопептида Phe-Ser для всех пяти эксперимен-
тально полученных изомеров. Колебательные частоты рассчитаны мето-
дом ТФП (B3LYP/6-31G(d, p)). Расчетные частоты превосходно совпада-
ют с экспериментальными значениями, что приводит к однозначному
определению( Abo-Riziq и др., 2005) пяти структур, которые приводятся
внизу. (Рисунок взят из Abo-Riziq и др. (2005).)
ны. Можно также утверждать, что УФ лазер взаимодействует только с небольшим
фрагментом молекулы и что (для некоторых систем) в рамках этого взаимодействия
не существует достаточного числа колебательных частот.
Для получения достоверных результатов из комбинированных ИК/УФ исследова-
ний необходимо придерживаться следующих правил:
1. Подход должен быть одинаков и для малых, и для больших систем. Как было уже
описано в данном обзоре, такой метод оказался очень успешным.
2. Необходимо охватывать широкуюспектральнуюобласть ИК спектра путем испо-
льзования лазерных источников наносекундного режима.
3. Если систему невозможно определить с точностьюдо относительно небольшого
числа альтернативных структур, то можно применять спектроскопиювысокого
разрешения (вращательную), которая в настоящее время имеет боќльшие ограниче-
ния на размеры систем, чем ИК/УФ методы.
4. В дополнение ко всем измерениям необходимы тщательные вычисления.
Обычно первоначальный выбор изомера выполняется при помощи вычислений
методом силовых полей и молекулярной динамики. Самые устойчивые конформеры
затем рассчитывают методами ab initio и ТФП, и, если возможно, также на уровне
теории MP2 (см. раздел 1.7). Представляется также логичным учитывать ангармони-
ческие связи, особенно для спектров в середине ИК диапазона с частотами ниже
1000 см–1.
НА РУССКОМ ЯЗЫКЕ
Пожалуй, важнейшим достижением масс-спектрометрии за последние 20 лет стало
проникновение в мир биологических природных соединений. Благодаря ионизации
электрораспылением и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации
масс-спектрометрии стали доступны сахара, нуклеиновые кислоты, белки и пептиды,
липиды и прочие биоорганические молекулы. Самые крупные успехи связаны имен-
но с исследованием белков. Благодаря чувствительности, информативности, эксп-
рессности, возможности работать со смесями масс-спектрометрия стала сегодня наи-
более востребованным методом анализа этих важнейших соединений. Уже быстрое и
надежное установление первичной структуры белков, т.е. последовательности амино-
кислотных звеньев, могло бы считаться превосходным результатом. Однако проводи-
мые в XXI веке исследования позволяют изучать и стуктуры более сложных порядков
(от 2 до 4), включая нековалентные взаимодействия белков с образованием надбел-
ковых структур. Масс-спектрометрия оказалась способной устанавливать тип и место
посттрансляционных модификаций, работать с гликопротеинами, липопротеинами,
фосфопротеинами и т.д. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формирова-
ниюв конце прошлого века нового научного направления — протеомики.
Практические достижения масс-спектрометрии белков и пептидов неоспоримы.
Тем не менее, работа со столь большими молекулами, которые ранее были недоступ-
ны классической органической масс-спектрометрии, поставила новые теоретические
вопросы. Справедлива ли квазиравновесная теория для больших молекул? Какова
структура молекулярных и фрагментных ионов пептидов? Отличаются ли структуры
белков и пептидов в газовой фазе и растворе?
Настоящая книга — это собрание статей по основным аспектам, лежащим в осно-
ве масс-спектрометрии биомолекул. Выбранные темы разделены на три части:
1) структура и динамика биомолекул в газовой фазе; 2) активация, диссоциация и
реакционная способность; 3) термохимия и энергетика. К сожалению, в русскоязыч-
ной литературе пока отсутствуют монографии, посвященные масс-спектрометрии
белков и пептидов. Немногочисленные группы масс-спектрометристов, работающие
в России в этой области, ориентируются на англоязычные издания и оригинальные
статьи и обзоры, хотя число наших соотечественников, работающих в масс-спектро-
метрии пептидов за рубежом, очень значительно. В качестве примера можно привес-
ти Романа Александровича Зубарева, создателя метода диссоциации при захвате
электрона и автора одной из глав этой книги. Да и сама Юлия Ласкин имеет россий-
ские корни. Книга рассчитана на продвинутых читателей и будет интересна физико-
химикам, спектроскопистам и биохимикам, работающим с белками и пептидами. Бе-
зусловно, это хорошая возможность познакомиться с современными достижениями в
этой области и для российских масс-спектрометристов, особенно учитывая, что це-
лый ряд описываемых подходов и методов пока не используется в нашей стране.
Президент Всероссийского
масс-спектрометрического общества,
доктор химических наук, профессор
А.Т. Лебедев
Эта книга посвящается памяти Хавы Лифшиц —
одной из пионеров в области химии ионов в газовой фазе
и основ масс-спектрометрии — великого ученого,
великолепного учителя и хорошей подруги.
Джулия Ласкин
ПРЕДИСЛОВИЕ
Изобретение способов перевода биологических молекул в газообразное состояние
при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) и
ионизации электрораспылением (ИЭР) привело к революции в биологической
масс-спектрометрии. Развитие этих методов было очень успешным благодаря свой-
ственным им уникальным аналитическим характеристикам. После их внедрения ста-
ло возможным измерять молекулярные массы с высокой точностью, а также успеш-
но определять последовательности аминокислотных остатков в пептидах. Сейчас с
помощьюмасс-спектрометрии можно получить и сведения о пептидных и белковых
структурах высших порядков. Исключительно высокая чувствительность, высокое
разрешение по массе и быстрота анализа — ключевые факторы, благодаря которым
масс-спектрометрия стала лидером среди аналитических методов, используемых для
идентификации и исследования биомолекул.
Успехи данного направления в значительной степени основаны на принципах
масс-спектрометрии, разрабатываемых с середины 1970-х для малых органических
молекул. Однако, в процессе изучения поведения биомолекул в газовой фазе возник-
ло множество трудностей, связанных с гибкостьюи размером данных объектов. На-
пример, было сложно достигнуть эффективной фрагментации больших молекул тра-
диционными масс-спектрометрическими способами. Исследование фундаменталь-
ных ограничений существующих методов активации ионов привело к развитию но-
вых аналитических подходов к изучениюфр агментации больших молекул в газовой
фазе. Установление механизмов фрагментации молекул и влияния первичной и вто-
ричной молекулярных структур на наблюдаемые спектры диссоциации улучшило
идентификациюбиомолекул в прикладных исследованиях.
Химия биомолекулярных ионов в газовой фазе развилась во множество новых за-
хватывающих научных направлений во многом благодаря большим размерам биомоле-
кул, их конформационной гибкости и их способности существовать в виде многоза-
рядных ионов. Многозарядные биомолекулярные ионы — превосходные объекты для
изучения ионно-ионной химии и процессов, следующих за захватом ионами медлен-
ных электронов. В настоящее время разработаны различные способы получения фено-
менологического понимания образования и фрагментации катион-радикалов с избы-
точным содержанием водорода, молекулярных катион-радикалов и анион-радикалов
пептидов и белков. Разработка новых подходов в термохимии биомолекул, находящих-
ся в газообразном состоянии, и исследование энергетики их диссоциации — главная
тема данного научного направления. Колебательная спектроскопия биомолекулярных
ионов — еще одна быстро развивающаяся область. В свою очередь, новые методы
спектроскопии высокого разрешения были успешно применены к большим молеку-
лярным системам, давая ценную информацию, дополняющую масс-спектрометриче-
ские данные. Химическое взаимодействие биомолекул с твердыми мишенями создает
потенциал для подготовки новых поверхностей для разнообразных приложений в био-
логии и биотехнологии.
Кроме того, существует несколько фундаментальных проблем, связанных с физи-
кой процессов. Например, вопрос эргодичности и/или статистического или нестати-
стического поведения биомолекул при их фрагментации возник в результате разви-
тия нескольких методов диссоциации, включая диссоциацию при захвате электрона
(ДЗЭ) и фотодиссоциацию. Старые вопросы, поставленные много лет назад при ис-
следовании органических молекул, снова вышли на передний план: подвергаются ли
газофазные биомолекулы внутримолекулярному перераспределениюколебательной
энергии (ВПКЭ) перед их диссоциацией? Все ли виды колебаний вовлечены в
ВПКЭ? Существуют ли селективность и реакционная способность, управляемые за-
рядами? Тот факт, что большие белки фрагментируют в масс-спектрометрах за ко-
роткие промежутки времени (что абсолютно необходимо для их анализа и секвени-
рования), несколько удивителен, принимая во внимание наши предыдущие сведения
о диссоциации относительно малых органических молекул в газовой фазе и ее опи-
сание с использованием статистических теорий [Райс-Рампспергер-Кассель-Маркус/
квазиравновесная теория (РРКМ/КРТ) и т.п.].
Настоящая книга — это собрание статей по основным аспектам, лежащим в осно-
ве масс-спектрометрии биомолекул. Выбранные темы разделены на три части:
1) структура и динамика биомолекул в газовой фазе; 2) активация, диссоциация и
реакционная способность; 3) термохимия и энергетика.
Фундаментальная масс-спектрометрия всегда была неразрывно связана с разно-
образием методов газофазной спектроскопии, которые обеспечивают уникальные
подходы к изучениюструктуры и динамики ионов и молекул в газовой фазе. Ультра-
фиолетовая и инфракрасная спектроскопия высокого разрешения, о которой расска-
зано в главе 1, позволяет изучать структуру и динамику индивидуальных конформе-
ров нейтральных биомолекул, помогая в исследовании влияния растворителя на их
свойства, поведения кластеров биомолекул в газовой фазе и молекулярного распо-
знавания. В главе 2 приводится пример исследований переноса электронов в железо-
серных (Fe—S) кластерах с помощьюфотоэл ектронной спектроскопии фотоотщепле-
ния высокого разрешения. В частности, данный метод используется для изучения
влияния растворителя и окружающей среды белка на электронные свойства кластера
кубического типа [4Fe—4S], наиболее распространенного агента для переноса и на-
копления электронов в металлопротеинах.
Ионно-молекулярные реакции и водородно-дейтериевый обмен традиционно ис-
пользовались в масс-спектрометрии для установления структуры частиц. В главе 3
приводится краткий обзор применения этих методов для изучения структуры и кон-
формации биомолекул в газовой фазе. В то время как методы спектроскопии в настоя-
щее время ограничиваются относительно малыми системами, масс-спектрометрия ис-
пользуется даже для исследования четвертичной структуры больших белковых комп-
лексов. Экспериментальные подходы, используемые в таких исследованиях, изложены
в главе 4. Конформации белка и его свертывание в газовой фазе обсуждаются в главе 5.
Понимание динамики белка при отсутствии растворителя важно для отделения влия-
ния растворителя от влияния собственных свойств белков на их поведение в растворе.
Динамика внутримолекулярного перераспределения колебательной энергии
(ВПКЭ) для биомолекул в газовой фазе рассматривается в главах 6 и 7. Классические
траекторные моделирования с использованием полуэмпирических поверхностей по-
тенциальной энергии PM3, описанные в главе 6, способствуют пониманию крайне бы-
строй динамики процессов, следующих за фотоионизацией биомолекул, и примени-
мости статистических теорий к диссоциации этих больших гибких молекул. Исследо-
вание ионной химии пептидов и белков в газовой фазе открыло огромное множество
очень интересных явлений, некоторые из которых (например, диссоциация в результа-
те захвата электронов и фотодиссоциация) были описаны как неэргодические процес-
сы, в которых ВПКЭ отсутствует. Все «за» и «против» ВПКЭ и эргодического поведе-
ния биомолекул по результатам экспериментов рассматриваются в главе 7.
Фрагментация протонированных пептидов в газовой фазе — важное условие для
идентификации пептидов и белков с использованием тандемной масс-спектромет-
рии (МС/МС). Понимание механистических аспектов фрагментации пептидов в за-
висимости от их последовательности и структуры, изложенное в главе 8, играет цен-
тральнуюроль в интерпретации спектров тандемной масс-спектрометрии и мето-
дов оптимизации поиска в базах данных. В большинстве масс-спектрометрических
исследований используются локализованные биомолекулы (протонированные или
катионизированные металлами), рожденные в результате использования мягких ме-
тодов ионизации. Образование и диссоциация пептидных катион-радикалов, опи-
санные в главе 9, — это новая быстро развивающаяся область ионной химии биомо-
лекул в газовой фазе. Такие ионы образуются в результате фрагментации в газовой
фазе комплексов нейтральных пептидов с переходными металлами и различными
органическими лигандами.
Столкновительная активация и многофотонное возбуждение традиционно испо-
льзуются для идентификации биомолекул в различных масс-спектрометрических
приложениях. О текущем положении дел в исследовании многофотонного возбужде-
ния, спектроскопии и фотодиссоциации биомолекул в газовой фазе рассказано в
главе 10. Глава 11 описывает моделирование передачи энергии в столкновениях
ионов с атомарными нейтральными частицами и поверхностями методом классиче-
ских траекторий. Явления, наблюдаемые после столкновений ионов с поверхностью,
и аппаратура, используемая в таких исследованиях, представлены в главе 12 с укло-
ном на осаждение биологических молекул на разнообразные поверхности. Осажде-
ние используется для специфической модификации поверхности при помощи пучка
отобранных по массе ионов любого размера и состава или для разделения и подго-
товки биомолекул на подложках в чистом виде для последующего анализа.
Еще один метод активации ионов в биологической масс-спектрометрии основан
на захвате медленных электронов многозарядными ионами. Диссоциация при захва-
те электрона (ДЗЭ), обсуждаемая в главе 13, открывает разнообразие уникальных ка-
налов диссоциации и обеспечивает информациюо структуре иона в дополнение к
известной из экспериментов по столкновительной диссоциации и многофотонному
возбуждению. В главе 14 представлены фундаментальные принципы ионно-ионной
химии биомолекул. Ионно-ионные реакции обеспечивают средство для управления
зарядовым состоянием многозарядных пептидов и белков. Методики понижения за-
ряда в реакциях многозарядных биомолекул с однозарядными ионами противопо-
ложной полярности разрабатываются в качестве мощного инструмента исследования
структуры пептидов и белков.
Масс-спектрометрия широко используется для термохимических исследований.
Однако изучение термохимии и энергетики диссоциации пептидов и белков является
достаточно проблематичным из-за неприменимости большинства методов, разрабо-
танных для малых и средних по размеру ионов, к интерпретации фрагментации бо-
льших биомолекул. В главе 15 представлен краткий обзор масс-спектрометрических
подходов, используемых для изучения термохимии биомолекул, и изложены текущее
положение в этой области и ограничения существующих методов, с уклоном на
определение сродства биомолекул к протону и ионам щелочных металлов. В главе 16
описаны экспериментальные методы изучения энергетики и энтропийных эффектов
при диссоциации пептидов и белков.
Наконец, мы хотели бы поблагодарить авторов глав, которые потратили свое
время и приложили значительные усилия для подготовки высококачественных ста-
тей для данной книги. Особая благодарность Джину Футреллу за его щедруюпомощь
на различных стадиях проекта и ценные рекомендации по содержаниюнескольких
глав. Мы также благодарны многим другим коллегам, которые предоставили свои
комментарии и предложения по поводу содержания данной книги.
Джулия Ласкин и Хава Лифшиц
АВТОРЫ
Richard L. Beardsley, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Kathrin Breuker, Institute of Organic Chemistry and Center for Molecular Biosciences
Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck, Innrain 52a, A-6020 Innsbruck, Austria.
Guilong Cheng, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
R. Graham Cooks, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
Robert C. Dunbar, Chemistry Department, Case Western Reserve University, Cleveland,
OH 44106.
You-Jun-Fu, Department of Physics, Washington State University, 2710 University Drive,
Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory and
Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O. Box
999, Richland, WA 99352.
R. Benny Gerber, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA 92697;
Department of Physical Chemistry and the Fritz Haber Research Center, The Hebrew University,
Jerusalem 91904, Israel.
Markus Gerhards, Heinrich-Heine Universitдt Diisseldorf, Institut fьr Physikalische
Chemie I, Universitдtstrasse 26.33.O2, 40225 Dьsseldorf, Germany.
Bogdan Gologan, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
M. Kirk Green, McMaster Regional Centre for Mass Spectrometry, Department of
Chemistry, McMaster University, Hamilton, Canada.
William L. Hase, Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University,
Lubbock, TX 79409-1061.
Kristin A. Herrmann, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Amy E. Hilderbrand, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona,
1306 East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Alan C. Hopkinson, Centre for Research in Mass Spectrometry and the Department of
Chemistry, York University, 4700 Keele Street, Toronto, Ontario, Canada M3J 1P3.
Julia Laskin, Fundamental Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
P.O. Box 999 K8-88, Richland, WA 99352.
Carlito B. Lebrilla, Department of Chemistry, University of California, Davis, CA
95616.
Chava Lifshitz, Department of Physical Chemistry and The Farkas Center for Light Induced
Processes, The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel.
Scott A. McLuckey, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive,
West Lafayette, IN 47907-2084.
Samy O. Meroueh, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre
Dame, Notre Dame, IN 46556-5670.
Asif Rahaman, Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University,
Lubbock, TX 79409-1061.
Carol V. Robinson, The University Chemical Laboratory, University of Cambridge,
Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, United Kingdom.
Dorit Shemesh, Department of Physical Chemistry and The Fritz Haber Research Center,
The Hebrew University, Jerusalem 91904, Israel.
K. W. Michael Siu, Centre for Research in Mass Spectrometry and the Department of
Chemistry, York University, 4700 Keele Street, Toronto, Ontario, Canada M3J 1P3.
Frank Sobott, Structural Genomics Consortium, University of Oxford, Botnar Research
Centre, Oxford OX3 7LD, United Kingdom.
Kihyung Song, Department of Chemistry, Korea National University of Education,
Chongwon, Chungbuk 363-791, Korea.
Jiangping Wang, Department of Chemistry, Wayne State University, Detroit, MI 48202.
Lai-Sheng Wang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University
Drive, Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory
and Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O.
Box 999, Richland, WA 99352.
Ping Wang, Department of Chemistry, The University of Akron, Akron, OH 44325.
Xue-Bin Wang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University
Drive, Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory
and Chemical Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O.
Box 999, Richland, WA 99352.
Chrys Wesdemiotis, Department of Chemistry, The University of Akron, Akron, OH
44325.
Justin M. Wiseman, Department of Chemistry, Purdue University, 560 Oval Drive, West
Lafayette, IN 47907-2038.
Vicki H. Wysocki, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Xin Yang, Department of Physics, Washington State University, 2710 University Drive,
Richland, WA 99352; W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory and Chemical
Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, MS K8-88, P.O. Box 999,
Richland, WA 99352.
Qingfen Zhang, Department of Chemistry, Box 210041, University of Arizona, 1306
East University Avenue, Tucson, AZ 85721-0041.
Roman Zubarev, Laboratory for Biological and Medical Mass Spectrometry.
Uppsala University, Box 583, Uppsala S-751 23, Sweden.
18 Авторы
Часть I
СТРУКТУРА И ДИНАМИКА
БИОМОЛЕКУЛ
В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ
Глава 1
Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура,
химическая активность, микросольватация, молекулярное распознавание
Маркус Герхардс
Дюссельдорфский университет
Генриха Гейне,
Институт физической химии I,
Дюссельдорф, Германия
1.1. Введение и исторические предпосылки
Как было уже отмечено в предисловии, перевод больших молекул в газообразное со-
стояние без их диссоциации затруднителен. Изучение такого процесса традиционно
базируется на применении масс-спектрометрических методов. При этом ощущается
недостаток спектроскопической информации об анализируемых молекулах. Для по-
лучения дополнительных сведений об энергиях различных электронных состояний, а
также о структурных и динамических изменениях исследуемых изолированных моле-
кул целесообразно сочетать масс-спектрометриюс различными спектроскопически-
ми методами. Данное предложение вызвано необходимостьюпоиска ответов на сле-
дующие вопросы:
1. Каковы движущие силы свертывания белка или агрегации пептидов?
2. Как сольватация изменяет вторичнуюструктуру пептидов, и как управлять дан-
ным процессом? Корректно ли при моделировании добавлять одну молекулу воды
за другой, чтобы определять структурные изменения белков?
Найдя ответы на эти вопросы на молекулярном уровне, мы сможем понимать и
предсказывать структуры и динамику пептидов. Основная идея данной главы — об-
зор комбинированных спектроскопических и масс-спектрометрических исследова-
ний. В ней будут рассматриваются только нейтральные аминокислоты и пептиды.
Спектроскопия ионов, еще одно быстроразвивающееся направление, в этой главе не
рассматривается.
Как будет отмечено в других главах, большие заряженные молекулы переводятся
в газовуюфазу с помощьюМАЛДИ (Karas и Hillenkamp, 1988), ЭРИ (Fenn и др.,
1989), ЛИФИЖ (лазерно-индуцированного формирования ионов из жидкости) (Kleinekofort
и др., 1996) или других источников. Нейтральные молекулы могут быть де-
сорбированы при помощи нагревания. Однако, в ходе этого процесса чистые амино-
кислоты и пептиды фрагментируют с выбросом молекулы CO2. В данной главе рас-
сматриваются различные способы ввода нейтральных молекул в газовую фазу. Про-
рыв в этой области был достигнут с помощьюизобретения источников с лазерной
десорбцией (см. раздел 1.2) в сочетании со сверхзвуковым охлаждением и лазерной
ионизацией нейтральных десорбированных молекул. Объединение масс-спектромет-
рии отобранных нейтральных молекул (ионизируемых для детектирования в виде ка-
тионов) с методами спектроскопии было инициировано пионерской работой Леви и
его коллег (Cable и др., 1987, 1988a, b; Rizzo и др., 1985, 1986b). Начав с анализа ами-
нокислот при помощи сочетания лазерной десорбции с флуоресцентной спектроско-
пией или резонансной многофотонной ионизацией, группа Леви увеличила размер
исследуемых молекул до трипептидов (Cable и др., 1987, 1988a, b). В результате спек-
троскопических исследований были получены сведения о колебаниях в состоянии
S1, преимущественно в низкочастотной области спектра, вплоть до нескольких со-
тен см-1. Однако, области амида I или амида II, так же как и валентные колеба-
ния NH, не были исследованы. Хотя работа группы Леви привела к фантастическим
спектроскопическим результатам, основной ее недостаток состоит в невозможности
четкой интерпретации полученных спектров. Во-первых, нельзя исключить, что эти
спектры — результат наложения спектров различных изомеров. Во-вторых, компью-
теры, существовавшие в конце 1980-х, не могли быть использованы для достоверно-
го предсказания колебательных спектров разных изомеров. Более того, структуры со-
стояний S1 все еще нельзя предсказать с точностью, доступной для состояний S0.
Даже вычисление энергий и колебаний трипептидов в состоянии S0 для сотен воз-
можных изомеров — задача непосильная для существующих компьютеров. Кроме
того, в этих вычислениях необходимо учитывать ангармоничность колебаний, осо-
бенно для области низких частот. Из-за указанных проблем спектры, полученные
группой Леви, почти невозможно достоверно интерпретировать. С развитием новых
методов спектроскопии (методов двойного резонанса) появилась возможность экспе-
риментально различать изомеры и регистрировать частоты колебаний в областях
амида I или II, так же как и валентные колебания NH. Соответствующие методы бу-
дут рассмотрены в разделе 1.2. К тому же, начиная с 1990-х годов, быстрое увеличе-
ние мощности компьютеров позволило получить достоверные сведения о структурах
изолированных больших молекул в газовой фазе. Как результат технических усовер-
шенствований в конце 1990-х начались исследования динамических моделей амино-
кислот и пептидов. Так возникла новая быстро растущая область научных исследова-
ний, которая будет подробно описана в разделах 1.3—1.6.
Хотя в данной главе в основном рассматриваются различные методы лазерной
спектроскопии, разработки в области СВЧ спектроскопии также будут обсуждаться.
Эти методы позволяют регистрировать спектры высокого разрешения и, на их осно-
ве, получать точнуюинформациюо геометрии молекул.
В следующих разделах рассматриваются различные методы и их приложения, на-
чиная с отдельных динамических моделей и заканчивая пептидами. Обзор остаю-
щихся проблем дается в конце главы.
1.2. Экспериментальные устройства и методы
1.2.1. Методы лазерной и СВЧ спектроскопии
Существует несколько спектроскопических методов анализа основного и возбуж-
денного электронных состояний изолированных биомолекул в газовой фазе. Враща-
тельные и колебательные спектры обеспечивают информацию о структуре исследуе-
мых молекулярных систем. Флуоресцентные методы дают возможность получить ин-
формациюо состояниях S0 и S1 исследуемых аминокислот и пептидов, особенно в
низкочастотной области спектра (см. разделы 1.4—1.6). При использовании флуорес-
центной спектроскопии рассеяния (ФСР) (см. рис. 1.1a) частота лазера возбуждения
постоянна, а флуоресцентное излучение рассеивается, обеспечивая сведения о состоя-
1.2. Экспериментальные устройства и методы 21
нии S0. В лазерно-индуцированной флуоресцентной (ЛИФ) спектроскопии частота ла-
зера возбуждения сканируется, а детектируется полное флуоресцентное излучение
(рис. 1.1b). Данный метод дает информацию о низкочастотных колебаниях возбужден-
ного электронного состояния. Еще один метод определения колебательных частот со-
стояния S1 — резонансная двухфотонная ионизация (РДФИ) (рис. 1.1c). Как и в ЛИФ,
лазер возбуждения сканируется, но для ионизации исследуемых веществ используется
второй фотон того же самого лазера (монохромная РДФИ) или другой ультрафиолето-
вый лазер (бихромная РДФИ). Ионы регистрируются эффективно только тогда, когда
первый лазер настроен на резонанс с колебательным (вращательным) уровнем состоя-
ния S1. Если данный электронно-колебательный уровень существует достаточно долго
в сравнении с длительностьюлазерного импульса, то вероятность поглощения второго
лазерного фотона увеличивается, что приводит к формированиюионов. Необходимо
упомянуть, что в данной главе внимание будет сосредоточено, главным образом, на
исследованиях с применением наносекундных (нс) лазерных систем.
Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
РЛ РДФИ ИК/РДФИ
ЛИФ ИК/РДФИ УФ/УФ
Рис. 1.1. Различные методы лазерной спектроскопии в приложении к изолиро-
ванным аминокислотам и пептидам: a — лазерно-индуцированная флуо-
ресценция (ЛИФ) с анализом колебаний в состоянии S0; b — лазерно-
индуцированная флуоресценция (ЛИФ) с анализом колебаний в состоя-
нии S1; c — резонансная двухфотонная ионизация, в приложении к ис-
следованиюколебаний в возбужденном состоянии; d, e — ИК/РДФИ
метод исследования инфракрасных спектров основного и возбужденного
состояний, соответственно; f — ультрафиолетово-ультрафиолетовое вы-
жигание провалов в приложении к анализу различных изомеров (см. по-
дробнее в тексте)
Основное преимущество метода РДФИ по сравнениюс методом ЛИФ — это воз-
можность объединения спектроскопии с масс-спектрометрией. Таким образом,
ионы, генерированные в процессе РДФИ, можно выбрать по массе и, в результате,
получать информациюоб исследуемых веществах (см. рис. 1.2 и раздел 1.2). В моле-
кулярных пучках, содержащих, главным образом, мономеры, обычно присутствуют и
другие комплексы, например, кластеры этого мономера или кластеры воды, которую
зачастуюневозможно полностьюудалить из газовых коммуникаций. Поэтому
РДФИ-спектроскопия с отбором молекул и комплексов по массе очень полезна в та-
ких экспериментах.
Очень важное направление в изучении валентных колебаний NH, так же как и
колебаний амида I и II, было открыто в результате развития комбинированных мето-
дов с использованием ИК/УФ излучения. В настоящее время используется сочетание
инфракрасной и флуоресцентной (ИК/ЛИФ) спектроскопии с РДФИ (ИК/РДФИ;
см. рис. 1.1d). В обоих методах фотон ультрафиолетового лазера имеет энергию, со-
ответствующую переходу выбранного изомера с электронно-возбужденного на ос-
новной колебательный уровень состояния S0. Сканируя инфракрасный лазер, можно
возбудить различные колебательные моды состояния S0. Если излучение инфракрас-
1.2. Экспериментальные устройства и методы 23
Времяпролетный Микроканальные Ионный
масс-спектрометр пластины сигнал
Цифровой Компьютерный
осциллограф анализ данных
Ионные линзы
Отклонение
по оси y Ультрафиолетовый
ионизирующий лазер
Отклонение
по оси x
Ускоряющие пластины Скиммер Импульсный клапан
в конфигурации Молекулярный
Уайли—Макларена пучок
Область
дрейфа
Молекулы в
пучке гелия
Ультрафиолетовый
Инфракрасный лазер возбуждающий лазер
Рис. 1.2. Экспериментальная установка для исследования молекул методами
РДФИ, ИК/РДФИ или ультрафиолетово-ультрафиолетовой спектроско-
пией выжигания провалов. Ионы, генерированные двумя ультрафиоле-
товыми фотонами, анализируются по массе в линейном времяпролетном
спектрометре. Пептиды вводятся посредством импульсного клапана в
поток инертного газа (He или Ar). Этот клапан можно нагревать. Источ-
ник с лазерной десорбцией также может быть помещен перед клапаном
(не показано)
ного лазера находится в резонансе с некоторым колебательным уровнем состояния
S0, то населенность основного колебательного состояния уменьшается. При запуске
ультрафиолетового лазера после инфракрасного эффективность ультрафиолетового
возбуждения снижается, так как количество молекул в основном состоянии умень-
шилось при резонансном инфракрасном возбуждении. Уменьшение эффективности
возбуждения ультрафиолетовым лазером приводит к снижениюфлуоресцентного
сигнала (в случае с техникой ИК/ЛИФ) или к ослаблениюсигнала РДФИ (в случае
использования метода ИК/РДФИ). Таким образом, оба метода используют получе-
ние инфракрасного спектра выбранного изомера, находящегося в состоянии S0, пу-
тем регистрации интенсивности ЛИФ или РДФИ сигналов как функции выбранной
длины волны инфракрасного фотона. Также, как и РДФИ, метод ИК/РДФИ облада-
ет селективностьюпо массе и структуре. Этот метод также селективен для различных
колебательных уровней состояния S0. Первоначально ИК/РДФИ спектр был зареги-
стрирован Пэйджем и его коллегами (Page и др., 1988). Впоследствии были опуб-
ликованы результаты множества других подобных исследований в этой области
(см. разделы 1.3—1.6), начиная с публикаций Бручи (Riehn и др., 1992), Миками (Tanabe
и др., 1993) и Цвира (Zwier, 1996) и их коллег. В данных работах зачастуювмес -
то термина ИК/РДФИ используются другие названия: ИК/УФ двойного резонанса,
ИК спектроскопия выжигания провалов и спектроскопия депопуляции в результате
ИК возбуждения. Автор этой главы и его коллеги опубликовали первый ИК/РДФИ
спектр области валентных колебаний C=0 (Gerhards и др., 2002). Это стало возмож-
ным благодаря созданиюновой лазерной системы, работающей в наносекундном ре-
жиме, которая генерирует узкуюполосу инфракрасного излучения (шириной менее
0,1 см–1) высокой энергии (~1 мДж; теперь от 4,7 до 10 мкм) (Gerhards и др., 2002;
Gerhards, 2004).
Область валентных колебаний C=O важна, так как колебания амида I и амида II
характеризуют структуру пептидов. Вместо лазера, описанного ранее (Gerhards,
2004), для различных пептидных приложений используется лазер на свободных элек-
тронах (ЛСЭ) (Oepts и др., 1994) (см. разделы 1.3—1.5). Данная лазерная система
очень мощная (обычно ~50 мДж в одном макроимпульсе) и охватывает диапазон
энергий ~40—2200 см–1. Но у нее есть и недостаток: довольно плохое спектральное
разрешение (~15 см–1 для волны ~ 6 мкм).
Еще одна лазерная система для области излучения ~6 мкм (пригодная для иссле-
дований пептидов) была описана Куяновым и др. (Kuyanov et al., 2004). В ней инф-
ракрасное излучение производится стимулированным обратным комбинационным
рассеянием в твердом параводороде при 4 K с накачкой системой ПГ/ПУ (парамет-
рическим генератором / параметрическим усилителем) в ближней области спектра
инфракрасного излучения. В отличие от инфракрасного излучения, получаемого ге-
нерацией разностной частоты (ГРЧ) (Gerhards, 2004), ширина полосы в этом случае
больше (0,4 вместо 0,1 см–1), и энергия на выходе сильно зависит от частоты, варьи-
руясь от 1,7 мДж для длины волны 4,4 мкм до 120 мкДж для длины волны 8 мкм
(Kuyanov и др., 2004).
Инфракрасное излучение в области валентных NH (~3450 см–1) или ОH
(~3650 см–1 — важная для исследования водных кластеров частота) колебаний обыч-
но производится генерацией разностной частоты, ПГ/ПУ (см., например, Huisken и
др. (1993)) или комбинацией СРЧ и ПУ (например, см. Unterberg и др. (2000)). По-
дробно о таком лазере частично рассказано в ссылках о приложениях ИК/ЛИФ и
ИК/РДФИ спектроскопии.
Наконец, необходимо упомянуть, что метод ИК/РДФИ (ИК/ЛИФ) также исполь-
зуют для определения колебательных переходов в электронно-возбужденном состоя-
нии (рис. 1.1е). Данный метод был предложен Эбатой и др. (Ebata, 1996). В соответст-
вии с методом ИК/РДФИ состояние S1 переводится в возбужденное состояние путем
поглощения одного ультрафиолетового фотона, после чего уменьшение населенно-
сти состояния S1, вызванное последующим инфракрасным возбуждением, детектиру-
ется путем регистрации снижения сигнала РДФИ, обусловленным ионизацией вто-
рым ультрафиолетовым фотоном. (В случае использования ИК/ЛИФ метода второй
ультрафиолетовый фотон не нужен, так как регистрируется уменьшение флуоресцен-
ции, являющееся следствием инфракрасного возбуждения.)
Еще один метод двойного резонанса, используемый для анализа пептидов, называ-
ется УФ/УФ спектроскопией выжигания провалов (см. рис. 1.1f). Он был впервые
применен Липертом и Колсоном (Lipert and Kolson, 1989) к кластеру фенол-H2O. В от-
личие от техники ИК/РДФИ, сканируется не инфракрасный, а ультрафиолетовый ла-
зер, в то время как излучение второго ультрафиолетового лазера (запущенного после
первого сканирующего ультрафиолетового лазера) имеет фиксированную длину вол-
ны, соответствующую, например, электронному переходу изомера. Данный метод ис-
пользуется для определения принадлежности различных электронных переходов одно-
му и тому же изомеру. А именно, когда первый (сканирующий) ультрафиолетовый ла-
зер настроен на резонанс с электронным переходом, принадлежащим изомеру, воз-
бужденному вторым лазером, флуоресценция или ионный сигнал, вызванный вторым
ультрафиолетовым лазером, уменьшаются, так как возбуждение первым лазером уже
удалило часть молекул из пучка. В отличие от инфракрасно-ультрафиолетовых мето-
дов, оба лазерных фотона УФ/УФ метода ведут к возникновениюионного или флуо-
ресцентного сигнала. Таким образом, сигналы, образующиеся в результате действия
первого и второго лазеров, необходимо различать. Лазеры обычно запускаются с за-
держкой в 100—300 нс так, чтобы лучи лазеров могли пространственно пересекаться.
Например, если и первый, и второй лазер формируют ионы путем поглощения двух
фотонов, то или 1) разрешение спектрометра должно быть достаточно хорошим для
различения ионов, произведенных этими двумя лазерами, или 2) ионы разделяются
при помощи быстрого переключения высокого напряжения, которым ионы, сформи-
рованные первым лазером, ускоряются в направлении, противоположном направле-
ниюдвижения ионов, сформированных первым лазером.
Методами двойного резонанса ИК/РДФИ и УФ/УФ спектроскопии выжигания
провалов производят селекциюизомеров и идентифицируют различные молекулы по
их инфракрасным спектрам, которые можно регистрировать для всех характерных
колебательных переходов. Еще один метод, с помощьюкоторого получают дополни-
тельнуюинформациюо динамическом поведении молекулы, — это ИК спектроско-
пия изменения популяции (ИКИП) (Dian и др., 2002b), которая, так же как и метод
заполнения провалов, была предложена Цвиром и его коллегами (Dian и др., 2002b,
2004b) (см. рис. 1.3). При использовании данного метода молекулы в молекулярном
пучке возбуждаются дважды. Сначала молекулы возбуждаются непосредственно по-
зади скиммера импульсного клапана в области охлаждения посредством столкнове-
ний. ИК возбуждение какого-либо конформера (например, возбуждение валентного
колебания NH) может привести к формированиюдругого конформера. При дальней-
шим расширении сверхзвуковой струи сохранившееся охлаждение столкновениями
может «заморозить» новуюпопуляцию , индуцированнуюИК возбуждением. Регист-
рация различных популяций производится посредством ЛИФ спектроскопии (или
посредством РДФИ). Сравнением ЛИФ спектров, полученных после ИК возбужде-
ния, со спектрами, полученными без него, определяют изменение популяции. Разли-
чие между методами ИКП и ИК с заполнением провалов заключается в том, что в
первом методе ИК лазер сканируется, а ультрафиолетовый лазер настроен на резо-
нансный перенос одного выбранного конформера. Таким образом, определяется эф-
фективность формирования выбранного изомера в зависимости от ИК возбуждения.
В методе заполнения провалов сканируется ультрафиолетовый лазер, а ИК лазер на-
строен на частоту, соответствующую одному колебательному переходу. В этом случае
количественно исследуется образование различных изомеров в результате ИК воз-
буждения. Эти новые методы были успешно применены к различным молекулам,
включая защищенные аминокислоты (Dian и др., 2002b, 2004a, b) (см. раздел 1.4.).
Для всех вышеупомянутых методов необходим ароматический хромофор. Метод с
инфракрасным излучением и резонансным переносом энергии (ИК/РПЭ), разрабо-
танный Дефрансуа и его коллегами (Lucas и др., 2004), предполагает возможность
регистрации ИК спектров веществ без такого хромофора. Данный метод — это обоб-
щенный метод РПЭ, в котором нейтральная молекула (с большим полным диполь-
ным моментом ј 2D) сталкивается с атомом ксенона, возбужденным до высокого
ридберговского состояния. Столкновение возбужденного атома ксенона с нейтраля-
ми вызывает резонансный перенос электронной энергии, что приводит к формиро-
ваниюанионов. Произведенные дипольно-связанные анионы или даже квадруполь-
но-связанные анионы (ДСА или КСА) имеют дополнительный электрон на очень
размытой орбитали и сохраняют структуру нейтралей-предшественников. Так как
приращение внутренней энергии практически равно нулю, то этот очень мягкий
Валентное
колебание NH
II. Охлаждение III. Ультра-
при I. ИК фиолетовый Уровень
столкновениях накачка зонднулевой
энергии
валентного
колебания NH
Рис. 1.3. а — три изомера NATMA (Ac-Trp-NHMe) (см. подробнее в разделе 1.4);
b, c — схемы инфракрасного перемещения (ИКП) и спектроскопии за-
полнения провалов [21]. При возбуждении выборочно одного изомера
ИК фотоном можно заселить популяции двух других изомеров. После
дальнейшего охлаждения при столкновениях в расширяющемся пучке
охлажденные молекулы B анализируют с помощью ультрафиолетового
лазера. Из-за уменьшения населенности популяции B в результате ИК
возбуждения флуоресцентный сигнал, вызванный ультрафиолетовым ла-
зером, уменьшается (см. рис. 1.14). Сканируя ультрафиолетовый лазер,
можно найти распределение для всех изомеров (спектроскопия заполне-
ния провалов). (Рис. взят из Dian и др. (2002b).)
процесс ионизации происходит без фрагментации даже слабо связанных кластеров.
Из-за влияния дипольного момента нейтрали на ионизациюданный метод чувстви-
телен к массе и структуре частицы. Если исследуемая молекула до РПЭ резонансно
возбуждена ИК фотоном, то остаточная энергия может разрушить слабые межмоле-
кулярные связи в кластерах или привести в ходе диссоциации к разделениюДСА в
результате процесса РПЭ. Таким образом, процесс РПЭ при ИК возбуждении ней-
тралей менее вероятен, чем РПЭ для молекулы, находящейся в основном колебате-
льном состоянии. Данный подход — это очень полезное дополнение к методам, тре-
бующим ароматического хромофора. При помощи этого метода были получены
спектры димера воды и комплекса формамид-вода (Lucas и др., 2004), находящиеся в
очень хорошем согласии с более ранними газофазными исследованиями. В недавней
публикации та же самая группа исследовала формамид и его димер для проверки
пригодности этого метода к исследованию мономеров и прочно связанных кластеров
с энергиями связи боќльшими, чем энергия связи электрона (ЭСЭ) дипольно-связан-
ного аниона (ДСА) (Lucas и др., 2005).
Классический метод определения параметров структуры — это СВЧ спектроско-
пия молекулярных пучков с преобразованием Фурье (СВЧС МП ПФ) (Balle и Flygare
1981; Legon, 1983; Andresen и др., 1990; Harmony и др., 1995; Grabow и др., 1996;
Storm и др., 1996; Suenram и др., 1999). В этом подходе молекулярный пучок расши-
ряется в кювете интерферометра Фабри-Перо и поляризуется коротким СВЧ им-
пульсом, направленным вдоль оси кюветы. Когерентное излучение вращательных
переходов преобразуют в цифровую форму и обрабатывают преобразованием Фурье с
цельюполучения частотного спектра. Метод привлек большое внимание, так как его
можно использовать также и с источниками лазерной абляции (Suenram и др., 1989;
Lessari и др., 2003). Подобно ИК/РПЭ СВЧ спектроскопия требует наличия у иссле-
дуемых частиц дипольного момента. Однако ей не нужен ароматический хромофор.
С ее помощьюможно получить отличное разрешение (в области кГц), но разреше-
ние по массе получить нельзя.
Еще один метод, который является своего рода оптическим аналогом метода
СВЧС МП ПФ, — это вращательная когерентная спектроскопия (ВКС). Это завися-
щий от времени метод с высоким разрешением, основанный на квантовых биениях,
являющихся результатом когерентного возбуждения различных вращательных уров-
ней электронно-колебательного состояния. Квантовые биения образуются при су-
перпозиции вращательных уровней, и их частоты — целые кратные вращательных
констант или их комбинаций. Первоначальные эксперименты были выполнены Бас-
киным, Фелкером и Зевэйлом (Baskin и др., 1986; Felker и др., 1986; Felker, 1992).
Линейно поляризованный пикосекундный лазер с импульсной накачкой возбуждает
молекулы, которые имеют дипольный момент, параллельный поляризации лазера в
нулевой момент времени. Из-за того, что молекулы вращаются с различными скоро-
стями, синхронизация теряется и снова обнаруживается через характерные проме-
жутки времени, связанные с вращательными константами. Такие промежутки време-
ни и соответствующие вращательные константы можно измерять с помощью второго
импульса, задержанного по времени. Таким способом находят вращательные кон-
станты, а, следовательно, и получают информацию о структуре. В контексте данной
главы этот метод использовался только для модельных аминокислотных систем
(Connell и др., 1990), хотя он также применим и к боќльшим системам (см. например,
Weichert и др. (2001) и Riehn (2002)).
Все методы, описанные выше, используют методы молекулярных пучков. Альтер-
нативный подход получения ультрахолодных спектров — использование капелек гелия
для исследования колебательных спектров аминокислот. Вилесов, Тоэннис и их кол-
леги исследовали аминокислоты, например, Trp, Tyr, (Lindinger и др., 1999; Toennies
и Vilesov, 2004), защищеннуюаминокислоту Ac-Trp-NH2 (NATA; см. раздел 1.4) и
триптамин (см. раздел 1.3) (Lindinger и др., 1999; Toennies и Vilesov, 2004), которые
были инжектированы в струюсверхтекучего 4He. Существуют две схемы детектиро-
вания резонансного ультрафиолетового возбуждения: (1) с помощьюрегистрации
ЛИФ, или (2) контроля уменьшения размера капли He. То есть, испарение атомов
He после ионизации аминокислот может регистрироваться масс-спектрометром как
функция длины волны излучения ультрафиолетового лазера. Данный метод в сочета-
нии с ИК возбуждением в области валентных колебаний OH также использовался
для анализа глицина (Huisken и др., 1999) и его димера (Chocholousova и др., 2002).
В случае с глицином все три конформера, наблюдаемые для данной аминокислоты
при помощи СВЧ спектроскопии (см. ниже), были идентифицированы путем срав-
нения с результатами ab initio вычислений высокого уровня (Chocholousova и др.,
2002). В настоящее время расширение прменения метода с каплями He до больших
пептидов — все еще перспектива для будущих исследований. (Для ознакомления с
другими методами, включая ИК/ИК методы двойного резонанса, которые еще не
применялись к аминокислотам, см., например, Douberly и др. (2005)). Интересно об-
ратить внимание на то, что изомеры, наблюдаемые в пучках He, могут отличаться от
наблюдаемых в экспериментах со сверхзвуковой струей. Это является результатом
или очень низких температур (0,38 K) в каплях He, или агрегации He (см. ниже).
Наконец, необходимо упомянуть, что для некоторых аминокислот можно полу-
чить ИК спектры с преобразованием Фурье путем использования источника быстро-
го нагрева (Linder и др., 2005). А именно: при использовании такого метода можно
задержать распад на секунды и детектировать излучение нефрагментировавшей ами-
нокислоты.
1.2.2. Некоторые экспериментальные средства:
масс спектрометрия, спектроскопия двойного резонанса
Основная схема установки, использующей пульсирующуюсверхзвуковуюструюдля
анализа биомолекул в газовой фазе в сочетании со спектроскопией и масс-спектро-
метрией, показана на рис. 1.2. Данная установка (которуютакже используют автор
главы и его коллеги) содержит несколько дифференциально откачиваемых вакуум-
ных камер (как правило, три) для транспортировки исследуемых частиц из источ-
ника к масс-спектрометру. В экспериментах обычно используется времяпролет-
ный масс-спектрометр (ВПМС) одной из двух конструкций: 1) линейной (ЛВПМС)
(рис. 1.2) или 2) рефлектронной (РВПМС) (Mamyrin и др., 1973; Kьhlewind и др.,
1984; Bergmann и др., 1989; Boesl и др., 1992). В схеме с рефлектроном ионы сначала
замедляются, а затем фокусируются в плоскости детектора для коррекции различий в
скоростях ионов одной и той же массы. Анализаторы в ЛВПМС и РВПМС могут
быть ориентированы перпендикулярно или параллельно направлениюмолекулярно -
го пучка. При перпендикулярном расположении масс-анализатора (см. рис. 1.2) вли-
яние различий в скоростях частиц на анализ минимально.
В случае с флуоресцентным спектрометром обычно используется только одна ва-
куумная камера, которая содержит источник и оптику для фокусировки флуоресцен-
тного излучения на детекторе. Для разрешения флуоресцентного спектра между ка-
мерой и детектором помещают монохроматор. Детектором может служить или фото-
умножитель, или камера с прибором с зарядовой связью(ПЗС-камера). При исполь-
зовании ПЗС-камеры можно регистрировать полный спектр для каждого лазерного
выстрела.
Для экспериментов с очень высоким разрешением (электронная спектроскопия с
вращательным разрешением) используется прибор с непрерывным пучком и двумя
скиммерами, что требует приблизительно трех или четырех вакуумных камер с диф-
ференциальной откачкой. Флуоресценция, полученная после возбуждения непре-
рывным кольцевым лазером на красителе с очень высоким разрешением, регистри-
руется на фотоумножителе, сопряженным со счетчиком фотонов (Majewski и Meerts,
1984; Pratt, 1998; Schmitt и др., 2005).
Наиболее важная часть прибора, предназначенная для произведения достаточного
количества недиссоциировавших аминокислот и пептидов, — это источник. Источ-
ники, обсуждаемые в данной главе, формируют только нейтрали. Для перевода ней-
тральных аминокислот и пептидов в газовуюфазу используются, главным образом,
два типа источников. Если используются защищенные аминокислоты (см. ниже), то
применяются специальные источники с нагревом (см. например, Fricke и др., 2004 и
раздел 1.5). В таких источниках расстояние между небольшой камерой, изготовлен-
ной из нержавею щей стали и содержащей исследуемое вещество, и импульсным кла-
паном очень короткое. Кроме того, и камера, и соединители защищены стеклянны-
ми поверхностями. Нагревание в таком источнике должно быть чрезвычайно одно-
родным. Для получения достаточного количества больших пептидов в газовой фазе
могут использоваться температуры ниже 200 °C. В другом устройстве с нагреванием
вещество находится не в области повышенного давления позади клапана, а перед
импульсным клапаном (Snoek и др., 2000). То есть, вещество соприкасается с вакуу-
мом камеры источника. Данная конструкция использовалась для хрупких незащи-
щенных аминокислот (см. например, раздел 1.4.1 (Snoek и др., 2000)). Из-за наличия
вакуума для перевода достаточного количества молекул в газовуюфазу могут исполь-
зоваться температуры ниже 150 °C.
Схожая с нагреванием лазерная десорбция также теперь применяется для перевода
пептидов в газовуюфазу. Сравнение теплового нагрева и лазерной десорбции показы-
вает, что методы с нагреванием более простые и обеспечивают более устойчивый сиг-
нал. При использовании методов уменьшения популяции посредством лазерного воз-
буждения (ИК/УФ, УФ/УФ) — подходов с существенным шумовым сигналом — необ-
ходимо обеспечить стабильнуюбазовуюли ниюдля ионного сигнала, сформированно-
го путем применения УФ лазера фиксированной частоты. Кроме того, количество
необходимого для анализа вещества обычно меньше в случае использования теплового
нагрева. Современные исследования в области усовершенствования лазерных десорб-
ционных источников сосредоточены на решении данных проблем. Если нет способа
перевести пептиды в газовуюфазу нагревом без фрагментации, то лазерная десорб-
ция — это единственная альтернатива. Различные группы исследователей описали
свои десорбционные источники (Grotemeyer и др., 1986; Tembreull и Lubman, 1986,
1987a, b; Cable и др., 1988a, b; Meijer и др., 1990; Cohen и др., 2000; Piuzzi и др., 2000;
Hьnig и др., 2003). Как правило, исследуемое вещество смешивается с матрицой.
В большинстве случаев применяется графит (Meijer и др., 1990; Cohen и др., 2000;
Piuzzi и др., 2000; Hьnig и др., 2003). В современных источниках его прессуют с не-
большим количеством исследуемого вещества. В пионерской спектроскопической ра-
боте группы Леви в качестве матрицы применялся краситель (Cable и др., 1988a, b).
В процессе десорбции матрица поглощает энергиюкороткого лазерного импульса (на-
пример, импульса длительностью10 нс, произведенного лазером на неодимовом стек-
ле — иттрий-алюминиевом гранате, с длиной волны 1064 нм и энергией 1 мДж). Та-
ким образом, матрица нагревается чрезвычайно быстро, и интересующие нас молеку-
лы испаряются из нее в газовую фазу. На следующем этапе молекулы охлаждаются в
молекулярном пучке, формирующемся при расширении инертного газа, напускаемого
через импульсный клапан. Источник расположен непосредственно перед скиммером.
Это может быть вращающийся стержень или диск, покрытый матрицей (или чистым
веществом). Процесс быстрого нагрева с последующим охлаждением настолько эф-
фективен, что пептиды не фрагментируют. Некоторые группы исследователей также
описывают десорбционные источники, использующие чистые вещества (без матрицы)
1.2. Экспериментальные устройства и методы 29
(Tembreull и Lubman, 1986, 1987a, b; Grotemeyer и др., 1996). Данные источники также
упоминаются как источники с абляцией (см. ниже). Основная идея всех десорбцион-
ных источников нейтралей — это разделение процессов ионизации и транспортировки
нейтральных пептидов в газовуюстадиюс последующим охлаждением. Это — общий
подход к решениюпроблемы перевода больших и хрупких молекул в газовуюфазу в
достаточных количествах, что позволяет применять к нейтралям различные спектро-
скопические методы, описанные в разделе 1.2.1.
Источник с лазерной абляцией (Bondybey и English, 1981; Dietz и др., 1981) ис-
пользует в качестве мишени вместо матрицы с исследуемым веществом само чистое
вещество. В результате лазерной абляции на поверхности мишени остаются неболь-
шие дефекты, так как удаляется значительное количество вещества. В большинстве
лазерных экспериментов, представленных в данной главе, используются частоты по-
вторения лазерных импульсов от 10 до 20 Гц. Следовательно, источники с десорб-
цией и абляцией специально конструируются для использования низких частот по-
вторения импульсов. В настоящее время уже существуют абляционные источники,
предназначенные для использования более высоких (килогерцовых) частот (Smits и
др., 2003). Они очень хорошо сочетаются с фемтосекундными лазерными системами,
работающими при частотах повторения импульсов порядка нескольких кГц. Еще
одно интересное приложение — это комбинация источника с лазерной абляцией и
СВЧ спектроскопии (Suenram и др., 1989; Lessari и др., 2003) (см. раздел 1.2.1). Ко-
нечно, использование методов абляции обычно требует большего количества вещест-
ва, что ограничивает их применение для исследования больших пептидов.
1.3. Спектроскопия модельных аминокислотных систем
Применение современных методов двойного резонанса начиналось с модельных сис-
тем. Такие системы, как, например, N-фенилформамид (Manea и др., 1997; Dickinson
и др., 1999; Fedorov и Cable, 2000; Robertson, 2000; Mons и др., 2001; Robertson и
Simons, 2001), 2-фенилацетамид (Robertson и др., 2001) и N-бензилформамид (Robertson
и др., 2000) (см. рис. 1.4), содержат одну связь H—N—C=O, которая может слу-
жить модельюамидной связи в пептиде. Необходимо указать, что данные молекулы
не обеспечивают реалистичного описания пептидной связи, так как она не полно-
стьюидентична связям в аминокислотах или пептидах, а именно: в пептиде атомы
б—C расположены на конце каждой амидной группы, и NH2-группа расположена на
N-конце пептида. Хотя модель исследуемых амидов и несовершенна, она дает воз-
можность получить сведения о структурных особенностях изолированных амидов.
Более того, гидратационные оболочки были подробно исследованы с помощьюэтих
моделей. Ароматический хромофор использовался для всех динамических моделей,
так как этот выбор позволяет применение ИК/РДФИ.
В случае с N-фенилформамидом можно наблюдать цис- и трансизомеры относи-
тельно связи H—N—C=O. Цисизомер немного более стабилен, чем трансизомер
(рис. 1.4a) (Manea и др., 1997; Dickinson и др., 1999). Для N-бензилформамида (Robertson,
2000) трансизомер становится намного более устойчивым (рис. 1.4d), что ти-
пично и для реального пептида (см. ниже). Введение группы CH2 приводит к увели-
чениюгибкости структуры (фенил заменяется на бензил), а также позволяет лучше
моделировать основнуюаминокислотную цепь. В случае с 2-фенилацетамидом (Robertson
и др., 2001) (см. рис. 1.4f) боковая цепь прикреплена к карбонильной функ-
циональной группе, сохраняя первичнуюамиднуюNH 2-группу.
Выбранные модели — хорошие кандидаты для исследования последовательной гид-
ратации. В случае с N-фенилформамидом энергии протон-донорной связи одной мо-
лекулы воды с группой C=O или протон-акцепторной связи с группой N—H почти
30 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
равны (Монс и др., 2001) (рис. 1.4b). В противоположность мономеру, трансизомер
N-фенилформамида более стабилен после гидратации и сохраняется во всех кластерах
с водой (Dickinson и др., 1999; Fedorov и Cable, 2000). Применение накачки излучени-
ем дает возможность исследовать перемещения молекулы воды от одного участка свя-
зи к другому (Clarkson и др., 2005a). В случае с группой, содержащей две молекулы
воды, димеры воды связаны или с C=O, или с группой N—H (Dickinson и др., 1999;
Fedorov и Cable, 2000). Изомер, содержащий группу N—H донора, дополнительно ста-
билизируется в результате взаимодействия O—H р. В случае с кластером с тремя мо-
лекулами воды получается циклическая конфигурация между донорной связью
(C=O H) и акцепторной связью(N—H O) (рис. 1.4c). Такая геометрическая конфи-
гурация напоминает структуру протонной нити (Tanner и др., 2003; Smedarchina и др.,
2000), которая может вести к формированиюамфионных структур в аминокислотах.
В отличие от кластеров N-фенилформамида и воды, цисизомер предпочтителен в
N-бензилформамидной группе гидратированных кластеров. Были получены различ-
ные изомеры моно- и дигидратированного N-бензилформамида, аналогичные N-фе-
нилформамидным кластерам (см. рис. 1.4e) (Robertson и др., 2000). Интересный здесь
элемент — это донорно-акцепторная структура, в которой одна молекула воды связана
одновременно с группами N—H и C=O посредством водородной связи. Опыт, полу-
1.3. Спектроскопия модельных аминокислотных систем 31
2-фенилацетамидТрипта мид
Рис. 1.4. Модельные системы различных аминокислот: a — N-фенилформамид и
его кластер с одной (b) и тремя (c) молекулами воды; d — N-бензилфор-
мамид и его кластер с одной молекулой воды (e); f — 2-фенилацетамид;
g — триптамин. (Рисунок частично взят из Robertson и Simons (2001).)
ченный при анализе данных небольших модельных систем, можно применить для ис-
следования гидратированных аминокислот и пептидов (см. ниже).
Некоторые другие молекулы также можно рассматривать в качестве аналогов
аминокислот (см., например, раннюю работу Martinez и др. (1991, 1993)). Триптамин
(см. рис. 1.4g) был исследован несколькими группами. Данная молекула содержит
индольный хромофор подобно триптофану (см. раздел 1.4).
Первые эксперименты с молекулярными пучками нейтрального триптамина в га-
зовой фазе были выполнены Леви и его коллегами (Park и др., 1986). Применяя ин-
дуцированнуюлазером флуоресценцию (ЛИФ) и резонанснуюдвухфотоннуюиони -
зацию(РДФИ), авторы наблюдали шесть полос в электронном спектре S1—S0, соот-
ветствующих шести различным конформерам. Конфигурации пяти из шести кон-
формеров определяли, записывая спектры флуоресцентного возбуждения с высоким
разрешением, что привело к определениютрех скошенных и двух заслоненных
структур в соответствии с положением аминогруппы относительно кольца индола.
Также было показано, что один переход в электронном спектре состоит из двух
очень близко расположенных друг к другу полос, которые (при более раннем изуче-
нии) не могли быть различены вращательным анализом (Philips и Levy, 1986, 1988).
Кроме того, низшее электронно-возбужденное состояние может быть определено как
1Lb, как и для триптофана. Последующие эксперименты с дейтерированным трипта-
мином подтвердили эти результаты и привели к более точному определениюположе -
ния аминогруппы (Wu и Levy, 1989). Последующие исследования структуры прово-
дились при помощи вращательной когерентности (Connell и др., 1990) и СВЧ спек-
троскопии (Caminati, 2004). По СВЧ спектрам в сочетании с ab initio вычислениями
Каминати и его коллеги выделили два конформера (Caminati, 2004). Цвир и его кол-
леги исследовали триптамин ультрафиолетово-ультрафиолетовым выжиганием про-
валов и ИК/РДФИ спектроскопией и с помощьюТФП вычислений определили семь
структур, включая интерпретацию двух близко расположенных друг к другу полос,
которые нельзя было различить прежде (Carney и Zwier, 2000). Та же самая группа
также измерила барьеры конформационной изомеризации триптамина, применяя
стимулированнуюэмиссиюс заполнением провалов накачки (СЭЗПН) и стимулиро-
ваннуюэмиссиюс переносом заселенностей при накачке (СЭПЗН) (Dian и др.,
2004a; Clarkson и др., 2005b, c). В этих методах сканируется либо УФ лазер стимули-
рованной накачки эмиссии в процессе возбуждения-осаждения или третий лазер,
анализирующий конформеры после процесса стимулированной накачки эмиссии.
Пратт и его коллеги обнаружили дополнительные полосы во вращательных спект-
рах двух полос и зафиксировали препятствия внутримолекулярному движению, объ-
ясняющие появление таких полос (Nguyen и др., 2005).
Микросольватированные кластеры триптамина были изучены намного менее
тщательно, чем мономеры. Парк и его коллеги (1986) обнаружили, что большинство
возможных конформеров при формировании кластеров с метанолом преобразуется в
конформер одного вида. Сипиор и Сулкес (1988) получили тот же результат для кла-
стеров с метанолом, этанолом и димером воды, применяя ЛИФ спектроскопию. Ин-
тересное отклонение от данной тенденции наблюдалось для кластера с диоксаном
(Peteanu и Levy, 1988), который может быть только акцептором водорода. Кластеры
триптамина с водой (до трех молекул молекул воды в кластере) были исследованы
при помощи РДФИ и ИК/РДФИ (Carney и др., 2001). Первая молекула воды присо-
единяется к неподеленной паре аминогруппы, а кластеры с двумя и тремя молекула-
ми воды образуют мостик с индольной группой NH. Коннелл и его коллеги (Connell
и др., 1990) выявили моногидратированный кластер с мостиком, используя враща-
тельнуюкогерентнуюспектроскопию . Этот результат подтвердили Шмитт и его кол-
леги (Schmitt и др., 2005), которые зарегистрировали лазерно-индуцированный флуо-
ресцентный спектр разрешением вращательных уровней для шести мономерных кон-
формеров и моногидратированного кластера триптамина. Авторы наблюдали допол-
нительное стабилизирующее взаимодействие воды с одной из ароматических связей
C—H. Экспериментальные наблюдения были подтверждены ab initio вычислениями.
Это взаимодействие приводит к ситуации, когда различия по энергии для всех воз-
можных кластеров триптамина с водой намного больше, чем между различными мо-
номерами.
Мелантонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) и его кластер с водой также были
исследованы при помощи ИК/УФ спектроскопии (Florio и др., 2002; Florio и Zwier,
2003). Пять конформеров мономера — три структуры с транс- и две с цисконфигура-
цией амидной группы, а также четыре моногидрированных и два дигидрированных
конформера были обнаружены и изучены.
1.4. Спектроскопия двойного резонанса
и СВЧ спектроскопия аминокислот
Три природные ароматические аминокислоты — это фенилаланин (Phe), тирозин
(Tyr) и триптофан (Trp) (см. рис. 1.5). Благодаря ароматическим хромофорам (бензол
в Phe, фенол в Tyr, индол в Trp) их можно исследовать при помощи методов отбора
по массе и изомерно-селективных методов двойного резонанса (УФ/УФ и ИК/УФ).
В данном разделе описаны применения данных методов для ароматических амино-
кислот.
1.4.1. Фенилаланин
Первая ароматическая аминокислота, исследованная при помощи ИК/УФ спектро-
скопии двойного резонанса, — это Phe (Snoek и др., 2000). По ЛИФ спектрам и по
измерениям насыщения, выполненным ранее группой Леви (Martinez и др., 1992),
было идентифицировано, по крайней мере, пять изомеров. Доказательство этого
факта при помощи УФ/УФ двухрезонансной спектроскопии является очень хоро-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 33
Фенилаланин Триптофан Тирозин
Глицин Валин Пролин
Рис. 1.5. Шесть природных аминокислот, три из которых — ароматические (Phe,
Trp, Tyr). Структура, показанная для глицина, — самая устойчивая в га-
зовой фазе
шим учебным примером (см. рис. 1.6b). Шесть изомеров имеют различные энергии
возбуждения S1 S0. Для пяти изомеров можно зарегистрировать ИК/РДФИ спект-
ры (см. рис. 1.6c), что дает некоторые сведения об их структурах. Внутримолекуляр-
ные водородные связи между группами NH2 и COOH доминируют в структурах изо-
меров Phe (см. рис. 1.6a). Разнообразие изомеров частично возникает из-за того, что
функциональные группы могут действовать как водородный донор и водородный ак-
цептор. В этом первоначальном исследовании эти шесть изомеров коррелировали с
шестьюсамыми стабильными структурами Phe (см. рис. 1.6).
В дальнейшем Ким и его коллеги исследовали изомеры Phe, анализируя их по-
тенциалы ионизации. Для получения данных значений сканировали второй лазер
(метод РДФИ, см. рис. 1.1b), и регистрировали ионный ток в зависимости от часто-
ты второго ионизирующего лазера (Lee и др., 2002a, b, 2003). Не было зафиксирова-
но отчетливого возрастания тока в спектрах, указывающего на сильное изменение
геометрии. Однако, согласно первичным данным, спектры можно разделить на две
группы. Для четырех изомеров ионный ток резко возрастает при энергии ~ 8,8 эВ,
для двух изомеров — при энергии большей, чем 9 эВ. Данное расхождение, вероят-
но, является результатом различий в расположении фенильного кольца и основой
цепи Phe. То есть, потенциал ионизации зависит от взаимодействия ионизированно-
го фенольного хромофора с группой NH2, которая может образовывать водородную
связь с фенильным кольцом. Если не существует заметного р-взаимодействия, то по-
тенциал ионизации будет ниже, чем в случае сильного р-взаимодействия. Результа-
ты, полученные при изучении потенциалов ионизации, соответствуют данным Снука
и его коллег (Snoek 2000), за исключением одного изомера E.
В дальнейшем Саймонс и его коллеги снова исследовали шесть изомеров Phe, вы-
полняя контурный анализ вращательных полос РДФИ спектров (Lee и др., 2004).
(кислота)
ЛИФ
РДФИ
УФ/УФ
Нерезонансное
УФ излучение
Волновое число (см–1)
Волновое число
(вакуум) (см–1)
Рис. 1.6. a — девять самых устойчивых структур Phe, вычисленные на уровне MP2
[базисный набор 6-311 G(d, p)] (Snoek и др., 2000). Переходы S1 S0,
полученные из CIS вычислений, указаны стрелками; b — ЛИФ (Martinez
и др., 1992), РДФИ и УФ/УФ с выжиганием провалов (Snoek и др., 2000)
спектры Phe. Спектр с выжиганием провалов ясно указывает на то, что,
по крайней мере, шесть различных изомеров (A, B, C, D, X, E) принадле-
жат РДФИ спектру; c — ИК/РДФИ спектрам изомеров A, B, C, D, X.
Корреляция экспериментально наблюдаемых структур с девятью воз-
можными структурами рассматривается в этом разделе. (Части (a) и (b)
взяты из Robertson и Simons (2001); часть (c) взята из Snoek и др. (2000).)
Оказалось, что идентификация четырех конформеров (1 = X, 2 = D, 3 = B, 6 = C;
см. сокращения на рис. 1.6) согласуется с данными, полученными на основе спек-
тров ИК/РДФИ (Snoek и др., 2000). Повторное определение было сделано для изо-
мера A, который теперь коррелирует со структурой 7. И, наконец, изомер E был со-
поставлен со структурой 9 (см. рис. 1.6a). Стоит обратить внимание на то, что самые
устойчивые изомеры были найдены экспериментально и были также четко иденти-
фицированы различными спектроскопическими методами. Однако были пропущены
изомеры (особенно 4 и 5), энергия которых ниже, чем у изомеров 7 и 9.
Еще один аспект, который рассматривали Ли и его коллеги (2004), — это время
жизни S1 изомеров, полученных в результате задержанной ионизации облученной
пробы. В отличие от всех изомеров, имеющих времена жизни в состоянии S1 ~ 80 нс
(изомеры 2, 3, 6, 7) или 120 нс (изомер 9), основной изомер 1 существует всего 20 нс.
Данный изомер стабилизирован внутримолекулярными водородными связями
(см. рис. 1.6a), что способствует эффективному безызлучательному распаду.
Также проводились исследования производных аминокислот, а именно: группа
NH2 N-конца была ацетилирована, а группа OH С-конца заменялась или на эфир-
ную, или на амидную группу.
В то время как при исследовании чистого Phe благодаря взаимодействиюкислот -
ных и основных концевых групп были получены превосходные спектры, анализ за-
щищенных аминокислот и пептидов предложил хорошие модели описания внутрен-
ней части большого пептида, так как взаимодействуют только функциональные
группы основной цепи.
Структура пептида характеризуется схемой Рамачандрана (Ramachandran и др.,
1966), на которой показаны углы и ш основных цепей аминокислот. Данный под-
ход можно также применить и к защищенным аминокислотам (см. рис. 1.7). Соот-
ветствующим примером может служить определение углов в Ac—Phe—OMe (IUPAC,
1974; Schulz и Schirmer, 1979; Gerhards и Unterberg 2002): Ѕ (C , Cб, N, C3) и
ш Ѕ (O1, C , Cб, N) с —180° < , ш Ѕ 180°; см. рис. 1.7. Першель и его коллеги (1991)
в их работе, касающейся различных частично защищенных аминокислот, указали на
то, что для каждого из углов и ш существует три различных значения, соответству-
ющих минимумам потенциальной энергии. Это приводит к девяти возможным кон-
формациям основных цепей пептидов. Для описания девяти возможных конфигура-
ций применяются обозначения бD, бL, вL, гL, гD, еD, еL, дL и дD (Perczel и др., 1991).
Изомеры бD( Ј 0—120°, ш Ј 0—120°) и бL( Ј —120—0°, ш Ј —120—0°) описывают
спиралевидные структуры. вL( Ј —120—120°, ш Ј —120—120°) описывает структуру
в-пластов. гL( Ј —120—0°, ш Ј 0—120°) и гD( Ј 0—120°, ш Ј —120—0°) соответству-
ют инверсионный и нормальный повороты г, еD(Ц Ј 0—120°, ш Ј —120—120°) и
еL(Ц Ј —120—0°, ш Ј —120—120°) представляют обратнуюи нормальнуюструктуры
полипролина II. Соответствующие углы структур д — дL(Ц Ј —120—120°,
ш Ј 0—120°) и дD (Ц Ј —120—120°, ш Ј —120—0°). Углы кручения ч1 Ѕ (N, Сб, Cв, C1)
и ч2 Ѕ (Сб, Св, C1, C2) определяют структуру боковой цепи Ac—Phe—OMe. Углы ч1 и
ч2 описывают вращение вокруг осей Сб—Св и Св—С1, соответственно. В случае с уг-
лом ч1 три положения фенильной группы соответствуют минимумам потенциальной
энергии. Данные положения обозначаются как g + (гош +, ч1 ~60°), б (противопо-
ложный, ч1 ~180°) и g — (гош —, ч1 приблизительно —60°) (IUPAC, 1974; Gelin и
Karplus, 1979). Другой важный параметр, описывающий относительное положение
группы NH1 относительно группы CO ацетильного фрагмента — это угол щ. Данный
угол определяет транс- и цисизомеры относительно положения амидной группы.
Обычно транс-структуры аминокислот более стабильны, чем соответствующие
цис-структуры. Для углов , ш и ч1 27 различных конформеров (девять вариантов по-
ложения основной цепи пептида, умноженные на три различных значения ч1) могут
соответствовать минимумам на поверхности потенциальной энергии Ac—Phe—OMe,
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 35
но только одна структура была получена в спектрах РДФИ (Gerhards и Unterberg,
2002; Gerhards и др., 2002). Спектры ИК/РДФИ были зарегистрированы в области
валентных колебаний NH и в области колебаний амида I/II (валентные колебания
C=O, деформационные колебания NH) (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др.,
2002). Сравнивая экспериментально наблюдаемые колебательные частоты со значе-
ниями, полученными в результате ab initio вычислений и вычислений методом тео-
рии функционала плотности (ТФП), можно сделать вывод, что Ac—Phe—OMe имеет
структуру вL (см. рис. 1.8a) с боковой цепьюв анти- или левовращающем + положе-
нии. То есть, образуется структура вL (а) или вL (g+). Дальнейшие исследования
вплоть до характеристичной области ясно указывают на то, что для мономера фор-
мируется структура вL(g+) (Fricke и др., 2006a).
Молекула Ac—Phe—NHMe — еще один пример защищенной аминокислоты на
основе Phe. Она содержит две амидных группы (O=C—N—H) и поэтому является ди-
пептидной моделью. В спектре РДФИ Ac—Phe—NHMe было обнаружено пять изоме-
ров (Gerhards и др., 2004). В соответствии с ab initio вычислениями и вычислениями
ТФП самая устойчивая структура — это снова вL(а) (см. рис. 1.8a и 1.9), но вторые и
третьи по устойчивости структуры содержат внутримолекулярные водородные связи
и имеют форму гL (см. рис. 1.8b, в случае с защитной эфирной группой эти типы
структуры невозможны). Необходимо упомянуть, что г-структуры также называют
структурами C7, и из-за взаимодействия атома H в группе NH—CH3 и атома O аце-
тилированной карбоксильной группы оба атома находятся в положениях 1,7 относи-
тельно друг друга (см. рис. 1.8b). Структуры, относящиеся к в-пласту, называют
структурами C5 из-за слабого взаимодействия между атомами H и O при параллель-
ной ориентации группы NH и карбонильной, которые находятся в положениях 1,5
(см. рис. 1.7a и 1.8a).
В качестве примера спектры ИК/РДФИ изомера вL(а) Ac—Phe—NHMe показаны
на рис. 1.9. Это очень типично для вытянутого (относящегося к в-пласту) располо-
жения для всех NH колебаний с частотами более 3400 см–1, так как соответствующие
Рис. 1.7. a — структура Ac—Phe—OMe. Показаны пять самых важных углов (Ц, ш,
ч1, ч2, щ), которые описывают основу (Ц, ш) и боковуюцепь (ч1, ч2), а
также цис-транс-изомерию( щ). В Ac—Phe—OMe N-конец Phe ацетилиро-
ван, а C-конец содержит функциональнуюэфирнуюгруппу; b — схема
Рамачандрана, на которой показаны девять различных конфигураций
основной цепи относительно углов Ц и ш. (Рисунок частично взят из
Gerhards и Unterberg (2002).)
группы NH свободны и не связаны с водородом. Особенность данного изомера
Ac—Phe—NHMe заключается в том, что можно наблюдать только одно колебание в
области валентных колебаний C=O. Согласно вычислениям предсказанная интен-
сивность второго валентного колебания C=O намного ниже. В случае со структурой
поворота гL частота одной группы NH, связанной с водородом, ниже 3400 см–1, тог-
да как другое валентное колебание NH выше 3400 см–1 (Gerhards и Unterberg, 2002;
Gerhards и др., 2004). Кроме того, переходы, которые принадлежат группам NH, свя-
занным с водородом, обычно шире, чем наблюдаемые для валентного колебания
свободной NH группы. Вообще можно утверждать, что информациюоб основной
структуре исследуемых молекул получают из положения, интенсивности и ширины
колебательного перехода. Если, кроме того, колебательные переходы зарегистрирова-
ны в широком спектральном диапазоне (характеристичная область, амид I, II, вален-
тные колебания NH, обертоны), то для интерпретации спектра имеется достаточно
информации. В подобных системах (например, в Ac—Trp—NHMe) также наблюдают
структуры в-пласта и г-витка.
Третий пример защищенной аминокислоты на основе Phe — это Ac—Phe—NH2.
В данном случае группа NH2 ацетилирована, и используется чистый амид. Такая мо-
дель менее эффективна для описания внутренней структуры пептида (который не со-
держит никаких первичных групп NH2), но вводит дополнительнуючастоту валент-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 37
гL-виток
в-виток (тип I) гL—в-виток (тип I)
вL-виток (тип I) — вL-виток (тип I) 310 винтовой
Рис. 1.8. Схемы различных вариантов связи, описывающие положение основной
цепи пептида: a — структура, относящаяся к в-пласту (вL-конфигурация
C5); b — г-виток (структура гL, C7); c — комбинированная структура
гL—вL; d — в-виток (тип I) (структура C10); e — расположение гL—гL;
f — комбинированный гL—в-виток (тип I); g — последовательные в-вит-
ки (тип 1); h — винтовая структура 310 (идентичная комбинированному
повороту в (тип III) — поворот в (тип I))
ных колебаний NH, которая может быть полезна для интерпретации структуры. Ана-
лиз Ac—Phe—NH2 с применением ИК/РДФИ приводит к трем конформерам (Chin и
др., 2005d). Как и в Ac—Phe—NHMe (Gerhards и др., 2004), самой устойчивой оказы-
вается структура, относящаяся к в-пласту, тогда как у двух других структур есть эле-
менты гL-витка. Очень интересно обратить внимание на тот факт, что конформер,
содержащий гL структуру (гош +), показывает очень низкий выход флуоресцентных
квантов (Chin и др., 2005d). Это может быть результатом взаимодействия связи N—H
с р-системой, что приводит к быстрому безызлучательному распаду (см. ниже).
г-витки также наблюдаются в пептиде Z—Pro—NHMe (с Z=C6H5—CH2—O, Pro
см. на рис. 1.5). Данная система базируется на пролине, и так как у этого вещества
нет хромофора в боковой цепи, ароматический хромофор представлен в защитной
группе (Compagnon и др., 2005).
г-витки — важные элементы вторичной структуры. Другие типы вторичной струк-
туры включают спирали, в-пласты и в-витки (см. рис. 1.8 и 1.10). в-виток и спирали
представлены ниже, но даже для защищенных аминокислот можно рассмотреть наибо-
лее простые структуры с в-пластами. Модель в-пласта — это совокупность, по край-
ней мере, двух защищенных аминокислот или пептидов, в которых у аминокислот то
же положение, что и у аминокислот в большом пептиде (см. рис. 1.10). Для обсужде-
ния динамических моделей с в-пластами лучше использовать защищенные аминокис-
ИК/РДФИ спектр ИК/РДФИ спектр
(амидI/II) (валентные колебания NH = амидА)
Рис. 1.9. Структура и ИК/РДФИ спектр модельного дипептида Ac—Phe—NHMe
(Gerhards и др., 2004). Спектр показан в областях переходных колебаний
амидов I/II (1450—1800 см–1) и валентных колебаний N—H (амид A).
Все переходы в области валентных колебаний NH имеют частоты, суще-
ственно большие 3400 см–1, что указывает на наличие структуры в-плас-
та. (Рисунок частично взят из Gerhards и др. (2004).)
лоты вместо незащищенных, так как в данном случае наиболее полярные группы рас-
положены в основной цепи молекулы, а не на ее концах. В незащищенных аминокис-
лотах (см., например, шесть самых устойчивых изомеров Phe на рис. 6 в Snoek и др.
(2000)) кислотная группа COOH и группа NH2 обладают тенденцией к формированию
межмолекулярных водородных связей, тогда как молекулы, подобные Ac—Phe—OMe
или Ac—Phe—NHMe (или Ac—Phe—NH2), обычно имеют вытянутые структуры, отно-
сящиеся к в-пласту, которые идеальны для формирования димеров. Такие димеры яв-
ляются подходящими примерами моделей с в-пластами, что приводит к вопросу о том,
существуют ли движущие силы формирования более сложной вторичной структуры
для изолированных молекул в газовой фазе (без окружающей среды).
Действительно, в случае с Ac—Phe—OMe и Ac—Phe—NHMe анализ спектров
ИК/РДФИ в сочетании с ab initio вычислениями показывает, что димеры — это мо-
дели в-пласта (см. рис. 1.11). Для дипептида Ac—Phe—NHMe существуют две различ-
ные модели с в-пластами: конфигурация с внешними связями с группами NH
N концов (группы NHMe) с водородными связями двух групп CO c C-концами (аце-
тильные группы) (рис. 1.11a) и структура с внутренними связями с группами NH
аминокислоты с водородными связями с группой CO амидной группы (рис. 1.11b).
Сравнивая спектры ИК/РДФИ с колебательными спектрами, предсказанными для
различных структур, можно сделать вывод о том, что формируется димер с внешни-
ми связями (Gerhards и др., 2004). В случае с Ac—Phe—OMe образуется только кон-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 39
Рис. 1.10. Часть белка шелка, содержащая вторичнуюструктуру антипараллельно-
го в-пласта. Сплошным прямоугольником обозначена малая модель
в-пласта с малым расстоянием между соседними связями N—H···O=C,
тогда как пунктирным прямоугольником обозначена модель с боль-
шим расстоянием N—H···O=C. Обе структуры можно взять за образец
большого в-пласта. Оба прямоугольника могут быть рассмотрены как
полный антипараллельный в-пласт. Таким образом, повторяя этот эле-
мент (содержащий оба образца), можно воспроизвести полный в-пласт
(Gerhards и др., 2006a)
фигурация с в-пластами и внутренними связями, что было определено эксперимен-
тально (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др., 2002). Важно заметить, что фор-
мируется более чем один димер с внутренними или внешними связями. Три возмож-
ных ориентации боковой цепи (g+, g–, a) для каждого мономера дают девять
возможных структур димера с внутренними или внешними связями. Количество ко-
лебательных частот для NH и CO, наблюдаемых в ИК/РДФИ спектрах, указывает на
то, что это симметричные структуры, а именно: структуры, в которых у этих двух мо-
номеров одинаковая ориентация боковой цепи. Таким образом, остаются только три
возможных структуры димеров с внутренними или внешними связями. В случае с
Ac—Phe—NHMe только расположение вL(g+)-вL(g+) соответствует экспериментально
наблюдаемым частотам и интенсивностям в областях колебаний C=O и NH (Gerhards
и др., 2004). Для (Ac—Phe—OMe)2 конфигурации вL(g +)-вL(g +) и вL(a)-вL(a)
соответствуют полученным экспериментально спектрам (Gerhards и Unterberg, 2002;
Gerhards и др., 2002). Вновь исследования в характеристичной спектральной области
указывают на то, какая структура присутствует. Так как большое количество инфор-
мации об основной цепи можно получить с помощьюИК спектроскопии, детальный
анализ положения боковых цепей может стать интересной задачей для измерений
вращательных спектров с высоким разрешением, которые теперь возможны для сис-
тем размера защищенной аминокислоты или ее димера.
Для построения большей модели с в-пластами размер системы увеличивают, сис-
тематически добавляя одну за другой аминокислоты. Это приводит к формированию
пептидных структур, что будет рассматриваться в следующем разделе.
Рис. 1.11. Динамические модели с в-пластами для двух структур, описанных на
рис. 1.10: a — для димера Ac—Phe—OMe наблюдается конфигурация с
внутренними связями (Gerhards и др., 2002; Gerhards и Unterberg, 2002);
b — в случае с Ac—Phe—NHMe возможны структуры и с внутренними,
и с внешними связями, но только конфигурация с внешними связями
была экспериментально обнаружена (Gerhards и др., 2004). (Рисунок ча-
стично взят из Gerhards и др. (2004).)
Для исследования процесса микросольватации представляют интерес кластеры
Phe с водой. Ким и его коллеги анализировали кластер Phe с одной молекулой воды,
применяя метод РДФИ (Lee и др., 2002a, b). Структуру идентифицировали исключе-
нием конформеров в результате гидратации. Выяснилось, что кластер можно полу-
чить из мономера А (см. рис. 1.6; А = 7), форма которого не изменяется существен-
ным образом при образовании комплекса с одной молекулой воды. Согласно ab initio
вычислениям (одноточечные энергии по теории MP2 для конфигураций, оптимизи-
рованных по теории ТФП, базисный комплект 6-31 + G(d)) самая устойчивая струк-
тура содержит молекулу воды, соединеннуюс карбоксильной группой. Таким обра-
зом, OH карбоксильной группы действует как протонный донор по отношениюк
молекуле воды, тогда как атом Н воды образует связь с C=O группой COOH. Полез-
но также применять метод ИК/РДФИ к системе Phe/вода, так как он дает непосред-
ственнуюинформациюо структуре. Важно, что этот метод также работает, когда
возбужденные кластеры фрагментируют, так как ИК возбуждение происходит до УФ
возбуждения, то есть ИК фотон возбуждает неповрежденный кластер.
Эффект микросольватации защищенной аминокислоты был исследован автором с
коллегами (Fricke и др., 2006b), которые анализировали кластер Ac—Phe—OMe с мо-
лекулами воды (в количестве до трех). Данные структуры были проанализированы с
помощьюметода ИК/РДФИ в области валентных колебаний NH и ОH, а также в об-
ласти валентных колебаний амида I и II. В отличие от незащищенных аминокислот,
воду нельзя присоединить к полярным концевым группам COOH и NH2. Два метода
присоединения одной молекулы воды показаны на рис. 1.12 (a) и (b). Существует
конкуренция между группами амидной связи NH (протонный донор) и CO (протон-
ный акцептор). В структуре (a) образуется связь между группами NH и CO, тогда как
в (b) одна молекула воды прикреплена в качестве протонного донора к группе CO
амидной функции. Интересно обратить внимание на то, что обе структуры получены
экспериментально (Fricke и др., 2006b). Для кластера с двумя молекулами воды фак-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 41
Рис. 1.12. Экспериментально наблюдаемые структуры для кластера Ac—Phe—OMe
с одной (a, b), двумя (c, d) и тремя (e) молекулами воды (Fricke и др.,
2006b). Четко видны конкурирующие эффекты для воды, выступающей
в качестве протонного донора или акцептора
тически была получена структура, где одна молекула воды расположена с каждой
стороны от Ac—Phe—OMe (см. рис. 1.12c). Данная структура — это наложение двух
кластерных структур с одной молекулой воды. Однако, также наблюдается и второй
изомер, в котором димер воды связан водородной связьюс CO амидной группы
(рис. 1.12d) (Fricke и др., 2006b). Наконец, только один изомер был получен для кла-
стера с тремя молекулами воды, который состоит из соединения с одной молекулой
в качестве мостика между группами NH and CO с одной стороны, и с димером воды с
водородной связьюс группой CO с другой стороны. Первый слой сольватации запол-
нен тремя дополнительными молекулами воды. Очень интересный результат — это
то, что в случае с Ac—Phe—OMe первый слой сольватации фактически никак не
влияет на основнуюцепь. То есть, основное положение вытянутой структуры, отно-
сящейся к в-пласту, остается. Интересно посмотреть на изменения структур в слу-
чае, если сольватациюбольших пептидов исследовать пошагово (то есть добавляя
молекулу воды одну за другой).
1.4.2. Триптофан
Триптофан — это аминокислота, наиболее эффективно поглощающая УФ излучение.
При помощи методов лазерной десорбции Леви и его коллеги в 1980-х получили его
РДФИ и ЛИФ спектры (Rizzo и др., 1985, 1986a, b; Philips и др., 1988). Из измерений
зависимости сигнала от мощности излучения можно предположить, что вклад в
РДФИ сигнал вносят шесть изомеров. То есть, переходы в РДФИ спектрах принад-
лежат одному и тому же конформеру, если интенсивности их пиков одинаковы (Rizzo
и др., 1986b). Пики, принадлежащие различным конформерам, не имеют одина-
ковых интенсивностей из-за различий в популяциях молекул, находящихся в состоя-
нии S0. Еще одно доказательство существования шести изомеров было получено с
помощьюспектров рассеянной флуоресценции (РФ), зарегистрированных для пере-
ходов из состояния S1. РФ cпектры не идентичны. В частности, широкий флуорес-
центный сигнал с красным смещением, наблюдаемый для изомера А (конформера с
самой низкой энергией возбуждения), дает основание для предположения о том, что
в электронно-возбужденном состоянии может быть образована амфионная форма
(Rizzo и др., 1986a). Другим объяснением этого явления может служить сильное
взаимодействие электронно-возбужденных состояний lLa и lLb конформера A. Со-
гласно измерениям рассеяния флуоресценции с высоким временным разрешенным
конформер А оказывается нейтральюс самым коротким временем жизни в электрон-
но-возбужденном состоянии (Engh и др., 1986; Philips и др., 1988). Более поздние эк-
сперименты показали, что спектры ЛИФ и РФ являются практически зеркальным
отражением друг друга (Snoek и др., 2001). Уширение пиков в спектре РФ может воз-
никать из-за неразрешенной электронно-колебательной структуры Trp, сигнал кото-
рой усиливается (из-за больших коэффициентов Франка-Кондона) в спектре РФ.
Ранняя работа группы Леви получила очень важные, но, в основном, косвенные
свидетельства существования различных конформеров Trp. Применение методов
двойного резонанса позволило проверить эти предположения. Действительно, как
УФ/УФ выжигание провалов (Piuzzi и др., 2000), так и ИК/РДФИ (Snoek и др., 2001)
спектроскопия подтвердили существование шести изомеров Trp. Исследования в об-
ласти валентных колебаний NH привели к идентификации, по крайней мере, пяти
изомеров. Самая устойчивая структура A (см. рис. 1.13a) содержит внутримолекуляр-
нуюводороднуюсвязь между ОН карбоксильной группы и группой NH2 с атомами
водорода группы NH2, направленными в сторону ароматического индольного кольца
боковой цепи (Snoek и др., 2001). Во второй самой устойчивой структуре E группа
NH2 действует как донор протонов по отношениюк C=O карбоксильной группы.
Cтруктуры А и E в дальнейшем были подтверждены измерениями в ИК характери-
стичной области от 330 до 1500 см–1 (Bakker и др., 2003) (см. рис. 1.13). Третий изо-
мер D содержит водороднуюсвязь между группой NH2 и ОH карбоксильной группы,
которая является акцептором протонов. Хотя это пока полностьюне подтверждено
ИК-спектроскопией, сходство расчетных и экспериментальных спектров и в характе-
ристичной области ИК спектра, и в области валентных колебаний NH подтверждает
даннуюгипотезу. Интересно обратить внимание на то, что исследования Trp в ка-
пельках гелия (Lindinger и др., 2001) продемонстрировали полное подавление струк-
туры A, которая является самой устойчивой в экспериментах с молекулярным пуч-
ком и во всех вычислениях, выполненных в данной системе до уровня MP2, включая
тройной-ж базисный набор (Snoek и др., 2001). Возможным объяснением данного эк-
спериментального результата может быть агрегация атомов He около ароматического
хромофора (индольного кольца), что приводит к дестабилизации структуры A. Этот
результат показывает, что сверхтекучий He существенно влияет на самые устойчивые
структуры.
Процесс микросольватации Trp был исследован путем добавления к нему молекул
воды. В двух экспериментах были исследованы водные кластеры при помощи сочета-
ния ИК/УФ спектроскопии и ab initio вычислений методом ТФП (Snoek и др., 2002;
Tarcabal и др., 2004). Исследования амидной области (Snoek и др., 2002) были расши-
рены до характеристичной области при помощи лазера на свободных электронах
(Tarcabal и др., 2004). Существенная проблема получения правильной структуры со-
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 43
Волновое число (см–1)
Рис. 1.13. Спектры ИК/РДФИ трех изомеров Trp в характеристичной области
и области амида II от 330 до 1500 см–1 (Bakker и др., 2003). Экспери-
ментальные спектры (вверху) сравниваются с расчетными спектрами
(ниже), полученными с помощьюТФП уровня B3LYP/6-31 + G(d).
Данные спектры приводятся и как линейчатые спектры, и как спект-
ральные профили лазера на свободных электронах (Oepts и др., 1994).
Соответствующие структуры изомеров A, D и E приводятся внизу (по-
дробно в тексте). (Рисунок взят из Bakker и др. (2003).)
Относительное
сечение (относи-
тельные единицы)
Интенсивность
ИК излучения
(Ї 100 км/мол)
стоит во фрагментации кластеров более высоких порядков до моногидратированных
кластеров. Выяснилось, что экспериментально полученный ИК спектр дает, главным
образом, трехгидратированный кластер. Для кластера Trp/вода важно обратить вни-
мание на то, что конформер Trp, наблюдаемый в кластере, не идентичен тому, кото-
рый был получен для одиночной молекулы Trp. То есть, вода не просто присоединя-
ется к мономеру Trp, но и перестраивает Trp в конфигурацию, оптимальную для
формирования оболочки сольватации. Кроме того, можно сделать вывод, что в клас-
терах с тремя или меньшим числом молекул воды амфионная структура не образует-
ся. В более ранней статье добавление других молекул (метанола, этанола, хлорофор-
ма, бензола и ацетона) исследовали ЛИФ спектроскопией и рассеянной флуоресцен-
тной спектроскопией (Teh и др., 1989). Согласно результатам электронной спектро-
скопии молекула растворителя присоединена к б-амину (то есть к группе NH
основной цепи), а не к группе NH индольной структуры.
Как и в случае с Phe, несколько производных Trp были исследованы различными
методами. В ранних статьях группа Леви (Park и др., 1986; Tubergen и др., 1990) про-
анализировала методами ЛИФ, РДФИ и РФ следующие производные: 3-индол-ук-
суснуюкислоту, 3-индолпропионовуюкислоту, триптамин, N-ацетилтриптофанэти-
ловый эфир (NATE), различные амиды триптофана, N-ацетилтриптофан, N-ацетилт-
риптофанамид (NATA) и N-ацетилтриптофан-диметиламид (NATDMA). В последней
молекуле Trp ацетилирован по NH2-группе и амидирован в кислотном участке (ис-
пользовался или чистый или диметилированный амид). Цель всех этих исследова-
ний состояла в том, чтобы понять, почему подобные вещества дают различные элек-
тронные спектры. В частности, некоторые спектры имеют отчетливые пики в облас-
ти низких частот и широкий флуоресцентный пик с красным смещением, тогда как
другие конформеры тех же самых веществ дают четкие резонансные флуоресцентные
спектры без явных низкочастотных переходов. Предполагается, что вероятность фор-
мирования внутримолекулярной водородной связи между группой NH и карбониль-
ной группой может вести к различным электронным спектрам. Относительные поло-
жения основной и боковой цепей (индольного кольца) также сильно влияют на
спектроскопические результаты. Важно заметить, что индольное кольцо обладает
двумя близкими электронными состояниями: 1La и 1Lb. Спектроскопические данные
являются следствием возмущения электронной структуры, обусловленного типом
производного аминокислоты и конфигурацией исследуемых молекул. Данный аспект
также рассматривала группа Цвира, опубликовавшая ряд статей по NATA, в частно-
сти, по N-ацетилтриптофан-метиламиду (NATMA, Ac—Trp—NHMe) (Dian и др.,
2002a, b; 2003, 2004a, b, c; Evans и др., 2004). Как и Ac—Phe—NHMe (см. выше),
NATMA (Ac—Trp—NHMe) представляет собой дипептид. С помощьюспектроскопии
УФ/УФ выжигания провалов были определены электронно-возбужденные состояния
для трех различных конформеров NATMA. В отличие от двух других конформеров,
третий имеет широкий электронный переход (см. спектр выжигания провалов во
вставке на рис. 1.14 и структуры на рис. 1.3) (Dian и др., 2002a). При дальнейшем
применении ИК/УФ спектроскопии двойного резонанса были получены частоты ко-
лебаний, сравненные с расчетными спектрами (подробно о вычислении спектров
см. раздел 1.7). Оказалось, что вещество с широким электронным переходом имеет
г-виток C5. Необычное поведение данной структуры объясняется возможным взаи-
модействием состояния 1ру* с состоянием 1Lb. Данное взаимодействие может быть
результатом ориентации и силы дипольного момента, а также ориентации боковой
цепи относительно основной цепи (с группой NH, которая может быть направлена к
р-системе). Прямое свидетельство о взаимодействии состояния 1ру* с состоянием
1Lb получают по ИК/РДФИ спектрам состояния S1. В спектрах, принадлежащих изо-
мерам с г-витком и имеющим широкий пик УФ поглощения, индольные валентные
колебания не обнаруживаются, что указывает на диссоциацию из состояния 1ру* по
связи NH (Dian и др., 2003). Этот результат ясно показывает, что фотофизика зави-
сит от структуры частиц, а не только от типа растворителя.
NATMA представляет интерес не только с точки зрения исследования различных
электронных состояний, но также может быть использована для демонстрации мето-
дов ИК спектроскопии изменения популяции и ИК спектроскопии заполнения про-
валов (см. рис. 1.14 (Dian и др., 2002b, 2004c)). В случае с NATMA популяция может
очень эффективно перераспределяться между различными изомерами, хотя в ходе
экспериментов наблюдалась лишь умеренная селективность конформеров. Другими
словами, возбуждение одного изомера, например, самого устойчивого C5, ведет к об-
разованиюдвух других изомеров, но никогда к формированиюизомера, не принад-
лежащего к трем наиболее стабильным. Распределение популяции моделировали с
помощьюпотенциалов силовых полей (Amber, OPLS) в сочетании с РРКМ вычисле-
ниями (Evans и др., 2004). Экспериментальные результаты моделировали функцией,
зависящей от избыточной энергии и скорости охлаждения. Охлаждение после ИК
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 45
Волновое число (см–1)
Увеличение
Снижение
Волновое число (см–1)
Рис. 1.14. a — ЛИФ спектр NATMA (Ac—Trp—NHMe), проанализированный спек-
троскопией УФ/УФ выжигания провалов (вставка). Таким образом был
определен вклад от трех изомеров NATMA (см. рис. 1.3); b — спектр,
полученный методом заполнения провалов, зарегестрированный при
возбуждении одного валентного колебания NH изомера B. Сканируя
УФ лазер, можно наблюдать уменьшение флуоресценции для изомера B
и увеличение флуоресценции для изомеров А и C (Dian и др., 2002b).
Для C проявляются только широкие спектральные переходы, что указы-
вает на наличие очень эффективных каналов релаксации электронного
возбуждения (Dian и др., 2003) (подробнее см. в тексте). (Рисунок взят
из Dian и др. (2002b).)
Интенсивность (относительные единицы)
возбуждения является важным фактором, влияющим на это перераспределение.
Условия охлаждения менялись при изменении давления и относительного расстоя-
ния x/D (где x — расстояние до скиммера, D — диаметр отверстия скиммера). Для
нескольких значений x/D, давления и длин волн ИК и УФ излучения были зарегист-
рированы ИК/УФ спектры при различных временах задержки между импульсами
ИК и УФ лазеров. Результаты оказались чрезвычайно чувствительны к изменению
параметра x/D, так как охлаждение происходит за несколько сотен наносекунд (Dian
и др., 2004b).
Для получения более четкого понимания о влиянии различных факторов на изме-
нение популяции изомеров исследования были распространены на мелантонин, кото-
рый дает больший чем NATMA, сигнал и имеет в основной цепи всего одну группу NH
(Dian и др., 2004b). Оказывается, что перераспределение можно изменить, варьируя
условия охлаждения. Кроме того, перераспределение после ИК возбуждения наблю-
далось между различными транс-изомерами, но не для цис-структур. Это является ре-
зультатом влияния высоты барьера транс-цис-изомеризации, который невозможно
преодолеть при поглощении одного ИК фотона. Таким образом, выбранный метод
пригоден для определения высоты барьера (Dian и др., 2004b). Вопросы, касающиеся
селективности метода в химических процессах, остаются открытыми. Они могут быть
исследованы при помощи ИКИП спектроскопии и спектроскопии заполнения прова-
лов. Как было упомянуто выше, необходимо принять во внимание многие параметры
(например, выбраннуюдлину волны ИК излучения, интенсивность охлаждения, коли-
чество изомеров, относительнуюэнергиюиз омеров). Кроме того, исследования состо-
яния S1 требуют более сложного описания, чем состояние S0, вследствие влияния воз-
мущений, вызванных различными электронными состояниями.
Другой причиной исследования защищенного Trp является анализ элементов вто-
ричных структур. Из данных РДФИ и ИК/РДФИ спектроскопии и ab initio вычисле-
ний следует, что мономер Trp имеет структуру в-пласта (Gerlach и др., 2005). Данный
результат подобен полученному для защищенных аминокислот Ac—Phe—OMe и
Ac—Phe—NHMe (Gerhards и Unterberg, 2002; Gerhards и др., 2002, 2004), для которых
структуры в-пласта самые устойчивые. Как и в случае с защищенными аминокисло-
тами, содержащими Phe (Ac—Phe—OMe и Ac—Phe—NHMe), димер Ac—Trp—OMe мог
бы служить моделью в-пласта. Однако основное различие между аминокислотами
Phe и Trp заключается в наличии полярной группы в боковой цепи Trp. В частности,
индольная NH группа участвует в образовании межмолекулярных водородных связей
с группами CO второго Trp (см. рис. 1.15b, c). Действительно, анализ димера
(Ac—Trp—OMe)2 дает структуру, в которой одна из индольных групп NH образует во-
дороднуюсвязь с С=O эфирной группы, тогда как другая образует водороднуюсвязь
с CO ацетильной группы (Gerlach и др., 2005). Эта структура асимметрична (см. рис.
1.15c), тогда как в симметричной структуре (рис. 1.15b) обе индольные группы NH
были бы соединены водородной связьюили с CO эфирных или ацетильных групп.
Модельная система для в-пласта (рис. 1.15a) с водородными связями между группа-
ми NH основной цепи и CO эфирных групп (которые параллельны группам NH
основной цепи) не наблюдается, так как индольные группы NH более кислотные.
Данное различие между Phe и Trp указывает на сильное влияние боковой цепи на
структуры аминокислот. Такое влияние боковой цепи может усилиться при возник-
новении водородных связей между группами NH и р-системами боковой цепи. Ис-
следования различных защищенных аминокислот показывают, что взаимодействие
между боковыми и основными цепями влияет на структуры как изолированных пеп-
тидов, так и на структуры их кластеров. В частности, для наблюдения в-пластов сле-
дует избегать боковых цепей с полярными группами (например, NH или ОН). Инте-
ресен вопрос: приводит ли добавление воды, например, к димеру Ac—Trp—OMe к
трансформации димера в в-пласт с сольватированными группами NH индольной бо-
ковой цепи или сольватированы лишь свободные функциональные группы основной
цепи (NH или CO) при сохранении структуры несольватированного димера? Экспе-
рименты, похоже, указывают на то, что первая молекула воды присоединяется через
водороднуюсвязь NH···O=C димера. Получается, что при большем количестве мо-
лекул растворителя можно получить структуру с в-пластами димера Ac—Trp—OMe.
1.4.3. Применение СВЧ спектроскопии
Свободные аминокислоты интенсивно изучались при помощи СВЧ спектроскопии в
газовой фазе. Глицин, самая простая аминокислота, был предметом многих исследова-
ний. Начиная с ранней работы Брауна и его коллег (Brown и др., 1978) и Сьюнрама и
Ловаса (Suenram и Lovas, 1978), СВЧ спектр глицина рассматривался несколько раз с
цельюполного структурного анализа трех возможных конформеров глицина (Berulis и
др., 1985; Bludsky и др., 2000; Brauer и др., 2004; Brown и др., 1978; Godfrey и Brown,
1995; Godfrey и др., 1996; Guelin и Cernicharo, 1989; Hollis и др., 1980; Lovas и др., 1995;
McGlone и др., 1999; Miller и др., 2005; Senent и др., 2005; Snyder и др., 1983; Suenram и
Lovas, 1978, 1980; Suenram и др., 1989). В самой устойчивой структуре группа NH2 об-
разует разветвленнуювнутримолекулярнуюводороднуюсвязь с группой C=O (изомер
I). То же самое наблюдается для аланина (Blanco и др., 2004; Brauer и др., 2004; Csaszar,
1996; Godfrey, 1993; Godfrey и др., 1996; McGlone и др., 1999).
Гистамин был исследовал Фогельсангером и его коллегами (1991). Они регистри-
ровали вращательный спектр в спектрометре со свободно расширяющейся сверхзву-
ковой струей. Наблюдались четыре конформера (Vogelsanger и др., 1991). Два различ-
ных конформера аланина наблюдали Годфри и его коллеги (Godfrey и др., 1996) с
помощьюспектрометра со свободно расширяющейся сверхзвуковой струей и моду-
ляцией Штарка. Развитие методов абляции (Suenram и др., 1999; Lessari и др., 2003)
открыло путь к исследованиюдругих аминокислот, которые ранее было невозможно
изучать в газовой фазе из-за фрагментации при нагревании. Алонсо и его коллеги
зарегистрировали вращательные спектры пролина, валина (Lessari и др., 2002, 2004)
и аланина (Blanco и др., 2004), применяя СВЧ спектроскопиюмолекулярных пучков
1.4. Спектроскопия двойного резонанса и СВЧ спектроскопия аминокислот 47
Рис. 1.15. Различные структуры димера Ac-Trp-OMe (Gerlach и др., 2005): a — ди-
намическая модель в-пласта со связями N—H···O=C между основны-
ми цепями; b — димер с водородными связями между NH индольной
группы и C=O эфирной группы. Его называют симметричным диме-
ром, так как у обоих мономеров водородные связи принадлежат одному
и тому же типу. В отличие от этой структуры c — асимметричный ди-
мер, где NH одной индольной группы соединена водородной связьюс
С=O эфирной группы, тогда как NH другой индольной группы образует
водороднуюсвязь с C=O амидной группы. (Рисунок взят из Gerlach и
др. (2005).)
с лазерной абляцией и использованием преобразования Фурье (СВЧС МП ПФ). Для
пролина (Allen и др., 2004; Czinski и Csaszar, 2003) были обнаружены два конформера
с водородной связьюмежду OH карбоксильной группы и одиночной парой электро-
нов азота. Этот экпериментальный факт отличается от наблюдаемого для самых
устойчивых конформеров глицина и аланина с вышеупомянутой разветвленной
внутримолекулярной водородной связьюмежду группами NH2 и C=O. Для валина
было найдено два конформера с двумя различными типами водородной связи, опи-
санными выше.
Начиная с середины 1990-х несколько производных и аналогов аминокислот
были исследованы путем регистрации вращательных спектров. Туберген и его колле-
ги зарегистрировали вращательные спектры семи изотопных аналогов аланинамида
(Lavrich и др., 1999). Они выявили структуру с водородной связьюмежду амидом и
амином, в которой амидная группа играла роль донора. В более поздней работе Лав-
рич и Туберген исследовали кластер аланинамида с водой, который является инте-
ресным примером производного аминокислоты с водородной связью(без ароматиче-
ского хромофора) (Lavrich и Tubergen, 2000). Здесь вода действует и как водородный
донор по отношениюк группе C=O, и как водородный акцептор по отношениюк
NH2 амидной группы, образуя циклическуюструктуру с водородной связью, похо-
жуюна структуру изомера Ac—Phe—OMe(H2O)1—3 (см. рис. 1.12a, c, e).
Модель дипептида N-ацетилаланин N-метиламид и его изотопный аналог 15N(15N2)
были успешно изучены посредством спектроскопии СВЧС МП ПФ. В данной системе
была обнаружена свернутая структура г-типа (Lavrich и др., 2003b), похожая на полу-
ченнуюдля других дипептидных моделей таких, как, например, Ac—Phe—NHMe или
Ac—Trp—NHMe (см. выше). Кроме того, были изучены производные валина, глицина
и пролина. Исследование валинамида не привело к однозначному соответствиюмежду
теоретическими и экспериментальными результатами, но согласно ab initio вычислени-
ям у трех самых устойчивых конформеров есть внутримолекулярные водородные связи
(Lavrich и др., 2002). У N-ацетилглицина был обнаружен только один конформер с
внутримолекулярной водородной связью между карбонильной группой кислоты и
амидным протоном (Lovas и др., 2004). Были также обнаружены два конформера каж-
дой молекулы в экспериментальных исследованиях 4(S)- и 4(R)-гидроксипролина
(Lessari и др., 2005). И снова у каждого конформера была обнаружена внутримоле-
кулярная водородная связь или между одной парой электронов атома азота кольца и
OH карбоксильной группы, или между NH и C=O.
Исследование дикетопиперазина предложило интересное объяснение конформа-
ционных свойств циклопептидов (Bettens и др., 2000). Был обнаружен только один
изомер, который имеет структуру, отличнуюот структуры в твердой фазе, получае-
мой с помощьюрентгеновской кристаллографии.
Кроме того, модели пептидов (Lavrich и др., 2003a; Ohashi и др., 2004) и аналоги
тирозина и триптофана, тирамина (Melandri и Maris, 2004) и триптамина (см. раз-
дел 1.3) были изучены посредством СВЧ спектроскопии.
Наконец, необходимо упомянуть о том, что все изолированные аминокислоты,
исследованные в газовой фазе до сих пор, не являются амфионами. Данные структу-
ры возникают в результате агрегации с водой. Возникает вопрос, сколько молекул
воды необходимо для образования амфиона. За исключением теоретических подхо-
дов (см. например, Ding и Krogh-Jespersen (1992), Jensen и Gordon (1995), Gutowski и
др. (2000), Kassab и др. (2000), Chaudhari и др. (2004, 2005a, b)), Боуэн, а также
Джонсон и его коллеги (Diken и др., 2004, 2005; Xu и др., 2003) анализировали клас-
теры группы анионов глицина/воды, применяя масс-спектрометрию, фотоэлектрон-
нуюспектроскопию(Xu и др., 2003) и методы ИК фотодиссоциации (Diken и др.,
2004, 2005). Хотя эти системы являются анионами, утверждают, что роль дополни-
тельного электрона зависит от гидратации. Таким образом, по результатам, получен-
ным из исследования анионов, можно сделать вывод о том, что для формирования
амфиона в нейтральном кластере необходимо меньшее число молекул воды. Боуэн и
его коллеги нашли, что амфионная структура образуется при добавлении пяти мо-
лекул воды. Джонсон и его коллеги наблюдали формирование кластеров (глицин/
H2O)12, – . Будущие ИК исследования эффективно охлажденных анионов глицина/воды
сделают возможным изучение формирования структур кластеров различных разме-
ров. Первый ИК спектр фотодиссоциации, зарегистрированный для «теплого» клас-
тера, глицин/(H2O)6
– не может быть однозначно интерпретирован (Diken и др., 2005).
Кроме кластеров глицина с водой, Боуэн и его коллеги исследовали анионные
кластеры Trp и Phe с водой. Было найдено, что для образования амфиона необходи-
ма сольватация четырьмя молекулами воды (Xu и др., 2003).
1.5. Спектральный анализ пептидных структур
Стимулом исследования поведения пептидов является получение информации о дви-
жущих силах трансформации белков. В экспериментах в газовой фазе можно иссле-
довать изолированные пептиды. Также можно определить зависимость формирова-
ния различных вторичных структур от последовательности аминокислотных остат-
ков. Даже для защищенных аминокислот могут быть рассмотрены различные мотивы
вторичных структур (г-виток, в-пласт и т.д.), см. раздел 1.4. Рассмотрение агрегации
пептидов помогает изучениюселективности и эффективности межмолекулярных
пептидных связей. Наконец, последовательное добавление молекул воды (процесс
микросольватации) позволяет проанализировать влияние сольватации на структуру
пептидов.
Были исследованы три основных типа аминокислот и пептидов:
1) незащищенные пептиды со свободной кислотной группой COOH, а также
группой NH2; 2) частично защищенные пептиды с ацетилированной группой NH2
и COOH группой, которая или не модифицирована, или метилирована; 3) циклопеп-
тиды, у которых соединены концы (COOH и NH2).
Как уже было сказано во введении, первуюэкспериментальнуюработу по изуче-
ниюпептидов выполнили Леви и его коллеги. Они применяли РДФИ и ЛИФ спек-
троскопиюдля дипептидов Trp—Gly, Gly—Trp, Phe—Trp, Trp—Phe и Trp—Trp и три-
пептидах Trp—Gly—Gly и Gly—Gly—Trp (Cable и др., 1987, 1988a, b). Спустя более чем
10 лет де Ври и его коллеги продолжили эту работу и исследовали ряд дипептидов
(Gly—Tyr, Ala—Tyr, Tyr-Ala) и трипептид Phe—Gly—Gly (Cohen и др., 2000). В этой
работе также применялась спектроскопия УФ/УФ выжигания провалов для опреде-
ления числа конформеров различных веществ, которые вносят вклад в РДФИ
спектр. Более того, было сделано предварительное определение возможных структур
путем сравнения пиков РДФИ спектров с вычислениями, выполненными для соот-
ветствующих молекул, находящихся в состоянии S0. Подобные же исследования
(с применением УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса) выполнили Кляйнер-
манс и его коллеги (Hьnig и др., 2003) для дипептидов Gly—Trp, Trp—Ser и Pro—Trp
(см. рис. 1.16).
Все эти приложения дают возможность определить число конформеров. Однако,
в отличие от УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса, применение методов
ИК/УФ двойного резонанса позволяет получить информациюо структурах в состоя-
нии S0. Таким образом, сравнивая колебательные частоты, полученные эксперимен-
тально, с расчетными значениями и значениями, полученными для меньших субъе-
диниц, можно получить сведения о структурах. Группа автора этой главы сначала
применяла ИК/РДФИ для защищенного дипептида Ac—Val—Phe—OMe (Unterberg и
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 49
др., 2003) (см. рис. 1.17). Спектры регистрировались в области NH и области амида
I/II. Использование новой ИК системы с высоким разрешением в области амида I/II
позволило нам определить близко расположенные колебательные частоты связи
C=O. Согласно данным, полученным для Ac—Phe—OMe и согласующимися с вычис-
лениями методом Хартри-Фока в приложении к дипептидам, для данной молекулы
возможна структура в-пласта. Интересно, что для дипептидов был получен только
один изомер, что указывает на конформационнуюпреселекциюв газовой фазе. Это
частично является следствием влияния защитных групп, которые исключают образо-
вание изомеров, формирующих межмолекулярные структуры с водородными связя-
ми между кислотными и основными концевыми группами.
Начиная с 2004 года, был опубликован ряд статей об исследованиях защищенных
пептидов с применением ИК/РДФИ техники. Монс и его коллеги исследовали раз-
личные дипептиды и трипептиды с цельюполучения моделей различных элементов
вторичных структур (Chin и др., 2004, 2005b, c). Были исследованы конформеры
Ac—Pro—Phe—NH2 и Ac—Phe—Pro—NH2 (Chin и др., 2004), а также Ac—Phe—Gly—NH2
и Ac—Gly—Phe—NH2 (Chin и др., 2005c) (см. рис. 1.18). Кроме того, ряд трипептидных
моделей вида Ac—X—Phe—NH2 (X = Gly, Ala, Val) (Chin и др., 2005b) был проанализи-
рован при помощи ИК/РДФИ спектроскопии в сочетании с ab initio ТФП вычисле-
ниями. В случае с Ac—Pro—Phe—NH2 последовательность, состоящая из двух гL-вит-
ков, оказалась самой стабильной структурой (см. рис. 1.8e), тогда как для
Ac—Phe—Pro—NH2 вL(гош—)-гL наиболее устойчива структура, показанная на
рис. 1.8c. Менее выгодный конформер образует структуру в-витка (рис. 1.8d; такие
структуры также называют структурами C10). Хотя добавление Pro в аминокислотную
Рис. 1.16. РДФИ и УФ/УФ спектры выжигания провалов для дипептида Trp-Ser,
указывающие на присутствие двух изомеров (Hьnig и др., 2003). Кроме
того, видны низкочастотные пики. Структура, показанная на этом ри-
сунке, не обязательно связана с одним из спектров, так как прямой ин-
формации о структуре из УФ спектров не было получено. (Подробнее
см. в тексте.) (Рисунок взят из Hьnig и др. (2003).)
последовательность пептида может благоприятствовать образованиюструктуры в-вит-
ка, Pro оказался не самым важным компонентом. Всегда существует баланс между
прочностьюмежмолекулярных водородных связей (которые прочнее в структурах
г-витка и относительно слабы в в-витках, что определяется по небольшому красному
смещениюдля группы NH, вовлеченной в водороднуюсвязь) и натяжением основной
цепи пептида (которое слабее для в-витка). Кроме того, взаимодействия вида NH···р
могут повлиять таким образом, что структуру будет невозможно предсказать на осно-
вании последовательности аминокислот.
Конкуренция различных взаимодействий приводит к двум конформерам трипеп-
тидов Ac—Phe—Gly—NH2 и Ac—Gly—Phe—NH2. Наиболее устойчивый изомер
Ac—Phe—Gly—NH2 имеет структуру вL(a)-гL, а менее выгодный изомер имеет конфи-
гурацию в-витка. В случае с Ac—Gly—Phe—NH2 образуется последовательность двух
г-витков (см. рис. 1.18) и одного в-витка (Chin и др., 2005c). Для Ac—Phe—Gly—NH2
предпочтительнее в-виток типа II, тогда как для Ac—Gly—Phe—NH2 наиболее вероя-
тен виток типа I. Различные типы в-витков различаются по ориентации основной
цепи пептида, характеризуемой двумя наборами углов ш и (Venkatachalan, 1986;
Hutchinson и Thornton, 1994). Подобная структура также наблюдается у других ди-
пептидов ряда Ac—X—Phe—NH2 (где X = Ala, Val). В частности, были обнаружены два
изомера со структурами г- или в-витков (Chin и др., 2005b).
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 51
ИК/РДФИ спектр
1765 Сложный
эфир
1711 Ацетил
Волновое число ИК лазера (см–1)
Рис. 1.17. ИК/РДФИ спектры Ac—Val—Phe—OMe в областях амида I (C=O), ва-
лентных CH и амида А колебаний (Unterberg и др., 2003). Структура,
показанная на этом рисунке, получена в результате анализа ИК спектра
в сочетании с ab initio вычислениями. Переходы для NH c частотами
более 3400 см–1 (с одним обертоном при 3420 см–1) указываю т на
структуру, относящуюся к в-пласту. Подробнее см. статьюUnterberg и
др. (2003). (Рисунок взят из Unterberg и др. (2003).)
52 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
в-виток II (а)
Рис. 1.18. а — ИК/РДФИ спектры области амида А (колебания NH) для раз-
личных изомеров пептидов Ac—Phe—Gly—NH2 и Ac—Gly—Phe—NH2.
Наиболее интенсивные изомеры А трипептидов Ac—Phe—Gly—NH2
и Ac—Gly—Phe—NH2 имеют структуры вL—гL (сравните с подобной
структурой на рис. 1.8c) и гL—гL (сравните с рис. 1.8e), соответственно.
Второй компонент B представляет различные структуры в-витка (типы
II и I) для двух модельных трипептидов. Вычисленные колебательные
частоты получены методом ТФП (уровень B3LYP/6-31 + G(d)). Подроб-
нее см. Chin и др. (2005).) (Рисунок взят из Chin и др. (2005c).); b — са-
мые устойчивые структуры у Ac—Phe—Gly—NH2. Структура вL(a)—гL
включает не только взаимодействие C5 и C7, но также и взаимодейст-
вие N—H···р между основной и боковой цепями, что стабилизирует
связь. (Рисунок взят из Chin и др. (2005c).)
Изучение дипептидов было продолжено для защищенных трипептидов, которые
используются как модели тетрапептидов. В недавних публикациях группа Монса ис-
следовала системы Ac—Phe—Gly—Gly—NH2 (Chin и др., 2005a), Ac—Ala—Phe—Ala—
—NH2, Ac—Ala—Ala—Phe—NH2 и Ac—Phe—Ala—Ala—NH2 (Chin и др., 2005e).
Ac—Phe—Gly—Gly—NH2 имеет структуру с двумя последовательными в-витками
(см. рис. 1.8g) при отсутствии винтовой структуры. Ac—Phe—Ala—Ala—NH2 содержит
комбинациюструктур в-пласта и двух г-витков (вL(a)-гL-гL). Ac—Ala—Ala—Phe—NH2
формирует структуру, содержащую в-виток и мотив гL (Chin и др., 2005e) (см. рис.
1.8f). Третий изомер, Ac—Ala—Phe—Ala—NH2, служит первой динамической моделью
для описания винтовой структуры типа 310, в которой наблюдаются два последова-
тельных в-витка (типа III и типа I), что указывает на начало винтовой структу-
ры, состоящей из трех аминокислотных остатков на одном витке (Chin и др., 2005e)
(рис. 1.8h).
Группа автора этой главы продолжила работу с модельным трипептидом
Ac—Val—Tyr(Ме)—NHMe (Fricke и др., 2004). Хромофор здесь — тирозин, содержа-
щий группу OMe вместо группы OH. Такая модификация была сделана для того, что-
бы исключить образование любых внутримолекулярных водородных связей с груп-
пой OH боковой цепи. Для данной молекулы был получен только один изомер. Его
структура может быть интерпретирована как вL—вL (структура, полностьюотнося -
щаяся к в-пласту) (Fricke и др., 2004) (см. рис. 1.19). Так как спектральные парамет-
ры для в-витков очень схожи, то для модельного трипептида был записан полный
спектр вплоть до частот 1000 см–1 при помощи нашей лазерной системы с высо-
ким разрешением (см. рис. 1.19 (Fricke и Gerhards, 2005)). Можно сказать, что
Ac—Val—Tyr(Ме)-NHMe — наиболее хорошо спектроскопически исследованная мо-
лекула такого размера. Наша лазерная система с высоким разрешением помогла за-
регистрировать спектры в области валентных колебаний NH и амида I/II вплоть до
характеристичной области ~ 1000 см–1. Тем не менее, спектры, наблюдаемые для
двух полностьюразличных структур, описанных здесь, очень похожи. Это является
хорошим примером того, что спектральные исследования иногда неоднозначны.
Хотя обширная спектральная информация и может быть получена (см. например,
интерпретацию Ac—Phe—OMe в разделе 1.4), надежная идентификация структуры
возможна только по полному спектру.
Наконец, был исследован модельный тетрапептид Ac—Leu—Val—Tyr(Ме)—NHMe,
в результате чего были получены две структуры, содержащие или набор трех после-
довательных г-витков, или комбинацию в- и г-витков (Fricke и др., 2006c). Поводом
для выбора такого варианта тетрапептида послужила идея моделирования пептида
KLVFF (Lys—Leu—Val—Phe—Phe) (в нашей модели вместо Phe присутствует Tyr),
важного для изучения болезни Альцгеймера (см. раздел 1.6).
Можно сказать, что большая часть исследований защищенных пептидов была вы-
полнена до сих пор с цельюсистематичес кого исследования элементов вторичных
структур и понимания движущих сил и механизмов свертывания пептидов. По неза-
щищенным пептидам были опубликованы две статьи, рассматривающие системы
Trp—Gly, Gly—Trp и Trp—Gly—Gly с помощьюИК/РДФИ спектроскопии в области
валентных колебаний NH (Hьnig и Kleinermanns, 2004), а также в характеристичной
области спектра при применении лазера на свободных электронах (Bakker и др.,
2005). В случае с Trp—Gly были обнаружены, по крайней мере, четыре конформера.
Однако ИК спектры были получены только для двух из них. Наиболее интенсивный
изомер практически полностьюразвернут. Однако взаимодействие N—H···NH2
между группой NH Trp и группой NH2 свободной кислоты все еще имеет место. Для
Gly—Trp наблюдаются два конформера, и для обоих наблюдается (как и для Trp—Gly)
взаимодействие N—H···NH2. Однако один конформер более вытянутый (разверну-
тый), тогда как другой содержит прочнуюводороднуюсвязь ОН···O=C между груп-
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 53
пой COOH глицина и группой CO Trp. Для трипептида Trp—Gly—Gly наблюдаются
два изомера. В одном изомере обнаруживается прочная водородная связь ОН···O=C
между группой COOH и первым, и вторым глициновыми остатками. Кроме того, об-
разуется водородная связь между NH индольной группы и C=O группы COOH. За
исключением взаимодействия N—H···NH2, второй изомер практически полностью
развернут. Структуры, полученные на основе ИК спектров, не совсем однозначны,
и из-за дополнительных свободных групп COOH и NH2 необходимо рассчитывать
больше структур для свободных пептидов, чем для защищенных систем. Данные
группы могут участвовать в нескольких водородных связях (см. например, простую
молекулу Phe (Snoek и др., 2000)), что приводит к усложнениюанализа структуры.
Третий класс важных пептидов — это циклопептиды, у которых N- и C-концы
соединены. Данные молекулы представляют интерес с точки зрения выполнения
ими различных биологических функций таких, как, например, перенос ионов
(Duax и др., 1996; Kubik и др., 2002). Первые спектроскопические исследования
изолированных пептидов, отобранных по массе, были выполнены Вайнкауфом и
54 Глава 1. Спектроскопия нейтральных пептидов в газовой фазе: структура, химическая
активность, микросольватация, молекулярное распознавание
Экспериментальный
Относящийся
к в-пласту
в-виток
Волновые числа ИК-лазера (см–1) Волновые числа ИК-лазера (см–1)
Относящийся
к в-пласту
в-виток
Рис. 1.19. ИК/РДФИ спектр модельного трипептида Ac—Val—Tyr(Ме)-NHMe в
областях амида А (колебания NH) и амида I/II (см. также Fricke и др.
(2004)), а также в характеристичной области спектра вплоть до
1000 см–1. Сравнивая экспериментальный спектр с расчетным (ТФП,
функционал B3LYP, базисный комплект 6-31 + G(d)), невозможно сде-
лать однозначный выбор между структурой в-пласта и структурой
в-витка, что указывает на трудности, которые могут возникнуть в неко-
торых случаях несмотря на наличие спектральной информации
его коллегами. Они исследовали циклический пептид Trp—Gly с помощьюРДФИ и
УФ/УФ спектроскопии двойного резонанса (Wiedemann и др., 2004). Де Ври и его
коллеги первыми применили ИК/РДФИ метод. Они изучали циклопептид Phe—Ser
(Abo-Riziq и др., 2005). Для него было обнаружено пять различных изомеров (так-
же с помощьюУФ/УФ спектроскопии двойного резонанса). ИК спектры изомеров,
а также соответствующие структуры и их расчетные колебательные частоты показа-
ны на рис. 1.20. Превосходное совпадение расчетных и экспериментальных значе-
ний указывает на то, что идентификация различных изомеров может быть доста-
точно достоверной.
Всего одна статья была опубликована по микросольватации пептидов. В ней был
исследован комплекс Ac—Val—Tyr(Ме)—NHMe(H2O)1 (Fricke и др., 2004). По
ИК/РДФИ спектру можно сказать, что молекула воды действует как акцептор водо-
рода и соединена водородной связьюс защитной группой NHMe. Исследование бо-
льших кластеров (с большим количеством молекул воды), а также исследования раз-
личных кластеров пептид/вода — важное направление будущих экспериментов. Не-
обходимо упомянуть, что наблюдение больших кластеров пептидов с несколькими
молекулами воды при помощи масс-спектрометрии — не проблематично, но значи-
тельная фрагментация таких кластеров после УФ возбуждения мешает получить од-
нозначнуюкорреляциюмежду наблюдаемым ИК/РДФИ спектром и размером клас-
тера. Таким образом, необходимо регистрировать бихромные РДФИ спектры (см.
рис. 1.1 и 1.2), процесс получения которых характеризуется пониженной фрагмен-
тацей.
В настоящее время проводится значительная работа по изучениюдругих типов
пептидов (защищенных или незащищенных, циклопептидов). Область применения
анализа больших пептидов в газовой фазе быстро растет, и некоторые группы ученых
уже преуспели в исследованиях больших систем. Что касается незащищенных разно-
видностей, дельта-сониндуцирующий нонапептид (ДИСП) был исследован с помо-
щьюлазера на свободных электронах в области 600—2200 см–1. Но только с помо-
щьюэкспериментов в характеристичной области спектра и области амида I/II невоз-
можно отличить свернутые структуры от развернутых (Bakker и др., 2005). Однако
этот эксперимент — только первый шаг, который указывает на возможность иссле-
дования больших систем. Точно так же циклический грамицидин S, состоящий из
10 аминокислотных остатков, был исследован с применением ИК/РДФИ метода в
области валентных колебаний NH. У него было обнаружено несколько изомеров
(de Vries, 2005). Наконец, модельная система для в-пласта, образованного агрегацией
двух трипептидов (димер Ac—Val—Tyr—NHMe), была исследована в области валент-
ных NH и C=O колебаний с использованием новой лазерной системы с высоким
разрешением (Gerhards и др., 2006a). Этот димер —первая модель в-пласта, которая
содержит и «внутренние», и «внешние» связи (см. рис. 1.10). Таким образом, в-пласт
служит модельюячеек, из которых можно составить большой в-пласт путем просто-
го масштабирования.
Все стратегии и результаты схожи тем, что они подверждают эффективность ком-
бинированной ИК/УФ спектроскопии в качестве мощного инструмента исследова-
ния больших пептидных систем. Хотя РДФИ спектры в целом содержат очень широ-
кие пики, соответствующие ИК/РДФИ спектры демонстрируют спектральные пере-
ходы с хорошим разрешением. Более того, ширина пика — это признак типа перехо-
да. Узкие пики указывают на наличие свободных NH или CO групп, тогда как более
широкие пики соответствуют структурам с водородными связями. Однако данные
тенденции незначительно зависят от размера системы. На вопрос, почему ИК спек-
троскопия намного менее чувствительна, чем УФ спектроскопия, к размеру системы,
ответить нелегко. По всей видимости, частично это происходит из-за ситуации, ког-
да в большой молекуле многие существенные колебательные переходы локализова-
1.5. Спектральный анализ пептидных структур 55
Рис. 1.20. ИК/РДФИ спектры циклопептида Phe-Ser для всех пяти эксперимен-
тально полученных изомеров. Колебательные частоты рассчитаны мето-
дом ТФП (B3LYP/6-31G(d, p)). Расчетные частоты превосходно совпада-
ют с экспериментальными значениями, что приводит к однозначному
определению( Abo-Riziq и др., 2005) пяти структур, которые приводятся
внизу. (Рисунок взят из Abo-Riziq и др. (2005).)
ны. Можно также утверждать, что УФ лазер взаимодействует только с небольшим
фрагментом молекулы и что (для некоторых систем) в рамках этого взаимодействия
не существует достаточного числа колебательных частот.
Для получения достоверных результатов из комбинированных ИК/УФ исследова-
ний необходимо придерживаться следующих правил:
1. Подход должен быть одинаков и для малых, и для больших систем. Как было уже
описано в данном обзоре, такой метод оказался очень успешным.
2. Необходимо охватывать широкуюспектральнуюобласть ИК спектра путем испо-
льзования лазерных источников наносекундного режима.
3. Если систему невозможно определить с точностьюдо относительно небольшого
числа альтернативных структур, то можно применять спектроскопиювысокого
разрешения (вращательную), которая в настоящее время имеет боќльшие ограниче-
ния на размеры систем, чем ИК/УФ методы.
4. В дополнение ко всем измерениям необходимы тщательные вычисления.
Обычно первоначальный выбор изомера выполняется при помощи вычислений
методом силовых полей и молекулярной динамики. Самые устойчивые конформеры
затем рассчитывают методами ab initio и ТФП, и, если возможно, также на уровне
теории MP2 (см. раздел 1.7). Представляется также логичным учитывать ангармони-
ческие связи, особенно для спектров в середине ИК диапазона с частотами ниже
1000 см–1.